一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110777121 A(43)申请公布日 2020.02.11

(21)申请号 201911239891.5(22)申请日 2019.12.06

(83)生物保藏信息

CCTCC NO：C2019143 2019.07.09(71)申请人 江苏省农业科学院

地址 210014 江苏省南京市钟灵街50号(72)发明人 钱晶　王永山　孙伟伟　欧阳伟　

马孙婷　毕振威　夏兴霞　王晶宇　王晓丽　诸玉梅　(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限

公司 32200

代理人 程斯佳(51)Int.Cl.

C12N 5/20(2006.01)C07K 16/10(2006.01)

(54)发明名称

一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株(57)摘要

本发明公开了一种能分泌高中活性抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株，属于生物技术领域。从建立的127株杂交瘤细胞库中筛选出一株具有较高中和活性的杂交瘤细胞株3B5，抗原表位在犬瘟热病毒的H蛋白第228～237位氨基酸。单克隆抗体3B5与单克隆抗体1D7和2G3组成的抗体组合治疗剂中和效价为213，比单独使用3B5、1D7、2G3的中和效价提高8-32倍中和病毒能力，单克隆抗体组合治疗剂的临床应用试验结果比联合使用单克隆抗体1D7和2G3效果从98％提高到100％，治疗周期从4天缩短为2天。可用于犬瘟热(CD)发病动物的临床治疗，降低生产成本，提高治疗效果。

A61K 39/395(2006.01)

A61P 31/14(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页

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权　利　要　求　书

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1.一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株，该杂交瘤细胞3B5株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏中心保藏号CCTCC NO：C2019143，分类命名：抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5，该杂交瘤细胞3B5株制备的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体识别的抗原表位在犬瘟热病毒H蛋白第228-237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD。

2.权利要求1所述分泌犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株的应用。

3.权利要求1所述分泌犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株在制备犬瘟热病毒单克隆抗体组合治疗剂中的应用。

4.用权利要求1所述杂交瘤细胞3B5株制备的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体3B5。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是指犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体3B5与杂交瘤细胞1D7株分泌的单克隆抗体1D7和杂交瘤细胞2G3株分泌的单克隆抗体2G3按1:1:1的比例混合均匀，制备成单克隆抗体组合治疗剂的应用。

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一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株

技术领域

[0001]本发明公开了一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株，属于生物技术领域。

背景技术

[0002]犬瘟热(canine distemper)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，常引起消化道、呼吸道以及神经系统异常等症状，并能引起机体免疫抑制。犬瘟热的自然感染宿主已由传统的犬科、鼬科和浣熊科扩展到所有食肉目动物、偶蹄目猪科、灵长目的称猴属和鳍足目海豹科等多种动物，发病率几乎可达100％，死亡率为80％以上，已成为危害养犬业和经济动物养殖业的重要传染病之一。[0003]CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属，病毒粒子呈圆形或椭圆形，有时也呈长丝状，直径为150～300nm。粒子中心含有宽径约15～17nm螺旋形核衣壳，外面被覆一近似双层轮廓的膜，膜上排列有1.3nm杆状纤突。病毒的基因组为不分节段的负链RNA，全长15,616nt，从它的3′端到5′端依次为3′端前导序列、核衣壳蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝蛋白基因(H)、大蛋白基因(L)和5′端引导序列。P、N、L为髓芯蛋白，与RNA转录和复制有关，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，P蛋白可能有聚合酶功能。M、F、H为包被蛋白，位于N蛋白的外侧，H蛋白以近N末端的疏水区将其嵌在M蛋白上。其中，H基因全长为1947nt，仅含有一个开放型阅读框，其编码的H蛋白是CDV囊膜表面的糖蛋白之一，可与靶细胞表面的受体(如SLAM和nectin-4)相互作用，介导病毒入侵宿主；同时，H蛋白存在着许多中和性抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。[0004]目前预防该病使用的疫苗多为弱毒苗，但是许多犬、水貂、狐等养殖场在应用弱毒疫苗后仍会发生本病。分析原因，与母源抗体、疫苗效价、使用方法以及病毒变异有关。用弱毒疫苗免疫动物也未能得到完全保护，有许多免疫动物群体暴发犬瘟热，损失十分惨重。因此对犬瘟热除了积极的预防外，有必要对患病动物进行有效的治疗，将损失降到最小。犬瘟热病毒的高免血清常用于治疗犬瘟热，但制备成本较高，易传播其它病毒，抗体中和效价参差不齐，难以标准化。因此制备特异性好，抗体中和效价高，易于标准化，制备成本低的单克隆抗体是必然选择。

