细菌室操作规程
鹤壁市中医院检验科
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目录
第一篇 细菌室操作程序文件
1. 细菌室人员岗位职责…………………………………………………….。1 2. 标本采集及保存要求………………………………………………………3 3. 显微镜检查法操作规程……………………………………………………5 4. 细菌室标本操作流程………………………………………………………6 5. 细菌的形态检查操作规程…………………………………………………8 6. 细菌生化反应鉴定及其它实验操作规程………………………………11 7. 细菌的接种与培养方法操作规程………………………………………17 8. 支原体培养、鉴定及药敏操作规程……………………………19 9. 血液感染病原体检验操作规程…………………………………………20 10. 中枢神经系统感染病原体检验操作规程………………………………22 11. 下呼吸道感染病原体检验操作规程……………………………………24 12. 尿路感染病原体检验操作规程…………………………………………26 13. 消化道感染病原体检验操作规程………………………………………29 14. 脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程………………………………31 15. 生殖系统标本的处理……………………………………………………33 16. 抗菌药物敏感试验………………………………………………………34
第二篇 医院微生物感染控制检测
17. 消毒灭菌效果监测……………………………………………………….37 18. 环境卫生学监测…………………………………………………………。38
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19. 采样及检查原则……………………。…………。……………………….。39 20. 各部位的消毒…………………………………………………………….43
细菌室人员岗位职责
1、上班后先搞好室内卫生、核查各个培养箱、冰箱的工作温度是否在设定的范围内，并做好记录。检查各种仪器工作是否正常，做好记录。
2、接收样本：核对各样本号与申请单联号是否一致，如不一致马上与病房联系以便作出相应的处理，如退单或重送样本等，并做好联系情况的记录。核查各送检样本是否符合要求。
① 痰液样本：先看外观、再直接涂片镜检,以白细胞≥25个/低倍镜视野,而上皮细胞≤10个/低倍镜视野，为合格痰液。
② 无菌体液样本:检查各种无菌体液样本的盛放器皿是否符合要求。
③ 容易干燥的样本：对一些容易干燥的样本如大便、咽拭子、脓液拭子、泌尿生殖道拭子等是否已经干燥.
对不符合要求的样本必需与临床联系，以便作出相应处理,方法如联号不符的样本,做好记录.对符合的样本进行原始单的登记.
3、样本编号:对符合的样本作出编号,普通细菌培养：痰液、咽拭子、血液增菌培养、尿液、胸、腹水、脑脊液、胆汁、脓液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培养。在各种培养基上及申请单上编号的同时均需明确标明接种日期。
4、样本接种：
① 血液、骨髓、腹水、关节液等：增菌培养瓶; ② 痰液、咽拭子：血平板、麦康凯平板； ③ 尿液:血平板、麦康凯平板；
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④ 大便致病菌：SS平板；
⑤ 脑脊液：血平板、巧克力平板；
⑥ 分泌物的淋球菌培养接种：淋球菌专用平板； ⑦ 支原体培养+药敏：按说明书接种支原体专用培养基。
对以上接种样本的当前编号应记录于登记本上。此外对痰、脓液、脑脊液等在接种的同时应对其沉渣进行革兰染色,如有细菌和或何种细菌为主立刻通知临床，并做好记录。
5、查对昨天移种平板申请单及原始登记本，确定标本移种是否正确。观察血液增菌培养瓶,如发现有细菌生长，马上涂片革兰染色,将细菌的染色特性及形态报告给临床，并做好记录，同时进行移种。
6、观察平板，挑取可疑菌落涂片革兰染色，并做好细菌的鉴定与药敏实验工作. 7、检查各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作. 8、定期做好本室所用鉴定和药敏试条的质控，做好记录。
9、每天必须消毒平板、基础培养基等用于常规医院感染监测,另外根据具体情况即时准备好各种中和剂、无菌瓶等，对48小时的空气培养出报告，同时注意是否有致病菌、菌落数是否超标.
10、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。
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标本采集及保存要求
1、总则：用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。
2、临床标本的采集
2.1、下呼吸道分泌物（痰液）
令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。
2.2、尿液(中段尿)
护理人员协助采取中段尿约3ml入无菌塑料盒中,及时送检。 2。3、粪便
取有粘液、脓血部分的粪便置无菌塑料盒中及时送检。 2。4、眼、耳、鼻、喉拭子
将棉拭子沾取少许无菌生理盐水(如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌塑料盒中，及时送检。
2.5、脓液
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用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌塑料盒中,及时送检。
2.6、血液
2。6。1、凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素,应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也可。
2。6.2、成人每次采血5~10m1，小儿采血3~5ml。
2.6。3、严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀。
2。6.4、从抽血到接种入瓶,动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。 2.7、穿刺液
胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液，严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中,轻轻颠倒试管10余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的,或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。
2.8、胆汁
由专科医生以无菌方法取引流液10m1注入无菌塑料盒内。 2。9、脑脊液
以无菌方法取脑脊液3～5ml，置无菌试管内,常温保存送检，如只做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检.
2。10、生殖器官标本
阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌塑料盒内送检。
如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时,采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。 2。11、烧伤标本
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以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌塑料盒中。 2。12、支原体（解脲、人型）培养+药敏的标本采集
2。12。1、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。 2.12.2、男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内2~2。5cm。 3、临床标本的保存
细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。
显微镜检查法操作规程
显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段,有助于细菌的初步鉴别,同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种.
1、不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。
1。1、压滴法:用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央,覆上盖玻片，于高倍镜下观察.制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢.
1.2、悬滴法：取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块,将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转
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玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处,无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变.螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。
2、染色标本检查法：通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构,有助于细菌的初步鉴定.
2。1、快速革兰染色法 2.1.1、操作见试剂说明书
2.1。2、结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
2。1。3、注意事项：染色关健在于涂片和脱色,涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为18～24小时为佳。
2。2、抗酸染色法
2。2.1、操作见试剂说明书 2.2.2、结果：抗酸杆菌呈红色。
2。2。3、注意事项:每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色,以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆,至无红色液体流下.
3、墨汁负染镜检：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等.
