白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立

吴家红;程金芝;陈璐;孙宇

【摘 要】目的建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法.方法 根据GenBank上白纹伊蚊β-actin基因的序列(GenBank accession number: DQ657949),利用Primer Express 3.0软件设计并合成一对引物,采用SYBR Green I作为染料建立实时荧光定量RT-PCR 法.以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,并进行溶解曲线分析.结果标准曲线Ct 值检测范围为15～30,扩增效率为97.9%,相关系数为0.996,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm 值为86.4℃.结论 成功建立白纹伊蚊β-actin 基因实时荧光定量RT-PCR 法,为β-actin 基因作为内参基因进行白纹伊蚊功能基因表达差异研究奠定基础.

【期刊名称】《四川动物》 【年(卷),期】2010(029)005 【总页数】3页(P593-595)

【关键词】白纹伊蚊;β-actin 基因;实时荧光定量PCR 【作 者】吴家红;程金芝;陈璐;孙宇

【作者单位】贵阳医学院人体寄生虫学教研室,贵阳,550004;贵阳医学院人体寄生虫学教研室,贵阳,550004;贵阳医学院人体寄生虫学教研室,贵阳,550004;贵阳医学院人体寄生虫学教研室,贵阳,550004 【正文语种】中 文

【中图分类】Q78

Abstract:Object To construct a real-t ime fluorescence quantitative RT-PCR for theβ-actin gene ofAedes albopictus.M ethod Based off theβ-actin gene sequence ofAe.albopictusavailable in GenBank(Genbank accession number:DQ657949),a pair of primerswas designed for establishing a SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR method.Results A standard curvewas established based on Ct vs initial input amountofLog(copy number),and the correlation coefficientwas 0.996.The melting curve showed a single peak with a Tm of 86.4℃.Conclusion A real-time RTPCR forβ-actin gene ofAe.albopictuswas constructed successfully.Itprovided the basis for use of theβ-actin gene ofAe.albopictus as a reference gene in quantitative analysis ofmRNA expression.

Key words:Aedes albopictus;β-actin gene;real-time fluorescence quantitative PCR

实时荧光定量 RT-PCR(real-time fluorescence quantitative RT-PCR)技术是指在 PCR反应体系中加入荧光物质,并实时监测整个 PCR进程中荧光信号的累积,最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。可分为绝对定量和相对定量两种。绝对定量是指用已知的标准曲线来检测未知样本的精确拷贝数;相对定量主要是检测未知样本间基因表达的差异 (赵焕英等,2007)。在相对定量检测中,为减少不同样本间 RNA提取的质和量差别,以及逆转录和 PCR扩增效率差异对定量结果带来的误差,在测定目的基因的同时常需测定某一内源性管家基因作为内参基因进行校正和标准化 (陈凤花等,2005)。当前,常用的内参基因主要包括 β-actin、18S rRNA、GAPDH等。其中,β-actin作为构成细胞骨架的主要成分,因其具有基因序列高度保守、mRNA表达数量高且稳定等特点,在许多物种的研究

中常被用作内参基因 (贺淹才,2002;焦健华等,2007)。

白纹伊蚊 Aedes albopictus是一种重要的医学昆虫。它不仅吸血骚扰,而且可传播许多疾病。在我国,其分布范围很广,是我国重要的家栖蚊虫,同时也是传播登革热和登革出血热的重要媒介(吴家红,2008)。研究白纹伊蚊吸血不同时相和传病过程中功能基因表达的差异对了解基因的功能和疾病预防具有重要的理论和现实意义。本实验用β-actin基因作为内参基因,以 SYBR GreenⅠ作为荧光染料,建立实时荧光定量 RT-PCR方法,旨在为β-actin基因作为内参基因进行白纹伊蚊的功能基因差异表达的研究奠定基础。 1.1 实验蚊株

白纹伊蚊广州株,2006年 8月引自北京军事医学科学院微生物流行病研究所媒介生物学与控制研究室,本室常规养殖,温度 (25±2)℃,相对湿度 (80±5)%,光照 14 h/d,羽化后仅喂食糖水。 1.2 主要试剂与仪器

Trizol试剂购自美国 Invitrogen公司;逆转录试剂盒 (Pri meScriptT M

RTReagent Kit)购自日本 TaKa-Ra公司;荧光定量 PCR试剂盒 SYBR Premix Ex TaqT M(Perfect Real Ti me)购自日本 TaKaRa公司;荧光定量 PCR仪 (AB I7300型)购自美国 AB I公司;其他试剂均为国产分析纯产品。 1.3 总 RNA的制备

取羽化 5日龄未吸血雌蚊,去翅、足后置于 500 μL、TR Izol的 Epp管中,-80℃保存备用。按照 Trizol试剂盒的使用说明书,提取总 RNA,用紫外分光光度计检测其纯度及浓度,并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。 1.4 引物的设计和合成

根据 GenBank上白纹伊蚊β-actin基因序列 (登录号:DQ657949),利用引物设计软件 Primer Express 3.0设计 1对引物,上游引物为 5′-

GCTACGTCGCCCTGGACTT-3′;下游引物为 5′-AGGAACGACGGCTGGAAGA-3′,扩增片段大小为 151 bp,由上海捷瑞生物有限公司合成。 1.5 反转录

