AMP 含量检测试剂盒说明书 HPLC 法

北京索莱宝科技有限公司AMP含量检测试剂盒说明书HPLC法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC1020规格：50T/48S产品内容：试剂一：自备，取2ml浓高氯酸，加入58ml双蒸水，4℃保存；试剂二：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）,4℃可保存1周；试剂四：AMP标准品5mg×1支，-20℃保存；产品说明：AMP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定AMP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。AMP在254nm下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。需自备的仪器和用品：高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各1个，0.45μm）、C18柱（4.6×150mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、甲醇（色谱级，300mL）和蒸馏水。实验前的准备工作：1、将蒸馏水1000mL、流动相缓冲液基质1000mL和甲醇300mL用0.45μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）。2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000mL与甲醇配比为99.9：0.1（v/v），即取999mL第1页，共3页北京索莱宝科技有限公司缓冲液基质与1mL甲醇混合。3、将抽滤完毕的甲醇和蒸馏水配比成100%的甲醇，10%的甲醇，蒸馏水各250mL。将2和3中的溶剂超声20分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。AMP的提取：1、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆，4000g常温离心15min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000g常温离心15min，取上清，针头式过滤器过滤后待测。2、细胞或细菌的处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；4000g常温离心15min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000g常温离心15min，取上清，针头式过滤器过滤后待测。标准品的配制：在试剂四中加入1mL蒸馏水，配成5mg/mL母液，将母液用蒸馏水分别稀释成100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL和20μg/mL的ADP标准品溶液。针头式过滤器过滤后待测。AMP含量测定操作步骤：1.开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量20μL，流速1mL/min，保留时间10min，检测波长254nm，设置完毕保存方法组。2.用100%的甲醇、10%的甲醇、蒸馏水按甲醇浓度从大到小的顺序过色谱柱30min。3.用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。4.加入标准品20μL，在10min内可分离AMP，AMP的保留时间在3min左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的AMP标准品的峰面积。5.加入样品20μL，在相应保留时间处检测AMP的峰面积。AMP含量的计算：第2页，共3页北京索莱宝科技有限公司以标准品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算AMP标准曲线。将样品峰面积代入标准曲线，计算样品AMP含量。注意事项：1、为了避免使用过程中柱压过大，流速由小到大调节。2、使用完毕时，由于流动相含有缓冲盐，用水冲洗柱子1小时，以防止缓冲盐结晶堵塞色谱柱，然后用10%的甲醇、100%的甲醇按甲醇浓度从小到大的顺序洗色谱柱30min。3、标准品的稀释倍数要根据样品中AMP浓度确定，样品中AMP的峰面积必须落在不同浓度的AMP标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。第3页，共3页