菊粉酶的进展及应用
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发布时间：2022-04-20 10:27
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时间：2023-06-23 20:25
菊粉酶有不同的分类方法。
根据菊粉酶在微生物体内主要分布于细胞内、细胞壁和细胞外，分别称为胞内酶、胞壁结合酶和胞外酶，它们的比例主要受菌种、碳源、温度和ph的影响（ettalibi等，1990）：l）随着温度的升高胞外酶比例下降，而其他两种酶比例上升；2）以菊粉或蔗糖为碳源培养微生物时，前者胞外酶比例高于后者，其他两种酶则相反；3）胞外酶主要由真菌合成，细胞壁结合酶主要产自酵母；4）适当的ph使细胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他两种酶比例下降。
根据作用底物方式的不同，或者说根据菊粉酶酶切果聚糖链方式分为内切酶（ec3．2．1．7）和外切酶（ec3．2．1．80）。通常用i/s的大小来区分内切型菊粉酶和外切型菊粉酶，i是以菊粉作底物时的酶活，s是以蔗糖作底物时的酶活。一般认为外切菊粉酶的i/s值比内切菊粉酶的us低。内切菊粉酶水解菊粉可以得到高纯度低聚果糖，常由真菌分离出来。外切菊粉酶在胞内、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高纯度果糖。
根据来源菊粉酶可以分为微生物菊粉酶和植物菊粉酶。
2．l热稳定性绝大多数报道中，菊粉酶的最适温度为52～℃之间，55～58℃最适宜。
2．2ph值对活力的影响菊粉酶最适ph为弱酸性，这一性质不仅操作安全，而且使用过程中可以防止微生物污染，也是果糖最稳定的ph值。
2．3底物专一性李俊刚等（1999）认为，提高菊粉酶酶解效率的关键在于提高酶活和增加底物对酶作用的敏感性。据研究报道，菊粉酶不仅可以对菊粉作用，也可以对蔗糖及棉子糖作用，并表现出更高的活力和水解能力。使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能诱导产生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。这可能是因为提取液除含菊粉外，还含有较多的短链的多聚果糖，更有利于菌体的生长以及被酶水解（pramod等，1991）。也就是说，一定的底物可以诱导生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物对酶的活性影响很大。研究发现一定浓度的菊粉、麦芽糖和低浓度的果糖能够诱导生成菊粉酶，淀粉对菊粉酶的影响不大，葡萄糖却能明显地抑制菊粉酶活性。表明菊粉酶有底物专一性。
菊粉酶的来源很广，自然界中的植物以及土壤、水和动物消化道中的多种微生物都可以分泌菊粉酶。微生物来源的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。据不完全统计，产菊粉酶的有丝状真菌17个属物余种，酵母菌10个属20余种，细菌12个属10余种。目前有不少研究人员仍在致力于筛选新的产酶菌种，并对现有菌种进行改造，以得到高酶活、热稳定性好的生产菌株。大多数微生物菊粉酶均为外切型菊粉酶，并且常常呈现出转化酶活力，转化酶是一种水解蔗糖为葡萄糖和果糖的酶，对葡粉没有作用。
菊粉酶的纯化步骤一般分为：（nh4）2so4沉淀、离子交换层析及凝胶过滤色谱等。离子交换层析可用来选择性地分离外切型菊粉酶和内切型菊粉酶，通常用naci进行线性梯度洗脱，随着na－ci浓度增加，内切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出（azhall等，19）。菊粉酶的提纯过程：在0℃条件下，用40%饱和硫酸铵除杂蛋白，用90%饱和硫酸铰析出菊粉酶，用sephadexg25脱盐，聚乙二醇透析浓缩；再进行sophadexg200层析，操作温度10℃；然后进行deae一纤维素de52离子交换层析；最后4℃、120v恒压电泳分离（贾英民等，1998）。
常见的酵母和真菌中分离的酶多同时具有菊粉酶和转化酶活性，为区分两者，人们常采用“e=菊粉酶总酶活+转化酶总酶活”的公式，当e>0．02为菊粉酶，e<0．02则为转化酶。菊粉酶酶活定义为在一定的反应条件下每分钟释放lμmol果糖所需酶量；转化酶酶活定义为每分钟水解1μmol蔗糖所需的酶量。由于测定菊粉酶酶活的定义没有统一标准，因此酶活的单位也有不同。