[0005]单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体(毛开云,等.单克隆抗体技术相关专利分析[J].生物产业技术,2012(6):78-86.)。单克隆抗体识别的抗原表位(即抗体结合抗原的氨基酸序列)具有特异性。因此，解析单克隆抗体识别的抗原表位对后续犬瘟热病毒蛋白功能研究以及治疗、诊断检测等方面具有重要意义。

[0006]之前，我们筛选到两株分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株和2G3株(一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，国家发明专利申请号：201210081170.8，授权公告号：CN102618503B，授权公告日：2013-06-12；一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物，国家发明专利申请号：201310036576.9，授权公

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告号：CN103059133B，授权公告日：2015-12-09。)，用其制备的单克隆抗体1D7或/和2G3均可以中和不同动物源的CDV毒株，抗犬瘟热病毒毒株的范围广泛。

[0007]然而我们并不清楚上述单克隆抗体(1D7和2G3)是针对哪个病毒结构蛋白，也没有解析上述单克隆抗体的抗原表位。在犬瘟热(CD)发病动物的临床治疗能力方面有待增强，需要降低生产成本，提高治疗效果，临床应用范围还需要更加广泛。发明内容

[0008]技术问题

[0009]本发明的目的是提供一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，用其制备的单克隆抗体3B5具有较好的生物学特性，与其他犬瘟热病毒单克隆抗体1D7和2G3组成的抗体组合治疗剂具有更强的中和病毒能力，可用于犬瘟热(CD)发病动物的临床治疗，其中和犬瘟热病毒的能力增强，降低生产成本，提高治疗效果，临床应用范围更广泛。[0010]技术方案

[0011]为达到以上目的，是通过以下技术方案实现的：

[0012]一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株，该杂交瘤细胞3B5株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏中心保藏号CCTCC NO：C2019143，分类命名：抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5，该杂交瘤细胞3B5株制备的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体识别的抗原表位在犬瘟热病毒H蛋白第228-237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD。

[0013]所述分泌犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株在制备犬瘟热病毒单克隆抗体组合治疗剂中的应用。[0014]用所述杂交瘤细胞3B5株制备的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体3B5。用所述的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体3B5与杂交瘤细胞1D7株分泌的单克隆抗体1D7和杂交瘤细胞2G3株分泌的单克隆抗体2G3按1:1:1的比例混合均匀，制备成单克隆抗体组合治疗剂。[0015]用所述单克隆抗体组合治疗剂可以用于犬瘟热的临床治疗。[0016]有益效果

[0017]现有技术中我们并不清楚上述单克隆抗体(1D7和2G3)是针对哪个病毒结构蛋白，也没有解析上述单克隆抗体的抗原表位。本发明筛选了另一种抗犬瘟热病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株(孙伟伟,等.犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J/OL].中国兽医科学，网络首发2019-08-16，https://doi.org/10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0182.)，且制备的单克隆抗体3B5是针对犬瘟热病毒H蛋白的，经单克隆抗体的识别表位筛选表明3B5、2G3、1D7结合CDV的抗原表位是不同的。而且经肽扫描方法确定该单克隆抗体识别的抗原表位在CDV的H蛋白第228～237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD，该抗原表位尚未报道，属于新发现的犬瘟热病毒中和表位。