菌室标本操作流程
1、标本的接受
1.1、标本接受的时间：原则上全天任何时间均可。
1。2、标本的接受：接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求是否相符以及标本的质量等。
1.3、把接受的标本编号。
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2、临床标本的接种
2.1、检验目的是细菌培养+药敏试验.各临床标本的培养基选择如下： 2.1。1 培养基的选择
标本类型 血 中段尿 脑脊液 穿刺液 胆汁 呼吸道标本 粪便标本 病灶分泌物
培养基 血培养瓶
血平板、麦康凯平板 血平板、巧克力平板 血平板、麦康凯平板 血平板、麦康凯平板 血平板、麦康凯平板 SS平板
血平板、麦康凯平板
2.1.2、生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板，操作如下：淋球菌培养接种淋球菌平板；念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按《支原体培养的操作规程》操作；作普通细菌培养，则接种血平板和巧克力平板;衣原体抗原检测的按《衣原体抗原检测的操作规程》进行检验.
2。2、接种的方法：标本做分区划线。
2。3、检验目的为找抗酸杆菌的按《找抗酸杆菌的操作规程》进行检验。 3、所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期,然后根据要求进行培养。
4、标本的培养条件、温度、时间 平板
培养条件、温度、时间
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血平板 巧克力平板 淋球菌平板 沙保罗平板 其他的平板
孵箱、35—37℃、18-24小时 孵箱、35—37℃、18-24小时 孵箱、35-37℃、18—24小时 孵箱、28-31℃、24—36小时 孵箱、35—37℃、18-24小时
5、根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态和染色性质,按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。
6、结果的报告
确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印.
7、对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求进行无害化处理。
细菌的形态检查操作规程
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1、不染色标本的检查
压滴法和悬滴法。主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。将特制好的标本置于显微镜载物台中央,先以低倍镜观察,再用高倍镜观察。
结果：有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动(有明显的方向性）；无鞭毛的细菌呈布朗运动(只在原地颤动而无位置的改变)。
2、细菌染色标本的检查
染色的第一步是制作涂片。菌落涂片时，先取生理盐水l滴,置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高,以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色.
2.1、革兰染色
本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色）和革兰阴性(红色）两类.
2.1.1、试剂 （1） 结晶紫溶液
A液： 结晶紫 2g 95%乙醇 20ml B液： 草酸铵 0。8g 蒸馏水 80ml
需在用前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。 （2） 碘液
碘 lg 碘化钾 2g
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蒸馏水 300ml
碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片,待完全溶解后，加水至300ml。 (3) 脱色液：95%乙醇。 (4） 复染液
A． 贮存液：沙黄 2.5g 95%乙醇 100ml B． 应用液： A液 10ml 蒸馏水 90ml 染色方法:
(1)．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1 min，清水冲去染液。 (2）．加碘液染1 min，水洗.
（3)．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗. （4）．加复染液，染30s，水洗。 (5）．干后镜检。 2。2、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰标本时,可以适当增加标本涂片的厚度,以提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染色时间.如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意.
试 剂
(1）、石炭酸复红溶液
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碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5％石炭酸溶液 90ml (2)、脱色剂
浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml （3）、复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10％氢氧化钾 0。1m1 蒸馏水 100ml 染色方法
（1）、涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾，持续约5 min（若染色奴卡菌需要加长时间），水洗。
（2)、加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗。 (3)、加复染液，染0.5～l min，水洗。
（4)、干后镜检.分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。
注：奴卡菌、放线菌标本染色时,脱色剂改用2％硫酸水溶液。 2.3、墨汁荚膜染色
用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。
传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售.常规工作可以用墨汁或墨水代替,但应注意颗粒不能太粗,否则影响观察结果。有人用5％黑色素水溶液做染料，效果较好。
试 剂
印度墨汁或5％黑色素水溶液。 染色方法
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将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后,转换高倍镜确认。
细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程
1、氧化-发酵试验(O-F试验）
原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的,称为氧化型.可以进行无氧降解的，称为发酵型（发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖）。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
方法：将待检细菌同时穿刺接种两支Hugh-Leifson培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡（或其它矿物油）,高度不少于lcm。35℃，24小时或更长。
结果:培养基变黄表示细菌分解葡萄糖产酸,两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。
应用:主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别,前者均为发酵型,而后者均为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。
2、β-半乳糖苷酶(ONPG）试验
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原理：细菌产生半乳糖苷酶，分解邻—硝基酚β-D-半乳糖苷（无色）生成邻—硝基酚（黄色)。
结果:菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20—30分钟内显色. 应用:主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。 3、七叶苷水解试验
原理:有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素,七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。
结果：培养基变黑为阳性,不变色为阴性。
应用:主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别。前者为阳性,后者为阴性。也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。
4．甲基红试验
原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基pH值降至4.5以下,加入甲基红呈现红色为阳性。若细菌分解葡萄糖产生的酸少，或产生的酸进一步转化为其他产物，则培养基pH值仍在6.2以上，加入甲基红呈现黄色为阴性。
结果：呈现红色为阳性,橘红色为弱阳性。黄色为阴性。
应用:主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。此外肠杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
5、VP试验
原理:某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境中，氧化为二乙酰，与精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。
结果:在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。 应用:本试验与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性.
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6、吲哚（靛基质)试验
原理:细菌分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚（靛基质），加入对位二甲基苯甲醛生成红色玫瑰吲哚。
结果:于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性. 应用：主要用于肠杆菌科的鉴定。 6、尿素分解试验
原理:具有尿素酶（尿酶)的细菌,分解尿素产生大量的氨，培养基变碱。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变色为阴性。
应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定，奇异变形杆菌、普通变形杆菌为阳性，克雷伯菌属、枸椽酸菌属、雷氏普罗威登菌和摩根摩根菌为阳性。
7、苯丙氨酸脱氨酶试验
原理:某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入FeCl3生成绿色化合物。
结果：出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长会引起退色。
应用:主要用于肠杆菌科的鉴定,变形杆菌属、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性.肠杆菌科其它菌均为阴性.
