更深入地思考单细胞测序的原理 | 单细胞测序(系列二)
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深入探索单细胞测序的原理，本篇将聚焦于BD Rhapsody平台，一个基于微孔的单细胞分选系统。此平台通过一个拥有数百万微孔的U型区域，将细胞稀释后散布，确保每个微孔内仅含一个细胞。继而，通过磁珠为细胞内的cDNA添加barcode标签，其结构与10X Genomics的凝胶珠相似。单细胞测序原理与数字PCR模板分选相似，数字PCR通过将DNA模板分子分散至反应空间，实现单分子反应。两种系统——微流控的10X Genomics与微孔的BD Rhapsody——各有优势。选择平台时，细胞捕获效率是关键因素，高效率有助于确保关注细胞的数量，特别是对于细胞数目有限的样本。10X Genomics平台在脆弱细胞如中性粒细胞的捕获上表现欠佳，因此若研究关注此类细胞，推荐采用BD Rhapsody平台。
了解了单细胞测序平台后，接下来探讨文库结构。在获得加上barcode标签的cDNA文库后，通常使用PE150测序模式进行测序。cDNA主峰大小约为1kb，需要对cDNA打断后建库，最终文库包括：测序仪匹配序列P5、测序通用引物Read1、cell barcode标签、UMI标签、靠近cDNA 3’的100bp序列、测序通用引物Read2、测序仪匹配序列P7。理解文库结构有助于进一步探索单细胞测序的应用场景。
单细胞测序可用于细菌、真菌、病毒的RNA测序，只要细胞具有polyA尾巴，即可捕获到mRNA。对于病毒，尤其是有polyA的病毒，可鉴定感染状态并进行差异分析。此外，单细胞测序能揭示SNP、可变剪切和基因融合信息，适用于如KRAS突变的检测。
展望单细胞测序的发展前景，其在生命科学领域的革新性难以替代，尤其在NGS技术之后。未来技术可能难以达到单细胞测序的高度，空间转录组测序技术在这方面具有潜力，但当前仍存在精度、ROI选取和基因覆盖度等问题。新出现的技术如Hi-C、m6A、ATAC-seq等，虽然在某些领域有所应用，但难以全面取代单细胞测序。单细胞基因组、空间蛋白、空间代谢和Olink技术各有优劣，难以满足所有研究需求。未来的发展趋势倾向于时空多组学技术，强调基于单细胞测序的核心能力，以实现全面的生物学问题研究。
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