[0018]本发明利用以重组H蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法从建立的127株杂交瘤细胞库中筛选出一株具有较高中和活性的杂交瘤细胞株3B5，其生物学性能优良，经肽扫描方法确定该单克隆抗体识别的抗原表位在CDV的H蛋白第228～237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD，该抗原表位尚未报道。本发明的制备的单克隆抗体3B5与其他犬瘟热病毒单克隆抗体1D7和2G3组成的抗体组合治疗剂具有更强的中和病毒能力，可用于犬瘟热(CD)

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发病动物的临床治疗，中和犬瘟热病毒的能力增强，降低生产成本，提高治疗效果，临床应用范围更广泛。

[0019]本发明的特点和优点如下：

[0020]1.本发明的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株是以重组H蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法从建立的127株分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出来的，生物学性能十分优良，其针对的病毒蛋白是H蛋白。

[0021]2.本发明的杂交瘤细胞3B5株制备的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体3B5识别的抗原表位在犬瘟热病毒H蛋白第228～237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD，该表位尚未报道。

[0022]3.本发明的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体3B5与杂交瘤细胞1D7株分泌的单克隆抗体1D7和杂交瘤细胞2G3株分泌的单克隆抗体2G3所识别的抗原表位是不同的，将三者按1:1:1的比例混合均匀，制备成单克隆抗体组合治疗剂能克服单克隆抗体识别抗原表位的单一性，提高其抗CDV的中和活性。

[0023]4.本发明的单克隆抗体组合治疗剂的中和效价为213，显著高于单独或两两联合使用抗体治疗剂的中和效价(单克隆抗体3B5、1D7、2G3的中和效价分别为28、210、210，两两联合抗体组合治疗剂3B5+1D7、3B5+2G3、1D7+2G3的中和效价分别为211、211、212)，三者组合的单克隆抗体组合治疗剂的中和病毒能力更强，比单独使用3B5、1D7、2G3的中和效价提高8-32倍中和病毒能力。

[0024]5.本发明的单克隆抗体组合治疗剂用于临床治疗，单克隆抗体组合治疗剂的临床应用试验结果比联合使用单克隆抗体1D7和2G3效果从98％提高到100％，治疗周期从4天缩短为2天。可用于犬瘟热(CD)发病动物的临床治疗，降低生产成本，提高治疗效果，临床应用范围更广泛。[0025]生物保藏

[0026]该杂交瘤细胞3B5株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏中心保藏号CCTCC NO：C2019143，分类命名：抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5。

具体实施方式[0027](一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[0028]1.CDV抗原的制备[0029]将CDV Onderstepoort株(荷兰英特威国际有限公司产品)接种于Vero细胞(购自ATCC细胞库)，待细胞出现完全病变后收集感染上清液，反复冻融三次，8000r/min离心3分钟，去除细胞碎片；收集上清，并加入PEG6000(Sigma公司产品)至终浓度为9％，再加入氯化钠至终浓度为3％，室温搅拌至溶解，4℃沉淀过夜。次日，采用8000r/min离心1小时，弃上清，用5mL TNE溶液(pH7.8)重悬。将重悬液加入至60％-40％-20％的蔗糖梯度溶液，60000r/min超速离心3小时，收集分层的蛋白条带(60％-40％间)，吸取病毒带，通过电镜负染观察病毒形态，并用分光光度计测定病毒浓度，-80℃保存备用。[0030]2.动物免疫[0031]用纯化的CDV免疫抗原经腹腔注射免疫8周龄雌性BALB/C小鼠(购自扬州大学比较

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医学实验中心)，200μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)乳化抗原，之后每隔14天用弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)如花抗原，再免疫2次。第3次免疫后的第6天断尾采血，用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选取其抗体效价达1:10000以上的小鼠，在融合前3天用纯化的CDV抗原再次加强免疫。[0032]3.细胞融合