8、氨基酸脱羧酶试验
原理:具有氨基酸脱羧酶的细菌，分解氨基酸脱羧生成胺和CO2使培养基变碱,指示剂改变颜色。
结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫）为阳性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 9、氧化酶试验
原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶.具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C
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氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二氨氧化.生成有色醌类化合物。
结果:细菌在与试剂接触10秒内呈紫色为阳性.为保证结果准确性,应作阴、阳性对照。 应用：主要用于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别,前者为阴性。后者为阳性。 10、过氧化氢酶试验(触酶试验）
原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试剂：3％过氧化氢溶液
方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养基中，立即观察结果。
结果:有大量气泡产生为阳性。不产生气泡为阴性。
应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均阳性。而链球菌均阴性。 1l、硝酸盐还原试验
原理:包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚哨酸盐和氨。再由氨转化为氨基酸和细菌内其它含氮化合物。二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的受氢体，能使硝酸盐还原的细菌从哨酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其它还原性产物。
结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色变化反应，可能是①硝酸盐没有被还原,试验阴性。②硝酸盐被还原为氨和氮等其它产物而导致假阴性，这时应加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表明为试验为假阴性。
应用：本试验在细菌鉴定中应用广泛。 12、氧化酶（改良法）试验 试剂：
四甲基对苯二胺(TMPD) 6。0g 二甲基亚砜(DMSO) 100.oml
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溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。
方法:被检菌株移种于7%羊血琼脂上，30℃需氧条件下孵育15～18h,刮取菌落涂布于无色滤纸片上，加l滴上述试剂，阳性者在2min内呈深蓝色。
若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上,至少孵育3天以上，才可检测,阳性反应5~10min出现。
13、CAMP试验
原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞活性，因此在两菌的交界处溶血力增加。出现矢形(半月形)的溶血区。
结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性 应用：在链球菌中,只有B群链球菌CAMP试验阳性。 14、O/129抑菌试验
原理：O/129（二氨基喋啶)对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用,而对气单胞菌无抑制作用.
方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取O/129纸片（含药40ug)贴于平板上,35℃，18～24h,观察结果.
结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药
应用：弧菌属、邻单胞菌属对O／129敏感,而气单胞菌属耐药 15、杆菌肽试验
原理:A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其它链球菌绝大多数对其耐药. 16、奥普托欣试验
原理：几乎所有的肺炎链球菌对Optochin敏感，而Optochin对其它链球菌则无抑制作用 17、．H2S试验
原理：有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱胺酸、半胱胺酸)产生硫化氢,硫化氢
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遇到铅或亚铁离子，则生成黑色的硫化铅或硫化铁。
结果：培养基变黑为阳性,不变为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科属或种的鉴定。 18、触酶试验(过氧化氢酶试验）
试剂:3%H202溶液,置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。
方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢溶液1～2滴。静置之,lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。
19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验
葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。
19。1凝聚因子试验：取1滴蒸馏水于洁净的玻片上,用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合,10s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。如超过10s可出现假阳性，有10％~15％金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。
操作过程中的注意点： （1)10s内观察结果。
(2）必须制备浓厚的均匀菌悬液。 (3)用EDTA抗凝的兔血浆为最好。
（4）加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。 （5)生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。
19.2葡萄球菌凝固酶试验:用生理盐水将血浆4倍稀释，取0。5ml。然后挑取3～5个菌落于稀释血浆中，成浓菌悬液。置37℃水浴，3～4h后读取结果，凝固者为阳性。若阴性，继续观察到24h,不凝固者为阴性。试验应同时作阳性、阴性对照.
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试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性.中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育，才可出现阳性。凝固酶试验应考虑下述情况：
①某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。 ②所用血浆缺乏纤维蛋白原。 ③试验菌株不纯。
结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固为阳性.
应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。 20、新生霉素耐药试验
方法：挑取待检菌菌落数个，制成相当0。5号麦氏管(McFarland）浓度菌液，棉拭子浸透，挤去多余液，均匀涂在M—H平板上，贴上含5ug／片的新生霉素纸片，35℃孵育16～20h，抑菌环直径≤16为阳性(耐药）。试验时应以金黄色葡萄球菌ATCC25923做阴性（敏感）对照，以确认纸片是否有效。
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细菌的接种与培养方法操作规程
一、细菌的接种
根据待检标本的来源、培养目的及所用培养基的性状，采用不同的接种方法。 l、平板画线分离法
（1)、连续画线分离法此法主要用于杂菌不多的标本.用接种环取标本少许，于平板l/5处密集涂布，然后回来作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离,划满平板为止。
(2）、分区画线分离法此法适用于杂菌较多的标本。先将标本均匀涂布于平板边缘一小区 (约占平板1/5）,再在二、三区依次连续画线，每画线一区均将接种针灭菌一次.每一区的划线均接触上一区的接种线1～2次。以获得单个菌落.
2、斜面接种法
该法主要用于单个菌落的纯培养。用灭菌接种针取菌少许，从培养基斜面底部向上划一直线，然后从底部向上作连续曲线画线.一直画到斜面顶端。
3、液体接种法
多用于一些液体生化试验管的接种.用灭菌接种环取菌少许，在试管内壁与液面交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于液体中。
4、穿刺接种法
主要用于半固体培养基、明胶及双糖铁的接种。用接种针取菌少许，从半固体培养基中央,平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针原路退出.
5、倾注平板法
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临床上主要用于尿液等标本的细菌计数。将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，倾入已经溶化并冷却至45℃左右的定量培养基,混匀，待凝固后倒置、培养。
6、涂布接种法
常用于纸片药物敏感性测定，也可用于被检标本的细菌计数.加定量的被检菌液于琼脂平板表面，然后用灭菌的棉签反复涂布几次，使被检菌均匀分布在琼脂平板表面。然后贴上药敏纸片培养，或直接培养观察结果.
二、细菌培养方法
根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同的环境进行培养.常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。
1、需氧培养法
本法是临床细菌室常用的培养方法，即将已经接种好的平板、斜面和液体培养基等。置于35℃温箱中孵育18～24小时.
