大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代

南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01

一、试剂

1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636） 2) DMEM（Invitrogen,11995-065） 3) FBS（Invitroge,10099-141）

4) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 5) 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056） 6) DPBS（HyClone，SH30028.01B） 7) dd H2O 8) 75％酒精

二、器械

1) 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1 2) 100 ml小烧杯 3) 200目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精）

5) 50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790） 6) 25ml培养瓶（Corning，430639）或75ml培养瓶（Corning，430641） 7) 100ml玻璃瓶（蜀牛）

8) 直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 9) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 10) 过滤器（Millex-GP, SLGP033RB） 11) 注射器：50ml、5ml各 1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩

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Day 1

1、消毒

1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。

2、包被培养板

2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。

2.3 以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶：3ml；75ml培养瓶：8ml。过夜。

3、配置培养基、消化酶 3.1 DMEM with 10% FBS FBS：DMEM=1：10

取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。 3.2 0.125％胰酶

取0.25％Trypsin-EDTA,用DPBS稀释2倍。

将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。 4、消毒

操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。

Day 2

1、消毒

打开操作台紫外线灯消毒30分钟。 2、洗板

用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。

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3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上进行）

3.1 将出生24小时之内的新生鼠在100ml烧杯中用75%酒精浸泡5min。 3.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 3.3 取2个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。 3.4 剪去新生鼠的头，将头放入一个培养皿中。

3.5 用眼科剪把新生鼠头骨剪开，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的新生鼠都同样处理）。

3.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。

3.7 将分离好的脑膜用显微剪剪碎脑组织，约1mm3。 4、接种细胞

4.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。

4.2 每支离心管加入3 ml 0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。） 4.3 消化期间整理操作台。

4.4 消化15min后，用移液管除去胰酶，每支离心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM终止消化。 4.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10％ FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。一共这样分次吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。） 4.6 过筛网至60 mm培养皿中。

4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。 4.8 离心：800g/min,5min。

4.9 弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。 4.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) × 104 /ml

4.11 调浓度，接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。 具体细胞接种数值：

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25cm2培养瓶

培养液体积（ml/瓶） 4ml 15ml

细胞密度（个/ml） 1x106 1x106

总细胞数（个/瓶） 4x106 6-8x106

75 cm2培养瓶 5、消毒

实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。 6、换液

细胞种植成功后24小时全量换液，以后每天观察细胞生长状态，每 3天半量换液。注意：换液前要将10%FBS/DMEM放入37℃细胞培养箱中预热半小时。 7、传代

7.1待细胞长到第10天或看到细胞细胞爬满培养瓶的90%左右时，在37℃恒温摇床200g/min震荡12-14小时，全量换液。

7.2震荡过后，弃培养基，DPBS洗涤2-3次，加入适量0.25%胰酶，37℃消化1-3min（以镜下看到细胞突触回缩为最佳）。

7.3加入2ml培养基中和胰酶，用移液管轻轻吹打细胞壁，使贴壁细胞脱落。 7.4将培养基移入15ml离心管中，200g/min离心5min，弃上清。 7.5加入新的培养基，吹打100次，使细胞散开。

7.6将细胞移入培养皿中，孵箱培养10-15min后，将皿中培养液移至新的培养瓶中（不用包被）。

7.7每天观察细胞生长状态，每3天半量换液，待细胞爬满培养瓶的90%左右，可继续传代或消化后将细胞接种在爬片中，进行下一步实验。

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