[0033]采用PEG细胞融合方法，取生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞(购自ATCC细胞库)与免疫的BALB/C小鼠脾细胞按1:5的比例，充分混匀，1000r/min离心10分钟，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置于40℃水浴预热，用1mL吸管在45秒内加完预热至40℃的50％PEG4000(Sigma公司产品)1mL，边加边轻轻震荡，然后在90秒内加入15mL预热至37℃的无胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温静置10分钟，1000r/min离心10分钟，弃上清，加入含10％胎牛血清(FCS)(赛默飞世尔科技公司产品)和HAT(Sigma公司产品)的RPMI-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％CO2培养箱培养。3天后补加含HAT(Sigma公司产品)和10％FCS(赛默飞世尔科技公司产品)的RPMI-1640培养基，5天后改用含HT(Sigma公司产品)和10％FCS(赛默飞世尔科技公司产品)的RPMI-1640培养基，10天后换成含10％FCS(赛默飞世尔科技公司产品)的RPMI-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。[0034]4.杂交瘤细胞株的筛选

[0035]按方阵法确定纯化CDV抗原的包被浓度，用包被液为0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液对纯化的CDV抗原进行倍比稀释，用稀释至400倍的CDV抗原量包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜，PBST(含0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液)洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；以含10％小牛血清的PBST封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2小时，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；将融合后12天的细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1000稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用1小时，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技术有限公司产品)，100μL/孔，37℃放置1小时，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；加入TMB底物，100μL/孔，室温避光显色10分钟；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD450nm值，当阴性参考血清的OD450nm值≤0.1，阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，隔2天后再检一次，对两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。[0036]5.杂交瘤细胞的克隆化

[0037]首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含10％FCS(赛默飞世尔科技公司产品)的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％CO2培养箱中培养，4天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8天时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD450nm值较接近。将克隆化的CDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存。经过20次的细胞融合、筛选、克隆、鉴定，建立了127株稳定分泌NDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞库。[0038]6.犬瘟热病毒H蛋白的表达与纯化

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根据GenBank中发表的Onderstepoort株(登录号：AF378705)的H基因序列，人工合

成经大肠杆菌密码子优化的核酸序列(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，在其序列两端分别引入NheI和HindIII酶切位点。随后，将人工合成序列与原核表达质粒pET28a(+)(北京索莱宝科技有限公司产品)分别进行NheI和HindIII(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别回收片段，在T4连接酶(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)的连接作用下，4℃孵育1小时，转化至E.coli Rosetta感受态(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)中，获得可以表达犬瘟热病毒H蛋白的菌株。将该菌株培养至OD600nm值约为1.0时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)，于30℃诱导表达6小时，收集菌体，并经Ni-NTA亲和层析柱(GE公司产品)纯化，收集纯化的重组蛋白，经BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定其浓度为1.17mg/mL，-70℃保存备用。[0040]7.犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选[0041]按方阵法确定纯化H蛋白的包被浓度，用包被液为0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液对纯化的H蛋白进行倍比稀释，用稀释至0.1μg/孔，置4℃包被过夜，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；以含10％小牛血清的PBST封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2小时，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；将127株稳定分泌CDV特异单克隆抗体的细胞上清(1:1000稀释)加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用1小时，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技术有限公司产品)，100μL/孔，37℃放置1小时，PBST洗涤3次，每次5分钟，最后一次拍干；加入TMB底物，100μL/孔，室温避光显色10分钟；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，选取OD450nm值最高数值所对应的CDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞株。上述试验重复3次后结果显示，杂交瘤细胞3B5株单克隆抗体的OD450nm值最高。[0042]8.腹水的制备

[0043]将灭菌的液体石蜡腹腔注射8～10周龄的BALB/C小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.5mL/只，7天后，将杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(含2×106～5×106个杂交瘤细胞)，7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，3000r/min离心10分钟，收集上清，分装后于-20℃保存备用。[0044](二)单克隆抗体3B5的生物学特性[0045]1.杂交瘤细胞株染色体分析[0046]用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取SP2/0骨髓瘤细胞(购自ATCC细胞库)和阳性杂交瘤细胞培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4小时。用5mL 37℃预温的0.075mol/L KCL低渗液将细胞吹起混匀，置37℃温箱作用30分钟，向其中加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸为3:1)lmL，边滴加边混匀，1000r/min离心10分钟。弃上清留细胞沉淀，用5mL固定液将细胞吹起，37℃作用30分钟，1000r/min离心10分钟，重复上述操作一次。细胞沉淀用lmL固定液悬起混匀，用滴管吸取悬液1滴，滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆萨染液染色10分钟，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为94条，而骨髓瘤细胞的染色体的数量为54～64条，小鼠脾细胞染色体数量为40条，证明所获得的此杂交瘤细胞株是两种细胞融合的结果。