2、二氧化碳培养法
本室用CO2孵箱将已接种好的培养基置于CO2孵箱内培养. 三、分离及纯化法
3.1、分离是指从原材料或多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地分离开，以得到纯的单一菌株，技术步骤如下：
作纯培养分离时，一般只用一只完整的琼脂平板。涂划多采用分区划线法，在一只平板中可划3~5个区.划法有两种:
3.1.1、从临床标本分离细菌所含菌数相对较少时，可用接种环取标本涂布在平板一角边缘，然后从此区开始划线至1／3平板，为第一区，再在2、3区依次划线,每划完一个区域均将接种环灭菌一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次，使菌量逐渐减少以获得单个菌落。
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3。1.2、快速划线分离法：采用快速划线使一接种环标本能分离出单个菌落，这与标本的菌量及操作者的技能有很大关系。
3.2、纯化是指欲获得大量纯培养物的方法，所用平板大小可根据需要的菌量而定。方法是将一单个菌落或将相同的菌落作大量密集涂划于平板上而获得大量纯的培养物。
支原体培养、鉴定及药敏操作规程
1．原理及依据标准：
支原体分离鉴定培养基用于泌尿生殖道支原体(解脲支原体Uu和人型支原体Mh）的检测与诊断。当有Uu和Mh生长，分解尿素和精氨酸引起PH上升,使以酚红为指示剂的培养基由黄转红。依据珠海迪尔生物工程有限公司生产的试剂盒说明书。
2．标本的采集：
2。1、男性：用特别细的无菌棉拭子沾取无菌生理盐水少许深入尿道口内2~2.5cm处取分泌物,前列腺液亦可用沾取无菌生理盐水的无菌棉拭子尽量多的沾取。
2。2、女性：用沾取少许无菌生理盐水的棉拭子取宫颈内口1～2cm处单层柱状上皮细胞，取样拭子不可碰阴道壁.
2.3、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应立即送检。整个采样过程应注意无菌操作。 3、标本接种：（本实验应注意无菌操作,避免污染杂菌) 3。1、取出培养基，放置接近室温，并在瓶盖上编号。
3。2、将采集的标本拭子插入培养瓶中，在靠近液面上方的瓶壁挤示压旋转拭子数次，使
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拭子中标本渗入到肉汤中：若为液体标本，取200 u 1加入培养基中；若为中段尿，经3000转／分离心15分钟取沉渣100ul加入培养基中。
3.3、盖上瓶盖，置35~37℃孵箱，在24～48小时分别观察结果。 4、结果判读：
培养基变红，判断阳性，培养基黄色并清亮，判断阴性。 5、已检标本处理：密闭容器高压灭菌后,按医用垃圾处理。
血液感染病原体检验操作规程
1、标本采集
(1)、采集时间和次数血标本一般应在病人发热初期或根据不同的发热情况在未用抗生素前采集做细菌培养，提高阳性率需连续三次采血进行培养.
(2）、采血部位及抽血量一般抽取肘静脉血.采血量为成人5~10ml，儿童为3～5ml。 （3)、结果观察:培养72小时后若肉眼或自动血液培养仪报告仍未细菌生长，则盲目移种一次,仍未细菌生长，向临床发出一级初级报告：“血液经72小时培养无细菌生长\"，为避免漏诊，应在培养5天、7天时再作盲目移种培养。疑为亚急性细菌性心内膜炎、真菌血症等时,血培养至少连续培养2～3周，仍无细菌生长方可报告为阴性。
2、检验程序 有细菌生长
22 血液标本（无菌采集） 72h盲目移种 （初级报告） 涂片、染色、镜检 需氧培养、CO2培养 直接药敏试验 (完整版)微生物室sop文件
3、血培养瓶中不同表现为不同细菌生长:
浑浊并有凝无块
均匀浑浊,发酵葡萄糖产气 微浑浊，有绿色变化
表面有菌膜,培养基清晰，底层溶血 表面有菌膜，膜下有绿色浑浊
血细胞层上面有颗粒状生长，自上而下的溶血 4、血液及骨髓标本中常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 表皮葡萄球菌 变形杆菌 溶血性链球菌 产气肠杆菌
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金黄色葡萄球菌 多为革兰阴性菌 肺炎链球菌 枯草杆菌 铜绿假单胞菌 溶血性链球菌
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粪肠球菌 肺炎克雷伯氏菌
铜绿假单胞菌 粪产硷杆菌 沙雷氏菌 流感嗜血杆菌 布鲁氏菌
5、报告结果
血培养阳性均作为危急值报告，所以血培养的结果应及时通知临床医生，每日开始工作可以首先检查血培养，如有细菌生长，立即处理。
5。1、疑有细菌生长者,经涂片、革兰氏染色、镜检后，电话通知主治医生，报告“疑有革兰氏××菌生长”。并做药敏试验，报告初步结果。
5。2、经分纯培养完成鉴定及药敏试验，发出报告。 5。3、培养7天仍为阴性的标本，报告无细菌生长。
临床上诊断为亚急性细菌性心内膜炎者，可持续培养至两周再发阴性报告。
中枢神经系统感染病原体检验操作规程
l、标本采集 以无菌方法采集脑脊液2~5ml,盛于无菌瓶中送检.
2、直接检查 脑脊液可直接涂片、革兰染色或抗酸染色等，然后镜检。无色透明的脑脊液，应作离心取沉淀物涂片、染色镜检。
3、检验步骤：
3。1、一般细菌涂片检查除结核性脑膜炎外，由其它细菌引起的化脓性脑膜炎，脑脊液明
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显混浊，可直接涂片，革兰染色镜检。无色透明的脑脊液，应离心后涂片、染色、镜检，根据染色及形态特征可初步提示细菌的种类。结核分枝杆菌涂片检查：取脑脊液的离心沉淀物（3000r／min。30min）作抗酸染色。新型隐球菌涂片检查:取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色。
3.2、分离培养用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物,分别接种于血平板、巧克力平板，巧克力平板应置于CO2环境中35℃培养18～24小时。脑脊液也可直接注入血培养瓶。
4、检验程序 不染色标本 动力试验 墨汁染色 革兰染色 抗酸染色 一般细菌 脑膜炎奈瑟菌 新生隐球菌等 染色标本 直接涂片（取离心沉淀） 分离培养 脑脊液 血平板、巧克力平板 （5%CO2环境） 沙氏培养基、血平板
一般细菌 脑膜炎奈瑟菌 结核分枝杆菌 生化鉴定、血清学鉴定 药敏试验 初步报告 报告 5、脑脊液培养常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 A、B群链球菌 卡他布兰汉菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 结核分支杆菌 肠杆菌科菌种
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产单核李斯特菌 脑膜败血性黄杆菌 新型隐球菌 假单胞菌 白色念珠菌
6、报告结果
无论是涂片还是培养，一但见到阳性菌应立即通知临床医师.培养并经鉴定的结果报告“××菌\"，同时报告药敏试验结果。
下呼吸道感染病原体检验操作规程
1、标本的采集
有自然咳痰法、咽拭子采集法、支气管镜下采集法及分泌物标本.