6．l酶液的制备胞外菊粉酶粗酶液的制备：将发酵液过滤或离心即可得粗酶液。胞内菊粉酶粗酶液的制备：取一定量的发酵液离心后得菌体，将菌体用0．lmol/lph值为5．6的醋酸缓冲液洗涤2～3次后，加缓冲液至原体积，然后用超声波处理（10khz，100w，5min）菌悬液，处理液即为胞内菊粉酶粗酶液（肖春玲，1999）。
6．2酶活测定黎明兰等（1995）用菊芋提取液做培养基。发酵后取0．05ml发酵液加4．5ml5%菊粉液，55℃反应30min，沸水浴煮10min终止酶活，在同样的反应系统和条件下加入沸水浴煮10min的酶作空白对照。取一定量反应液用费林试剂热滴定法测糖（北京大学生物系生物生化教研室，1986）。酶活单位定义为：在上述反应条件下生成lμmol/min还原糖所需酶量为1个酶活单位。
uhm等（1987）报道的方法是，取50μl适当稀释的酶液，加入450μl5%的菊粉（0．lmol、ph4．5的醋酸缓冲液配制），60℃保温10min，沸水浴5min，灭活终止反应（在完全相同的条件下灭活酶底物作对照），快速冷却后，用somogi-nelson法（derycke等，1984）测定还原糖。陈晓明等（2000）测定酶活时与uhm的方法不同的是，用3、5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖数量，酶活单位定义为：在上述反应条件下，每分钟催化菊糖水解生成lμmol还原糖的酶量。
7．l利用菊粉酶生产高果糖浆由于高果糖浆价格低廉，味甜，爽口，渗透压高，保藏效果好，热值低，不易造成龋齿，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等发达国家被广泛用于食品和医药工业。20世纪70年代以后，各国开始关注以菊粉为原料，以酸法和酶法水解制备果糖。酸法虽然产量高，但副产物多，色素重，分离精制难。80年代，美国、法国人b利时、加拿大等国的研究人员开始研究利用菊粉酶制果糖，其工艺简单，转化率高，产物纯，果糖产量高，可直接生产超高果葡糖浆（uhfgs），果糖含量90%以上。为此美国、英国、丹麦、法国、加拿大等发达国家都在进行研究。由此可见菊粉酶在果糖及果葡糖浆的生产上具有巨大的开发应用潜力。外切菊粉酶降解产物以果糖为主且果糖比例高。菊粉酶生产高果糖浆的研究国内外都较多，我国对其研究还处于起步状态。
7．2利用菊粉酶生产低聚果糖低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，有防治便秘、抑制肠内*物质形成、提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇等作用，同时适于糖尿病人食用。比利时orafti公司投资20亿比利时法郎，历时数十年种植菊艺开发生产低聚果糖和菊粉，分别作为食糖和油脂代用品（胡学智，1997）。日本明治制果也在大规模生产。中国食品发酵研究所、上海医药工业研究所等已经试制成功，正在扩大试验中。工业上生产利用菊粉酶生产低聚果糖的方法是由内切型菊粉酶水解菊粉而成，产物以低聚果糖为主，纯度高，原料便宜，低聚果糖已被视为食品原料，而非食品添加剂。
7．3利用菊粉酶生产酒精利用菊粉酶生产酒精，国外相关研究较多。国外有报道指出，用aa-pergillusniger（schorr-garlindo等，1995）、k．fragilis（ohta等，1993）或k．margaritis（margantis等，1982）发酵菊粉生产酒精，aspergll。niger转化率为明%以上（v/v），后两者几乎能完全将菊粉发酵成酒精。发酵粗菊芋提取液，不需加其他营养物质，25h内酒精产量87．8%。
7．4其他方面的应用菊粉酶还可直接发酵菊粉制备各种产品，如可制备丙酮丁醇，用于诊断肾脏疾病，控制血糖升高。另外，严奉伟等（1999）已经开始进行菊粉软糖的试制。利用菊粉酶直接发酵菊粉，制作功能性食品和饲料添加剂将有巨大的生产开发潜力。
我国在菊粉酶的研究和应用中遇到的主要困难是：l）产酶成本高，导致应用成本高。主要表现在产酶菌株的菊粉酶产量低，提高了应用成本，制约了低聚果糖在食品工业和饲料工业中的应用。2）菊粉酶酶活测定及酶活力单位在定义上不统一，不利于研究者之间的交流和沟通。酶活力的测定方法对确定菊粉酶活力水平、特异性及归类有重要意义。但在菊粉酶活力测定方法及酶活力单位定义上尚未统一。多数菊粉酶活力测定报道，是以不同聚合度、纯度和浓度的菊粉或蔗糖做底物，测定反应混合物在一定时间内还原糖的增加量。另外，内切型菊粉酶的酶解产物多为低聚果糖和少量果糖，所以按现有的酶活测定法及酶活定义，其酶活水平将普遍比外切型菊粉酶低。因此测定和活力单位定义标准的统一是急需解决的问题