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2.单克隆抗体的特异性鉴定

[0048]实验在24孔细胞培养板中进行。将CDV Onderstepoort株(荷兰英特威国际有限公司产品)、犬流感病毒(购自中国兽医药品监察所)、犬细小病毒(购自中国兽医药品监察所)分别接种到Vero细胞(购自ATCC细胞库)，培养72小时病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇1mL/孔，4℃固定30分钟，用PBS洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞4F6的培养上清液，200μL/孔，37℃孵育1小时，PBS洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(武汉博士德生物工程有限公司产品)，200μL/孔，37℃孵育1小时，PBS洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体只能与CDV Onderstepoort株感染的Vero细胞反应，产生荧光，而与其他病原感染的Vero细胞无荧光，证明单克隆抗体对CDV的特异性。[0049]3.单克隆抗体的类型测定[0050]用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定杂交瘤细胞3B5株分泌单克隆抗体的亚类，结果显示，该单克隆抗体亚类为IgG1κ。[0051]4.单克隆抗体的稳定性测定

[0052]将获得的杂交瘤细胞3B5株进行连续培养传代50次、液氮冻存与复苏试验，用间接ELISA方法连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价均为212，证明此杂交瘤细胞3B5株能持续稳定地分泌抗CDV单克隆抗体。

[0053]5.单克隆抗体的病毒中和效价测定[0054]采用固定病毒稀释抗体的方法，将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将10倍系列稀释的单克隆抗体的细胞培养上清和小鼠腹水分别与等体积含200TCID50的CDV悬液混合均匀，37℃作用1小时，取该病-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5％CO2温箱培养，观察结果，单克隆抗体3B5细胞培养上清的中和效价为28，小鼠腹水中和效价为106。[0055]6.单克隆抗体的识别表位筛选

[0056]采用间接ELISA相加试验分析单克隆抗体3B5与之前制备的2G3和1D7结合抗原表位的差异。根据单克隆抗体三者的ELISA抗体效价，将其分别稀释至饱和浓度，在此浓度下各取50％混匀，分别测定混合的单克隆抗体及饱和浓度下三种单克隆抗体的OD450nm值。按下列公式分别计算三株单克隆抗体相互叠加后的AI值:AI＝AI(％)＝[(2A1+2/A1+A2)-1]×100，A1和A2是两种单克隆抗体各自的吸收值，A1+2是2种单克隆抗体相加所测得的吸收值。若AI<50为2种单克隆抗体结合同一抗原位点，若AI>50为两种单克隆抗体结合不同的抗原位点。实验结果为单克隆抗体2G3与1D7的AI为75(大于50)、3B5与1D7的AI为85(大于50)、2G3与3B5的AI为80(大于50)，表明3B5、2G3、1D7结合CDV的抗原表位是不同的。[0057]进一步，通过肽扫描的方法对所制备单克隆抗体识别的抗原表位进行筛选，根据H蛋白氨基酸序列，合成长度为15个氨基酸的肽段用来进行抗原表位的筛选，每条合成肽的步移为5肽，与前后合成肽各有5个氨基酸重复(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)。合成连续重叠的80条短肽，分别以100ng/孔包被ELISA板，以制备的单克隆抗体3B5(1:10000)为一抗，HRP-IgG为二抗，通过间接ELISA方法(见本发明“具体实施方式，(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，7.犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选”章节内容)进行检测，根据检测的OD450nm值初步鉴定单克隆抗体的识别表位。结果显示，单克隆抗体3B5识别

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的抗原表位在H蛋白第228～237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD，该表位尚未报道。[0058](三)单克隆抗体组合治疗剂及中和活性测定[0059]1.单克隆抗体3B5、1D7、2G3的制备