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2、标本的直接检查
(1)、将痰标本涂片后待干，固定、染色，或直接湿片镜检,对病原学早期、初步诊断有重要意义。并向临床发出初级报告.
(2)、一般认为合格的痰标本为：以白细胞≥25个/低倍镜视野，而上皮细胞≤10个/低倍镜视野。采集合格标本对细菌的诊断尤为重要。
3、分离培养与鉴定
（1)、一般要求下呼吸道感染培养的细菌浓度应>107CFU/ml，可视为病原菌,<104CFU/ml可视为污染菌。若介于两者之间105～106CFU／ml时,要连续分离培养两次以上仍为105～106CFU／ml时,亦认为是病原菌。
（2)、检验程序
痰液及下呼吸道分泌物 涂片、染色、镜检 分离培养 血平板、麦康凯平板 初步报告 菌落观察 涂片、染色、镜检 纯培养细菌 鉴定试验、药敏试验 报告 27
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4、下呼吸道标本培养常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟氏菌 化脓性链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 肠杆菌科细菌 结核分支杆菌 非发酵菌 白喉棒状杆菌 嗜肺军团菌 假丝酵母菌
5、报告结果
痰中的病原菌不少属于机会致病菌，与正常菌群同时存在,报告时应作说明，未检出致病菌时，应报告“无致病细菌生长”。
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尿路感染病原体检验操作规程
1、尿液培养常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 肠球菌 大肠埃希菌 A群链球菌 变形杆菌 腐生葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 表皮葡萄球菌 产气肠杆菌 结核分支杆菌 沙门菌种 铜绿假单胞菌 沙雷菌
2、标本收集
2.1、尿液标本的采集可采用多种方法：有中段尿采集法、膀胱穿刺法、肾盂尿采集法，而常规是取中段尿作细菌培养。
2。2、取中段尿作培养时先要进行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染标本。 2.3、如采用其他方法收集标本,必须由临床医生根据临床诊断需要而执行收集术，并在检验单上写明。
3、检验步骤 3。1、涂片检查
3.1.1、一般细菌及淋病奈瑟菌涂片：以无菌操作吸取尿液10ml，3000r/min离心15min，去上清液,取沉淀涂片，革兰氏染色镜检,作初步报告.如查见革兰氏阴性双球菌,呈肾形位于细
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胞内或细胞外,报告“找到革兰阴性双球菌,存在于细胞内外，形似淋病奈瑟菌”。如未查见上述细菌可报告“未发现革兰阴性双球菌”。
3.1.2、念珠菌涂片：取尿液沉淀物放于清洁玻片上,覆以盖玻片，制成涂片，用高倍镜检查。革兰染色后，如发现发亮的芽生孢子和假菌丝，就可报告“霉菌孢子及菌丝”。
3。1.3、结核分枝杆菌：取尿液10ml,4000r/min离心30min，取沉淀物涂片，抗酸染色，镜检。如找到红色杆菌，可报告“查到抗酸杆菌”。
3.2、一般细菌培养（细菌计数):用定量接种环取尿液10 u l接种血平板,35℃培养18～24小时，观察有无细菌生长,并计数菌落数,乘以1000,求出每毫升尿液的菌落数。根据菌落特征、涂片染色结果，进行鉴定和药敏试验，如培养48小时无菌生长，即报告“无细菌生长\"。
3.3、特殊菌培养：淋病奈瑟菌培养，选用专用巧克力琼脂平板，接种后放入二氧化碳环境中培养.
4、检验程序
离心、沉淀涂片染色
涂片染色镜检 鉴定、药敏试验 初步报告 （革兰及抗酸染色） 血平板、麦康凯平板 专用巧克力培养基 （5%～10%CO2，35℃,18～24h） 分离培养 淋病奈瑟菌培养 尿标本 报告 5、结果报告:
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5.1、尿液细菌培养检查必须报告细菌的种属、菌落计数（cfu/m1）及药敏结果。 5.2、革兰氏阴性菌落计数大于10cfu/ml，革兰氏阳性菌计数大于10cfu/ml，真菌大于10cfu/ml有诊断意义。
5.3、一般常规结核培养要8周方能报告。阳性结果可提前报告。但不做菌落计数只报告“抗酸杆菌生长\"的报告，如做了进一步的分型和鉴定，才能报告“有××型结核杆菌生长”。
5.4、用专用培养基培养淋球菌经鉴定可直接报告“有淋球菌生长”但不做菌落计数，如涂片发现细胞内或外有革兰氏阴性双球菌可报告“发现革兰阴性双球菌\"。
5.5、如尿液培养同时有三种或以上细菌生长时，可视为污染标本,建议重留送检。
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消化道感染病原体检验操作规程
1、粪便标本中常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 结核分支杆菌 志贺菌属 难辨梭菌 致病大肠埃希菌
白色念珠菌 (ETEC、EPEC、EIEC、EHEC) 弧菌属菌种
气单胞、邻单胞菌种 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌
2、标本采集
2.1、自然排便采集法：自然排便后，挑取脓血、粘膜部分的粪便2～3g,液体粪便取絮状物置于大便培养管或增菌液中送检。
2.2、直肠肛管法：用大便培养用的肛管直接插入肛门成人4~5cm，幼儿2～3cm，轻轻在直肠内旋转数次，目的是使直肠表面粘液能通过肛管孔进入肛管内.然后拔出放入大便培养管中送检.
3、检验步骤
3。1、涂片检查粪便标本因各种正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌,只有怀疑
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霍乱弧菌及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查。
3.2、各项的涂片检验均按染色方法进行，但大便检查霍乱弧菌的处理程序：
3.2.1、染色检查：将米泔样的标本涂2张片用乙醇固定后染色,观察弧菌有无呈鱼群状排列。
3。2。2悬滴检查：取患者粪便制成悬滴涂片，霍乱弧菌古典型和EL—Tor型均呈现极活泼的穿梭状运动。
3。2。3制动检验:运动活泼的弧菌涂片加人霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
3。3、大便标本的培养目的是培养致病菌或追踪病人有否菌群失调现象,无特殊要求作一般致病菌培养的标本接种麦康凯、SS平板各一个。
3.4、菌群失调的细菌学检验：选用多种培养基包括SS、麦康凯、血平板、高盐甘露醇盐琼脂平板、Campy—BA血琼脂平板和沙氏琼脂等，目的是使更多的菌群得到生长，以利于检查肠道的细菌情况.
