鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)分离纯化的研究

现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００７，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１１　鸡卵黄免疫球蛋白（Ｉ　ｇＹ）分离纯化的研究　任平国，徐启红　（漯河职业技术学院，河南漯河４６２０００）　摘要：对鸡卵黄免疫球蛋白（ＩｇＹ）的分离纯化进行了研究。工艺流程为：卵黄　８倍水稀释并搅拌１０　ｍｉｎ　用Ｈｃｌ调ｐＨ至５．２后在４℃　静置２　ｈ去沉淀　在上清夜中ｈ￣／Ｎ．９５％冰乙醇（．２０℃）使终浓度为６０％（ｖ／ｖ）　４℃搅拌２０ｒａｉｎ后离　￣（２２０００　ｒ／ｍｉｎ，４。Ｃ，２５ｍｉｎ）　收集沉　淀并ｈ￣／Ｎ．０．０２８ｍｏｌ／ＬＮａＣＩ溶液在４℃下过滤除去脂蛋白沉淀　收集的滤液用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ法进行纯化得纯度为９８％的ＩｇＹ。用大肠杆菌　（Ｅ．ｃｏｌｉ）对其活性进行测定，效果良好，此方法能保持免疫球蛋白的活性。　关键词：鸡卵黄免疫球蛋白（１ｇＹ）；乙醇沉淀；分离纯化　中图分类号：ＴＱ９３６，２ｌ；文献标识码：Ａ；文章篇号：ｌ６７３．９０７８（２００７）１１－００２４．０３　Ａｎａｌｙｓｉｓ　０ｎ　ｔｈｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　０ｆ　ｅｇｇ　ｙｏｌｋ（ＩｇＹ）　ＲＥＮ　Ｐｉｎｇ－ｇｕｏ，ＸＵ　Ｑｉ－ｈｏｎｇ　（Ｌｕｏｈｅ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｕｏｈｅ　４６２０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆｌｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｏｆｅｇｇ　ｙｏｌｋ（１ｇＹ）ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆｙｏｌｋ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ（１：８，ｖ／ｖ）ｗａｓ　ｓｔｉｒｒｅｄ　ｆｏｒ　１０　ｍｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｉｔｓ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　ａｄｊｕｓｔｅｄ　ｔｏ　５．２　ｗｉｔｈ　ＨＣＩ．Ａｆｔｅｒ　ｐｌａｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｒｆ　２　ｈ　ａｔ　４℃．ｔｈｅ　ｓｕｐｅｍａｔｎｔａ　ｗａｓ　ｄｉｌｕｔｅｄ　ｗｉｔｈ　９５％ｉｃｅ　ｅｔｈａｎｏｌ（－２０℃）ｕｎｔｉｌ　ｉｔｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｈｅｄ　６０％（ｖ／ｖ）．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｔｉｒｒｅｄ　ｏｒｆ　２０　ｍｉｎ　ａｔ　４℃ａｎｄ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ（２２０００　ｒ／ｍｉｎ）ｆｏｒ　２５　ｍｉｎ　ａｔ　４℃．Ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ　ｗａｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｎｄ　ａｄｄｅｄ　ｉａｎｔｏ　０．０２８　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣＩ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｉＩｆｔｅｒｅｄ　ａｔ　４℃ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｔｈｅ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｄｉｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｌｆｒａｔｅ　ｗａｓ　ｔｔｈｅｎ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ｍｅｔｈｏｄｓ．ｇｉｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｇＹ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｙ　ｏｆ９８　％．Ｉｔｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｆＥｃｏｌｉ）ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｗｅｌｌ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｌｇＹ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｏｆｅｇｇ　ｙｏｌｋ（１ｇＹ）；ｅｔｈｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　鸡卵黄免疫球蛋白（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｏｆ　ｅｇｇ　ｙｏｌｋ，　简称ＩｇＹ），又称鸡卵黄抗体，是母鸡血液中的免疫球　好。　蛋白传递至鸡卵黄并在子鸡孵育过程中和孵育后对予　鸡起保护作用的免疫球蛋白。经大量的研究发现，ＩｇＹ　具有不与人类补体…以及类风湿因子结合　Ｊ等免疫学　特性，现在已被广泛应用于免疫学诊断和医药等许多　方面，因而对ＩｇＹ分离纯化的研究有着重要意义。ＩｇＹ　的分离、纯化丰要包括含有ＩｇＹ的蟹黄水溶性蛋白组　１材料与方法　１．１材料、试剂与仪器　市售新鲜鸡蛋或４℃保鲜鸡蛋若１Ｉ：９５％冰乙醇　（一２０℃，预冷）；０．０２８　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１溶液；ｒｉｆｆｓ—ＨＣ１缓　冲液；Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２００凝胶ｒ深圳市腾龙源实业有限公　司）；ＤＥＡＥ葡萄糖凝胶Ａ一５０（ＩＬ京百星高科技术货物进　出口公司）；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ成套电泳试剂（Ａｍｅｒｓｈａｍ　分（ＷＳＦ）的分离和ＷＳＦ中ＩｇＹ的分离。目前，困际上　已经开发了多种鸡卵黄抗体分离纯化法，主要包括有　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＦ）Ｃｏｒｐｏｒｍｉｏｎ；考马斯亮蓝Ｒ－２５０（Ｉ　Ｌ京索　莱宝科技有限公司）；７２１分光光度汁（上海第　分析仪　器厂）；ＬＧ１０—２．４Ａ高速离心机（ＩＬ京　用离心机厂）；　大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（卫生部中国药品生物制品鉴定所）；　机溶剂抽提、盐析与ＤＥＡＥ色谱相结合、疏水色谱及　凝胶过滤等。然而，这些方法普遍存在着步骤多、批　量小、安全性不岛利回收率低等问题。为此，我们以　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ［３１等人提小的冰乙醇分级离心法为基础，对　冰乙醇分级离心法分离纯化进行了深入的研究，取得　其它试剂均为分析纯。　ｌ－２实验方法　ｌ－２．１　蚩黄水溶性组分（ＷＳＦ）的制备　选择市售新鲜鸡蛋或于４℃保鲜的鸡蛋，用卵黄　了较为理想的结果，　分离纯化得剑的ｌｇＹ活性比较　收稿日期：２００７—０７—１６　２４　维普资讯 http://www.cqvip.com 现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００７，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１１　分离器去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，　刺破卵黄膜，收集卵黄。以体积百分比计，用一定倍　数的蒸馏水稀释卵黄，搅拌１０　ｍｉｎ，使水溶　［￣ＩｇＹ充分　溶出。用ＨＣＩ调节ｐＨ至４．５～５＿４，稀释液在４℃静置２　ｈ，　去沉淀。向上清液中加入９５％冰乙醇（．２０℃）至某～浓　度，４℃搅拌２０　ｍｉｎ后离一￣（２２０００　ｒ／ｍｉｎ，４℃，２５　ｍｉｎ），　收集沉淀并向其中加入０．０２８　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液，４℃　条件下过滤除去脂蛋白沉淀，收集滤液得到澄清的水　溶性蛋白组分（ＷＳＦ）。　１．２．２　乙醇沉淀纯化ＩｇＹ　取制备好的ＷＳＦ，向其加入９５％冰乙醇（．２０℃）　使其终浓度达￣，Ｊ３ｏ％（　），也可将最终浓度调至２５　％（　）　Ｊ，离　￣（２２０００　ｒ／ｍｉｎ，４℃，２５　ｍｉｎ），将沉淀用蒸　馏水溶解，并用ＤＥＡＥ葡萄糖凝胶Ａ．５０离子交换层析，　Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ缓冲液（含０．１５　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１）洗脱，然后用　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２００凝胶过滤。　１．２－３蛋白质回收率的确定及ＩｇＹ纯度的测定　蛋白质回收率可采用福林．酚法进行确定【５Ｊ。　ＩｇＹ的纯度则采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝　胶电泳（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）法进行测定【ｏＪ。　