[0060]采用细胞培养上清法制备单克隆抗体3B5、1D7、2G3。将分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株、分泌犬瘟热病毒特异性单克隆抗体杂交瘤细胞1D7株和2G3株(一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，国家发明专利申请号：201210081170.8，授权公告号：CN102618503B，授权公告日：2013-06-12；一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物，国家发明专利申请号：201310036576.9，授权公告号：CN103059133B，授权公告日：2015-12-09。以上细胞株均购自南京天邦生物科技有限公司)分别在细胞培养瓶中用含10％FCS(赛默飞世尔科技公司产品)的RPMI-1640培养基进行培养，待细胞密度生长达80％-90％(细胞浓度约为2×106个/mL)时，将培养基换成无血清的RPMI-1640培养基，放置5％CO2培养箱培养直到所有细胞死亡，分别将培养液1000r/min离心10分钟，取上清于-20℃保存备用。[0061]2.单克隆抗体组合治疗剂的制备

[0062]将用细胞培养上清法制备的单克隆抗体3B5、单克隆抗体1D7和单克隆抗体2G3按1:1:1体积比充分混合均匀，制备单克隆抗体组合治疗剂(3B5+1D7+2G3)。同时，将单克隆抗体3B5、单克隆抗体2G3和单克隆抗体1D7两两组合，按1:1体积比充分混合均匀，制备抗体组合治疗剂(3B5+1D7、3B5+2G3、1D7+2G3)。

[0063]3.单克隆抗体及组合物中和活性的测定[0064]采用固定病毒稀释抗体的方法(见本发明“具体实施方式，(二)单克隆抗体3B5的生物学特性，5.单克隆抗体的病毒中和效价测定”章节内容)分别测定细胞培养上清法制备的单克隆抗体3B5、1D7、2G3以及单克隆抗体组合治疗剂(3B5+1D7+2G3、3B5+1D7、3B5+2G3、1D7+2G3)的中和效价。结果见表1，[0065]单克隆抗体3B5、1D7、2G3的中和效价分别为28、210、210，两两联合抗体组合治疗剂3B5+1D7、3B5+2G3、1D7+2G3的中和效价分别为211、211、212，抗体组合治疗剂3B5+1D7+2G3的中和效价分别为213(显著高于单独或两两联合组合)，三者组合的单克隆抗体组合治疗剂的中和病毒能力更强，比单独使用3B5、1D7、2G3的中和效价提高8-32倍中和病毒能力。[0066]表1抗体中和效价比较

[0067]

(四)单克隆抗体组合治疗剂的临床应用

[0069]1.临床CD病犬的治疗

[0070]将制备的单克隆抗体组合治疗剂用于门诊犬瘟热发病犬的治疗，采用皮下注射的方法，每公斤体重注射1mL单克隆抗体组合治疗剂，每天一次，并辅以对症治疗，每天采用犬瘟热病毒检测试纸条进行测定，计算有效率、治愈率及治疗周期见表2。结果可见，抗体组合治疗剂3B5+1D7+2G3的治愈率达100％(高于其他)、治疗周期约2天(短于其他)。[0071]表2单克隆抗体组合治疗剂的临床应用比较

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[0072]

本发明所述的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5，其生物学性能十分

优良，用其制备的单克隆抗体识别的抗原表位在CDV的H蛋白第228～237位氨基酸，其多肽序列为YGKTYLLVPD，该抗原表位尚未报道。用制备的单克隆抗体3B5与其他犬瘟热病毒单克隆抗体1D7和2G3组成的抗体组合治疗剂具有更强的中和病毒能力，三者组合的单克隆抗体组合治疗剂的中和病毒能力更强，比单独使用3B5、1D7、2G3的中和效价提高8-32倍中和病毒能力。可用于犬瘟热发病动物的临床治疗，单克隆抗体组合治疗剂的临床应用试验结果比联合使用单克隆抗体1D7和2G3效果从98％提高到100％，治疗周期从4天缩短为2天，治疗效果显著，其中和犬瘟热病毒的能力增强，降低生产成本，临床应用范围更广泛。

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