3。5、霍乱弧菌的培养：直接取患者米泔样粪便0。5ml，接种于碱性蛋白胨水增菌液和4号平板,35℃培养6~8h，再转种一只4号平板.35 ℃培养18~24h后形成较大、菌落中间为灰黑色、有光泽、隆起、湿润的菌落,如泼水状。挑取可疑菌落5～10个与霍乱多价“O”血清作凝集试验。
诊断血清作玻片凝集试验，如为阳性，则立即报告，并将可疑菌送疾病控制中心确认。 3。6、真菌培养：真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后,常见的真菌腹泻多由白色假丝酵母菌引起.将标本接种于沙氏平板及血平板上，置27℃和35℃培养18~24h，根据形态染色、菌落特征，做真菌鉴定和药敏试验。
4、检验程序
增菌培养
便或肛拭子 分离培养 涂片检查 33 沙门氏菌、志贺氏菌 霍乱弧菌 革兰氏染色 观察动力 (完整版)微生物室sop文件
5、结果报告
粪便培养的报告方式应以分离目的菌种的结果而定，如：目前常规以SS培养基分离粪便中的致病菌，阳性者应报告“检出沙门菌或检出志贺菌\"，阴性者报告“未检出沙门菌或未检出志贺菌”。其他培养结果报告方式与上述原则相同。
脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程
1、脓汁及病灶分泌物培养常见病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 葡萄球菌 肠杆菌科细菌 链球菌 假单胞菌 炭疽芽孢杆菌 拟杆菌
破伤风芽孢杆菌 腐败谢瓦纳拉菌 产气荚膜梭菌 嗜血杆菌 结核分枝杆菌 产碱杆菌 放线菌、奴卡菌 弧菌属细菌
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念珠菌 气单胞菌
2、标本采集:标本由临床医师行无菌操作术采集,但应注意以下几点:
2。l、闭锁性脓肿疑为厌氧菌感染时，取材后立即将空气排空,同时针尖插入橡皮塞内防止空气进入，连同注射器一并送检。
2.2、开放脓肿、脓性分泌物可在患部直接用棉拭或纱布擦抹，如为瘘管亦可在无菌操作下取组织碎片分散在无菌盐水中。
2.3、烧伤创面的分泌物，用灭菌棉拭取多部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管中送检。 2.4、取尿道分泌物必须先清洗、消毒尿道后用挤压法使分泌物从尿道溢出，用无菌生理盐水浸湿拭子直接采集标本。如女性做宫颈分泌物细菌培养，应尽量避免杂菌污染。
2.5、组织脏器碎片的收集，先要消毒表面的污染菌,后用无菌刀切开，取内容物及碎片分散于无菌生理盐水中，然后增菌、接种，如活体微量标本可直接放人肉汤增菌培养基中增菌。
3、检验步骤
3.1、涂片检查：脓汁及分泌物标本均应做涂片检查。涂片做革兰氏染色镜检,根据形态和染色特点，可报告“找到革兰氏×性菌,形似××菌”或报告“未发现细菌”.涂片检查包括涂片找细菌、淋球菌、酵母菌等。
3。2、培养
普通细菌培养：标本接种血平板、麦康凯平板各一只，35℃培养18～24小时，根据菌落特性和形态染色,进行鉴定和药敏试验，如培养48小时无菌生长,即报告“无细菌生长\"。
4、报告结果
4.1、涂片报告“找到革兰氏×性菌”，淋球菌要报告在白细胞内外是否发现革兰氏阴性双球菌。
4.2、对正常无菌部位的感染，从脓汁或分泌物分离到细菌,均有临床意义，按分离鉴定结果报告细菌名称及药敏试验.
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5、操作流程
初步报告 脓汁、创伤分泌物 涂片染色 （革兰氏染色、抗酸染色等） 需氧培养 血平板 巧克力平板 麦康凯平板 观察菌落 涂片镜检 鉴定、药敏试验 报告
生殖系统标本的处理
1、生殖系统标本培养的主要病原菌
革兰阳性菌 革兰阴性菌 葡萄球菌 淋病奈瑟菌 肠球菌 大肠埃希菌 化脓性链球菌 拟杆菌 厌氧链球菌 铜绿假单胞菌
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结核分枝杆菌 变形杆菌
2、标本收集：阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由临床医师采集，收集于无菌试管内送检. 3、涂片检查
3。1、一般细菌、淋病奈瑟菌和杜克雷嗜血杆菌:革兰染色镜检作初步报告. 3.2、结核杆菌：抗酸染色镜检后作初步报告。
4、检验过程：用棉拭子划完第一区后，用接种环继续分区划线，35℃普通培养箱孵育18～24小时,如有要求培养淋球菌和真菌则加种专用培养基。
5、检验流程
鉴定、药敏试验 报告 革兰氏染色 抗酸染色 血平板 巧克力平板（CO2环境） 麦康凯平板35℃孵育 厌氧血平板、巧克力平板 35℃、48小时 涂片 需氧培养 厌氧培养 生殖系统标本 6、结果报告：报告细菌鉴定及药敏试验结果。
抗菌药物敏感试验
若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小，来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性,结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的.WHO推荐琼脂扩散法敏感试验（改良Kirby—Bauer法)，简称K-B法，其目的在于技术的简单和可
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重复性.本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内,均可按同一解释标准报告结果。但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验,对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
1、试验用材料 1.1、培养基
Kirby-Bauer法指定用Mueller—Hinton琼脂。多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2。5mg/ml辅酶I后应校正pH 7。2～7。4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。在水平的实验台上倾制。琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。琼脂凝固后，应测一下pH是否正确.琼脂于板应放4℃保存,在7日内用完.