采用 TaKaRa公司的 PrimeScriptTMRT reagent Kit。反应体系为:总 RNA 2μL(500 ng)为模板,5×PrimeScript缓冲液 2μL,Pri meScript酶混合物 0.5 μL,Oligo dT和 Random 6 mers引物各 0.5μL,加RNase Free ddH2O至总体积为 10μL。反应条件:37℃30 min,85℃5 s。 -20℃保存备用。 1.6 实时荧光定量 PCR引物浓度的优化

以 cDNA为模板,进行荧光定量 RT-PCR方法的建立。在其他条件不变的情况,对引物浓度在0.1～0.5μmol/L范围内进行优化。 1.7 实时荧光定量 PCR

采用优化好的条件以 cDNA为模板,10倍稀释用于构建标准曲线 (拷贝数相当于 100～10-4),在AB I7300上进行实时荧光定量 PCR,PCR反应体系包

括:2×SYBRPremix Ex TaqT M 10μL,10μM PCR Forward Pri mer 0.8μL 10μM PCR Reverse Primer 0.8μL,50×ROX Reference Dye 0.4μL,cDNA模板 2 μL,加 RNase Free ddH2O至总体系为 20μL。反应条件:采用两步法,95℃30 s,95℃5 s,60℃34 s,40 cycles。同时加做溶解曲线分析。最后根据设定的阈值,AB I7300检测系统自动生成每个 PCR产物的扩增曲线及得出 Ct值,以 Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线。每个稀释度设3个平行。 2.1 实时荧光定量 PCR的优化条件

如图 1所示,最佳引物浓度为 0.4μmol/L,所获得的扩增曲线最好,效率最高。 2.2 扩增曲线和溶解曲线分析

从图 2可以看出,以不同浓度的 cDNA为模板,经过实时荧光定量 PCR之后获得 5条扩增曲线均呈典型的“S”型,Ct值线性范围为 15～30。

利用溶解曲线可将特异和非特异产物区分开。如图 3所示,在 86.4℃处形成单一的特异峰,峰值之前曲线比较平滑,未形成明显的杂峰,说明扩增产物的特异性强,没有引物二聚体及非特异性扩增。 2.3 标准曲线和线性关系

从图 3可见,标准曲线的相关系数 (co-efficient)为 0.996,斜率 (slope)为 -3.374254,截距 (intercept)为 23.043821,从而可以获得β-actin基因的标准曲线方程为:y=-3.374254x+23.043821,其中 x代表起始模板拷贝数以 10为底的对数,y代表 Ct值,根据标准曲线方程,我们可以通过未知样品的 Ct值来计算未知样品浓度;通过斜率可以计算出 PCR反应扩增效率 (E),依据公式 E=10(-1/slope)-1,计算出扩增效率为 97.9%。

从图 4还可以看出,在 100～10-4范围内,起始模板拷贝数以 10为底的对数和 Ct值有很好的线性关系,表明可以在宽广的范围内对目的基因进行检测。

近年来,实时荧光定量 PCR技术因具有检测范围宽 (～108)、敏感性高 (<5拷贝)、精确度高 (CV<2%)、无 PCR后处理步骤、避免交叉污染、产出率高以及可进行多重检测等优点,已成为当今研究mRNA表达水平最热门的技术之一,在基础研究和分子诊断领域广受青睐。其中的 SYBR GreenⅠ染色法可以与任意模板结合,可应用于任何反应体系及经济实惠等优点更成为很多实验室常用的基因表达差异的研究方法。然而,由于其能与任意 DNA链结合,因此一旦体系中有非特异扩增,就会影响定量的可靠性和重复性。为此,引物的设计和反应体系的优化则显得至关重要。 本实验采用 AB I7300荧光定量 PCR仪,主要从引物浓度角度对实时荧光定量 PCR条件进行了优化,成功建立了检测白纹伊蚊β-actin基因的实时荧光定量 PCR方法。从扩增曲线上看,Ct值线性范围在 15～30之间,每一条扩增曲线均呈典型的“S”形,且平台期几近重叠。说明获得了良好的扩增。从溶解曲线上看,PCR产物在 86.4℃有一单一的特异峰,峰的形状也较锐利,没有引物二聚体及非特异扩增产物,说明利用

Primer Express 3.0软件设计的引物较好,扩增特异性强。评价标准曲线的优劣有两个指标,即相关系数和斜率。相关系数表示标准曲线的线性度,理想值应大于 0.99,越接近 1说明其线性越好,定量越准确。本实验的标准曲线的相关系数为 0.996,表明本实验所获得的标准曲线线性度好,误差小;斜率可以计算出扩增效率,理想的扩增效率在 0.8陈凤花,王琳,胡丽华.2005.实时荧光定量 RT-PCR内参基因的选择[J].临床检验杂志,23(5):393～395.

贺淹才.2002.肌动蛋白和肌动蛋白基因的研究进展[J].生命的化学,22(3):248～250. 侯林,姜丽娟,孙文静,等.2006.中国卤虫 actin基因的实时荧光定量 PCR方法的建立和优化[J].辽宁师范大学学报 (自然科学版),29(4):466～469.

焦健华,马磊,张东辉.2007.白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段的克隆及其作为基因表达内参照的应用[J].中国病原生物学杂志,2(6):454～456.

唐永凯,贾永义.2008.荧光定量 PCR数据处理方法的探讨[J].生物技术,18(3):89～91.

吴家红.2008.蚊虫唾液组分的抗凝血活性及其对宿主的免疫调控作用[J].中国媒介生物学及控制杂志,19(5):481～483.

赵焕英,包金风.2007.实时荧光定量 PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志,16(4):492～497.