１．２．４　ＩｇＹ的活性检测　以大肠杆菌为试验菌株，进行抑菌实验。将试验　菌株分别接种于含有蛋黄抗体和对照组的液体培养基　中，在３７℃条件下恒温培养，不同时问下从培养物中　取样，置于６００　ｒｉｍ波长Ｆ测定各样品的吸光度（ＯＤ）　佰。　２结果与讨论　２．１稀释倍数的影响【，　由于鸡卵黄中含有大量的磷脂蛋白，因此首先采　用水稀释法去除其中的大部分卵磷脂蛋白。蛋黄巾加　入不同倍数（　：　１：１一ｖ１１：１１的无菌水，用盐酸调节　稀释液ｐＨ至５．２，测定上清液中的脂肪和可溶性蛋白　质含量，其结果如图１。　ｇ　ｇ　面　ｇ　ｇ　、一　、一一　＼　＼　皿　钿　钿　拯　’匿　皿　皿　嘲　稀释度／（　：　黄）　图１稀释倍数对脂肪及蛋白质含量的影响　从图１可看出，随着稀释倍数的增大，蛋白质的含　量也逐渐增加，而脂肪含量则逐渐下降，当稀释倍数　水：％越：８：１时，蛋白质和脂肪含量趋于稳定。考虑到后　续的纯化操作，以选取８倍稀释为宜。　２．２　ｐＨ值的影响　取２０　ｍＬ的８倍稀释度蛋黄液，依次改变其ｐＨ值　（４．５～５．４），并测定相应的ＩｇＹ回收率。ｐＨ的变化对ＩｇＹ　回收率的影响见图２。　鼍　蔷　邑　邑　札　钿　盎　蜓　皿　自卫　嘲　ｐＨ　图２　ｐＨ值对脂肪及蛋白质含量的影响　从图２知，在微酸性条件ＶＩｇＹ的回收率较高，脂　蛋白的回收率在稀释液ｐＨ５．２时最小，说明稀释液的　ｐＨ＝５．２时可获得较好的分离效果。　２．３　乙醇的影响　将８倍稀释度蛋黄液离心后，其上清液以脂蛋白为　主，为此我们采用向其中添加９５％冰乙醇（．２０￣Ｃ）的方　法除去脂蛋白，乙醇体积分数依次取２０％～８０％，其　影响情况如图３所示。　由于乙醇的添加量将影响终产物中的蛋白质含量　及免疫球蛋白活性，经过对比乙醇添加量最终确定乙　醇的体积分数为６０％。　一　窨　面　ｇ　刮噩ｌ】　钿　峰　皿　嘲　乙醇浓度／％　图３乙醇添加量对蛋白质含量的影响　２．４盐浓度的影响　收集加入冰乙醇（体积分数为６０％）经搅拌离心后　得到的沉淀，向其中依次加入０．００５￣０．０３５　ｍｏｌ／Ｌ的　ＮａＣＩ溶液以去除沉淀中杂质蛋白。去除结果如图４所　不。　由图４可以看出，利用ＮａＣｌ来溶解离心得到的沉　淀时，ＮａＣｌ溶液的浓度不同所得产物的产率也不一　２５　维普资讯 http://www.cqvip.com

现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００７，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１１　样。当ＮａＣ１溶液浓度为０．０２８　ｍｏｌ／Ｌ时，蛋白质获取率　一　ｕ／∞ＩＩＩ一＼　Ｅｊ断　由图５可看／￣ＩｇＹ对大肠杆菌（Ｅｃｏｌｉ）在生长初期　有明显的抑制作用，试验组和对照组的ＯＤ值有明显的　差异，而经过２４　ｈＡ抑制作用下降。　３结论　最高，并且杂蛋白的去除情况也较为理想。　２．５　２．０　１．５　１．０　０．５　３．１通过实验确定的冰乙醇分级离心法分离纯化ＩｇＹ　的最佳条件为：卵黄液用蒸馏水以１：８进行稀释，用ＨＣ１　调节ｐＨ为５．２，乙醇添加量为６０％（ｖ／Ｖ），离　￣（２２０００　Ｏ　５　ｌ０　ｌ５　２Ｏ　２５　３Ｏ　３５　ｒ／ａｒｉｎ，４℃，２５　ｒａｉｎ）并用０．０２８　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１溶液过滤。　ＮａＣＩ浓度／（１０　ｍｏｌ／Ｌ）　最终通过提取分离纯化工艺可以得到纯度达９８％的　图４浓度对蛋白质获取量的影响　ＩｇＹ。　２．５　ＩｇＹ纯度的测定　３．２本方法操作较为简便，易于去除杂质，且所得ＩｇＹ　采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳　的纯度很高，适用于大规模生产。　（ＳＤＳ．ＰＡＧＥ）法进行：Ｌａｅｍｍｌｉ体系，４％浓缩胶，ｌ０％　分离胶，恒压１５０　Ｖ，加样量ｌ～１０　ｍｇ，电泳后的凝　参考文献　胶分别采用考马斯亮蓝Ｒ．２５０ｆＨ糖蛋白染色，分析测定　［１］ＨｏｆｆｍａｎＷＬ，ＲｕｇｇｌｅｓＡ０，ＴａｂａｒｙａＤ．Ｊ．Ｉｍｍｔｍｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ，　所得ＩｇＹ的纯度可达９８％。　１９９６，１９８：６７・７７　２．６　ＩｇＹ活性的检测　Ｊ　［２］ＬａｒｓｓｏｎＡ，Ｓｊｏｑｕｉｓｔ　Ｊ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９８，１０８：２０５—２０８　以大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）为试验菌株进行抑菌实验。将　［３］Ｔｏｓｈｉｏ　Ｈｏｒｉｋｏｓｈ　Ｈｉｒａｏｋａ　Ｊ，Ｓａｉｔｏ　Ｍｅｔａ１．Ｊ．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　试验菌株分别接种于含有蛋黄抗体和对照组的液体培　１　９９３，５８（４）：７３９・７４２　养基中，在３７℃条件下恒温培养，不同时间下从培养　［４］　易全茂，谢艳霞．