1.2、药物纸片
抗菌药物纸片直径约为6。00～6。35mm，每片的吸水量约20μl。采用K-B法,纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。用以下两个指标判定纸片的质量：
①片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标.测定方法：以质控菌株接种M—H琼脂平板,一块平板上贴6张相同的纸片. 35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。
②准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。
纸片的合理保存十分重要。药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温（—10℃以下）保存。
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只拿出少量放4℃备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可打开。如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，容易潮解。
细菌实验室应按临床的需要，决定敏感试验抗菌药物的种类.同类抗菌药物仅选用一个代表。应根据测定细菌的属种选药。
1。3、质控菌株
K—B法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。测定 MH琼脂是否适合做磺胺类试验，须用粪链球菌ATCC 29212或33186。上述质控菌株应由卫生部临床检验中心供应。实验室保存菌株可用冻干法或保存在高层琼脂中。常规质量控制菌株应每月更换1次.
质控菌株简便保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取1支，传种细菌供常规使用.待用剩至最后1支，再传代在M—H平板上，接种一批高层琼脂管备用。如此连续可避免原始菌种不接触抗生素，以防变异.
1.4、菌液比浊管
为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。采用比浊的办法控制菌悬液浓度。接种菌液浓度为 1.5×l08/m1,浊度相当于麦氏标准比浊管第1号管的1/2。
比浊管配法如下：
0.048mol/L BaCl2 0。5ml 0。18mol/L H2SO4
99。5ml
将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中,放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。
2、操作方法
2.1、制备接种菌液：临床标本中分离的细菌做药敏试验,应挑取已分纯的菌落4～5个制备
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菌悬液.
制备菌液的方法是挑选琼脂平板上、形态相同的菌落移种于M-H液体培养基中，置35℃水箱中孵育4小时，校正浊度,或用接种环挑取菌落，悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊,以有黑字的白纸为背景,调整浊度与比浊管相同。此法制备接种菌液适用于任何细菌。
2。2、接种平板：制备好的接种菌液必须在 15min内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液；在管壁上旋转挤压几次,去掉过多的菌液。
用拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将乎板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。
2。3、贴纸片：须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面,用镊尖压一下，使其贴平,纸片一贴就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。直径为 90mm的平板最好贴6张。
贴上纸片后，须在15min内放35℃孵箱培养。不可放在CO2环境中。
2。4、孵育：必须用35℃孵箱,平板在孵箱内最好单独摆放，不超过二个叠在一起，否则中间的平板，达不到孵箱温度而产生预扩散的作用,平板孵育18～24h后，读取结果。
2。5、判定结果:培养后取出平板,测量抑菌环的直径。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长,进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长,这些都不作为抑菌环的边缘。按抑菌环直径判断细菌的敏感性.
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消毒灭菌效果监测
医院必须对消毒、灭菌效果定期进行监测.灭菌合格率必须达到100％；不合格物品不得进入临床使用部门.
1、使用中的消毒剂、灭菌剂：应进行生物和化学监测。生物监测：消毒剂每季度一次，其细菌含量必须<100cfu/ml，不得检出致病性微生物：灭菌剂每月监测一次,不得检出任何微生物。化学监测：应根据消毒、灭菌剂的性能定期监测，如含氯消毒剂、过氧乙酸等应每日监测,对戊二醛的监测应每周不少于一次。应同时对消毒、灭菌物品进行消毒、灭菌效果监测，消毒物品不得检出致病性微生物,灭菌物品不得检出任何微生物。
2、紫外线消毒：应进行日常监测、紫外灯管照射强度监测和生物监测。日常监测包括灯管应用时间、累计照射时间和使用人签名。对新的和使用中的紫外灯管内进行照射强度监测，新灯管的照射强度不得低于100uW/cm2。使用中灯管不得低于70uw/cm2照射强度监测应每半年一次、生物监测必要时进行，经消毒后的物品或空气中的自然菌应减少90。00％以上，人工染菌杀灭率应达到99.90％。五、各种消毒后的内窥镜(如胃镜、肠镜、喉镜、气管镜等)及其它消毒物品：应每季度进行监测，不得检出致病微生物。
3、各种消毒后的内窥镜（如胃镜、肠镜、喉镜、气管镜等）及其它消毒物品:应每季度进行监测，不得检出致病微生物。
4、各种灭菌后的内窥镜(如腹腔镜、关节镜、胆道镜、膀胱镜、胸腔镜等）、活检钳和灭菌物品：必须每月进行监测，不得检出任何微生物。
5、血液净化系统；必须每月对入、出透析器的透析液进行监测。当疑有透析液污染或有严重感染病例时,应增加采样点，如原水口、软化水出口、反渗水出口。透析液配液口等，并及时进行监测。当检查结果超过规定标准值时，须再复查。标准值为:透析器入口液的细菌菌落总数必须≤200cfu/ml，出口液的细菌的落总数必须≤2000cfIu/ml，并不得检出致病微生物。
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环境卫生学监测
环境卫生学监测：包括对空气、物体表面和医护人员手的监测。医院应每月对手术室、重症监护病房/室(ICU）、产房、母婴室、新生儿病房、骨髓移植病房、血液病房、血液透析室、供应室无菌区、治疗室、换药室等重点部门进行环境卫生学监测。当有医院感染流行，怀疑与医院环境卫生学因素有关时，应及时进行监测。
标 准 环境类别 范 围 空气 3cfu/m ≤10 ≤200 物体表面 2Cfu/cm ≤5 ≤5 医护人员手 2cfu/cm ≤5 ≤5 Ⅰ类 Ⅱ类 层流洁净手术室、层流洁净病房 普通病房、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室无菌室、烧伤病房、重症监护病房 Ⅲ类 儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁室、≤500 急诊室、化验室、各类普通病房和房间 传染病科及病房 — ≤10 ≤10 Ⅳ类 ≤15 ≤15 1、进入人体无菌组织、器官或接触破损皮肤、粘膜的医疗用品必须无菌.
2、接触粘膜的医疗用品:细菌菌落总数应≤20cfu/g或100cm2；致病性微生物不得检出。 3、接触皮肤的医疗用品:细菌菌落总数应≤20cfu/g或100cm2；致病性微生物不得检出。 4、使用中消毒剂：细菌菌落总数应≤100cfu/ml；致病性微生物不得检出. 5、无菌器械保存液：必须无菌。
污物处理卫生标准：污染物品无论是回收再使用的物品，或是废弃的物品，必须进行无害化处理.不得检出致病性微生物。在可疑污染情况下，进行相应指标的检测.
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采样及检查原则
采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测:送检时间不得超过6h,若样品保存于0~4℃条件时。送检时间不得超过24h。
1、空气采样及检查方法 1。1、采样时间
选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。 1。2、采祥高度
与地面垂直高度80～150cm。 1.3、布点方法
室内面积≤30M2，设一条对角线上取3点，即中心一点、两端各距墙lm处各取一点；室内面积>30m2，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m.
1。4、采样方法
用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min后立即送检培养。 1.5、结果计算
空气细菌菌落总数(cfu/m3
）＝错误! 式中： A一平板面积，cm2
;
T一平板暴露时间，min；
N一平均菌落数，cfu/平皿。
2、物体表面采样及检查方法 2。1、采样时间
选择消毒处理后4h内进行采样.
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2.2、采样面积
被采表面〈100cm，取全部表面；采表面≥l00cm，取100cm。 2。3、采样方法
用5×5cm的标准灭菌规格板：放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水平样液的棉拭子1支，在规格权内横竖往返各涂抹5次；并随之转动棉拭于。连续采样4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭于放入装10ml采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。
2。4、结果计算
物体表面细菌菌落总数（cfu/cm)＝错误!
2
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2
3、医护人员手采样及检查方法 3.1、采样时间
在接触病人、从事医疗活动前进行采样.
3。2、采样面积及方法被检人五指并拢,将浸有无菌生理盐水采样液的棉试子一支在双手指曲面从指根到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30cm2)，并随之转动采样棉试子，剪去手接触部位;将棉试子放入装有10ml采样液的试管内。采样面积按平方厘米（cm2)计算。
3。 3、细菌菌落总数检查 3。4、结果计算
手细菌菌落总数（cfu/cm） ＝错误!
2
3。5、正确洗手
（1）、选用质量好的洗手液,保护手被皮肤。 （2)、用质量好的消毒液。 (3）、选用合适的洗手设备。 正确洗手步骤：
（1）、收下饰物及手表,用自来水淋湿双手.
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（2）、取无菌皂液或洁净肥皂于手上。
(3）、用力擦搓掌心、指缝、手背、手指关节、指腹、指尖、拇指10~15分钟. (4）、流动水冲洗
(5）、用擦手纸巾包住龙头将水关闭，或用肘、脚等关闭水龙头。 （6）、用擦手巾擦干双手或用烘器烘干. 洗手后,细菌菌落数应符合手质控标准。 4、医疗用品采样及检查方法
4.1、采样时间：在消毒或无菌处理后存放有效期内采样； 4.2、采样量和采样方法
（1)、破坏性方法取样：如输液器、输血器、注射针等,剪碎取一定量于培养基内培养,35℃,48小时培养。
（2）、不能用破坏性方法取样:可用浸有无菌生理盐水采样棉拭子在被检物体表面涂抹采样,被采表面〈100cm，取全部；被采表面≥100cm，取100cm于培养基里35℃，48小时培养.
4。3、质控标准：
（1)、进入人体无菌组织，器官或接触破损皮肤粘膜的医疗用品必须无菌.
（2）、接触粘膜的医疗用品,细菌落数应≤20cfu/g或100cm2,不得检出致病菌。（溶血性链球菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌等。）
5、使用中消毒剂与无菌器械保存液采集及检查方法 5。1、采样时间
采取更换前使用中的消毒剂与无菌器械保存液. 5。2、采样量及方法
在无菌条件下，用无菌吸管吸取1ml被检样液，加入9ml稀释液中混均，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在
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肉汤中加入0。1％硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3％(W/V)吐温80和0。3％卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在肉汤中加入0。3％甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂,需在肉汤中加入3％（WN)吐温80，以中和被检药液的残效作用。
复方中和剂:
（1）0.03M磷酸缓冲液（PBS): 磷酸氢二钠2。84g
磷酸二氢钾1.36g 蒸馏水 1000ml PH 7。2～7。4
(2）复方中和剂： 0.5％硫代硫酸钠
2％吐温80 l%卵玲脂 l%甘氨酸 用PBS配制
消毒剂使用中污染菌量测定：被检消毒液混匀后,用无菌吸管取样1ml加至9ml含相应中各剂的稀释液中，取0。5ml接种平板培养于36±1℃3天和28℃7天，每次采样平行作3次样品计算每毫升消毒液在连续使用过程中污染微生物数量。
每毫升微生物数(cfu/m1) ＝错误!
5。3、结果分析
平板上有菌生长，证明被检样液有残存活菌，若每个平板的落数在10个以下,仍可用于消毒处理(但不能用于灭菌),若每个平板菌落数超过10个，说明每毫升被检样液含菌量己超过100个,即不宜再用。
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各部位的消毒
1、空气消毒臭氧对空气中的微生物有明显的杀灭作用，采用30mg/m3浓度的臭氧，作用15min，对自然菌的杀灭率达90％以上。
臭氧消毒空气,必须是在封闭空间，人不在条件下进行,消毒后30min才能进入。
另有①循环风紫外线空气消毒器；②静电吸附式空气消毒器；③过氧乙酸：3~5％水溶液，加热蒸发，在60~80％相对湿度，室温下，按1g/m3计算,薰蒸时间2小时.④季铵盐类消毒液：每立方米1.2ml(折合药物浓度10mg/m3)，作用30min。⑤含氯消毒剂：用药1。5mg/m3,点燃后关闭门窗I～2小时等.
2、各种物体表面的消毒
2.l、地面消毒当地面没有明显污染时，用清水每日l~2次；病原菌：含有效氯500mg/L消
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毒液或0.2%过氧乙酸;肝炎病毒：含有效氯1000mg/L消毒液；结核病人污染：0。2%过氧乙酸或用5％煤酚皂溶液。
2.2、病房各类用品表面的消毒含有效氯200～500mg/L消毒液、0。2%过氧乙酸或紫外线。 3、检验相关器材与环境的消毒
3.1、贵重仪器局部轻度污染，可用2％碱性或中性戊二醛溶液或5000mg/L洗必泰酒精溶液擦拭；污染严重时,可用环氧乙烷消毒。
3.2、手的消毒用肥皂流水洗手1～2分钟，再用流水冲洗。在污染时，应立即用含有效氯1000mg/L消毒液或0.2％过氧乙酸浸泡3分钟，然后用清水冲洗。
3。3、废弃标本每100毫升加漂白粉5克或二氯异氰尿酸钠2克。
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