鸡卵黄抗体研究进展［Ｊ］＿动物科技，２００４，２　１・　物中取样，置于６００　ｎｍ波长下测定各样品的吸光度　（２）：４４—４５　ｆＯＤ）值。检测结果如图５。　［５］Ｌｏｒｗｒｙ　Ｏ　Ｈ，Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ　Ｎ，Ｆａｒｒ　Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｅ￣ｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆｏｌｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１　９５　ｌ。１　９３：２６５—２７５　［６］　奥斯伯等．精编分子生物学指南一Ｅ京：科学出版社，１９９９　目　［７］　宋宏新，刘玄，梁艳．鸡卵黄免疫球蛋白的分离制备研究［Ｊ］＿　凸　０　食品科学，２００５，２６（４）：５　１－５４　［８］　康亦兼，咸漠，李文兴．水稀释法分离卵ＩｇＹ［Ｊ］．吉林大学自　然科学学￣．；２００　１；３：８４．８６　时问／ｈ　［９］　曹小红，等．１氐温乙醇除脂法纯化鸡卵黄中免疫球蛋ｎ［Ｊ］．　图５　ｌｇＹ对大肠杆菌（Ｅ　ｃｏｌ，）生长的影响　食品与发酵工业，２００３，２９（３）：６６。７０　（上接第２１页）　参考文献　Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ　Ｍａｔｅｉｒａｌｓ，２００１，４４（４５）：７６３・７６８　［４］　Ｚｈａｏ　Ｄｏｎｇｙｕａｎ，Ｆｅｎｇ　Ｊｉａｎｇｌｉｎ，Ｑｉｓｈｅｎｇ　Ｈｕｏ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｉｂｌｏｃｋ　［１］Ｈａｒｔｍａｎｎ　Ｍ．Ｏｒｄｅｒｅｄ　Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏ—　Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ　ｏｆ　Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ　Ｓｉｌｉｃａ　ｗｉｔｈ　Ｐｅｒｉｏｄｉｃ　５０　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｉｔｙ　Ｍａｔｅｒｉａ１．２００５。１　７：　ｔｏ　３００Ａｎｇｓｔｒｏｍ　Ｐｏｒｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：５４８—５５２　４５７７．４５９３　［５］　袁勤生，赵健．酶与酶工程［Ｍ］．上海：华东理工大学出版社，　［２］　Ｍｉｙａｈａｒａ　Ｍ，Ｖｉｎｕ　Ａ，Ｈｏｓｓａｉｎ，Ｋ．ｚ．，ｅｔ　ａ１　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｓｔｕｄｙ　２００５　ｏｆ　Ｈｅｍｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　ＳＢＡ一１　５　Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ　Ｓｉｌｉｃａ　ｗｉｔｈ　Ｐｏｒｅ　［６】　Ｖｉｎｕ　Ａ．，Ｍｕｍｇｅｓａｎ　Ｖ，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｍ．．Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｌｌｉｎｇ　Ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｔｈｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｆｉｌｍｓ，２００６，４９９：１３・１８　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｏｖｅｒ　Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　Ｓｉｅｖｅｓ　ＭＣＭ一４１　ａｎｄ　［３］　Ｙｉｎ　Ｈ　Ｈ　Ｐ．，Ｗｒｉｇｈｔ　Ｐ．Ａ．Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　ＳＢＡ—ｌ５：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆｐＨ　ｎａｄ　Ａｌｕｍｉｎｕｍ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ．　Ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ　Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｅｖｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ｎａｄ　Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００４，１０８：７３２３—７３３０　２６