大黄素对三种人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

中　医　药　学　报　２０１５年４月第４３卷第２期　Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．２，Ａｐｒ．２０１５　Ａｃｔａ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　大黄素对三种人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用　陶永梅，徐丹，王子一，侯立强，王智　（黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨１５０００１）　摘要：目的：观察大黄素（Ｅｍｏｄｉｎ）对人宫颈癌ｓｉｈａ、Ｈｅｌａ和Ｃ３３Ａ细胞株裸鼠移植瘤的抑制作用。方　法：将人宫颈癌ｓｉｈａ、Ｈｅｌａ和Ｃ３３Ａ细胞分别移植至裸鼠皮下，建立Ａ（ｓｉｈａ细胞）、Ｂ（Ｈｅｌａ细胞）和Ｃ　（Ｃ３３Ａ细胞）三种细胞移植瘤模型。第１５天将移植成功的各模型裸鼠随机分为对照组、低剂量组和高　剂量组，每组６只；分别经灌胃给予０．１％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）０．２ｍＬ／Ｘ、大黄素２０ｍｇ／ｋｇ和大黄素　４０ｍｇ／ｋｇ，每日１次，共１４天。给药结束后处死裸鼠，测量肿瘤瘤重和生长体积，并计算抑瘤率和肿瘤体　积抑制率。结果：与对照组相比较，大黄素低剂量组对肿瘤生长体积抑制作用不明显，大黄素高剂量组　肿瘤瘤重和生长体积均受到显著抑制；三种模型中，大黄素对ｓｉｈａ、Ｈｅｌａ两种细胞移植瘤抑制效果优于　Ｃ３３Ａ细胞移植瘤。结论：大黄素具有抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长的作用，对ｓｉｈａ和Ｈｅｌａ细胞移植瘤　作用更为明显。　关键词：宫颈癌；大黄素；抑瘤率　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—２３９２（２０１５）０２—００４４—０２　研究表明大黄素对体外培养的胰腺癌、卵巢癌、肺　癌和白血病等恶性肿瘤细胞生长具有抑制作用　Ｊ。　本研究通过建立三种人宫颈癌细胞裸鼠移植模型，观　察不同浓度大黄素在裸鼠体内对宫颈癌移植瘤生长的　抑制作用，为Ｉ临床应用提供实验依据。　１材料与方法　抗。培养条件为３７ｏＣ、５％的ＣＯ　、饱和湿度。细胞单　层贴壁生长，至７０％～８０％融合时胰酶消化传代。　１．４裸鼠皮下移植瘤建立和给药方案　收集对数生长期Ｓｉｈａ、ＨｅＬａ和Ｃ３３Ａ细胞，　１　０００ｒｐｍ离心５ｒａｉｎ，无血清培养基悬浮沉淀，显微镜　下计数，调整细胞悬液浓度为（１—２）×１０　个／ｍＬ，用　台盼蓝染色镜下观察计算活细胞数大于９０％；在超净　工作台上无菌条件下抽吸０．２ｍＬ细胞悬液，推注人裸　鼠右大腿根部皮下，缓慢退针。依次接种裸鼠，建立Ａ　（ｓｉｈａ细胞）、Ｂ（Ｈｅｌａ细胞）和Ｃ（Ｃ３３Ａ细胞）三种细　胞移植瘤模型。完毕后观察记录裸鼠生长及成瘤　情况。　１．１材料　大黄素购自美国Ｓｉｇｍａ公司；胎牛血清（ＦＢＳ）购　自四季青公司；青一链双抗、胰酶和ＤＭＳＯ购自碧云　天；ＲＰＭＩ一１６４０和ＤＭＥＭ低糖培养基购自Ｈｙｃｌｏｎｅ。　人宫颈癌Ｓｉｈａ、ＨｅＬａ和Ｃ３３Ａ细胞株，购于中国　科学院上海细胞研究所。　１．２实验动物　待第１５天左右将移植成功的各模型裸鼠又随机　分为对照组、低剂量组和高剂量组，每组６只。大黄素　以０．１％的ＤＭＳＯ为溶剂，分别配制成含０．２％和　０．４％浓度，用于灌胃给药。分别经灌胃给予０．１％二　甲基亚砜（ＤＭＳＯ）０．２ｍＬ／只、大黄素２０ｍｇ／ｋｇ和大黄　素４０ｍｇ／ｋｇ，每日１次，连续给药１４天。　１．５取材及指标检测　健康ＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ雌性小鼠，４—６周龄，体质量　ｌ８～２０ｇ，购于北京维通利华实验动物技术有限公司　（合格证号：ＳＣＸＫ京２０１２—０００１），饲养于ＳＰＦ级屏　障系统的洁净层流架内，室温在２５￣Ｃ，相对湿度　４０％一６０％。　１．３细胞培养及药物配制　Ｓｉｈａ：ＲＰＭＩ一１６４０培养基＋１０％胎牛血清＋１％　双抗；Ｈｅｌａ：ＲＰＭＩ一１６４０培养基＋１０％胎牛血清＋１％　双抗：Ｃ３３Ａ：ＤＭＥＭ培养基＋１０％胎牛血清＋１％双　收稿日期：２０１４一ｌ１—２７　修回日期：２０１４—１２—２Ｏ　肿瘤细胞接种后每天观察裸鼠一般状态，每２天　定时专人用游标卡尺测量移植瘤最大长径和最大短　径，并记录。治疗结束后先称取各组裸鼠体质量，然后　处死裸鼠，剥离肿瘤后称瘤重及测量移植瘤大小，绘制　肿瘤生长曲线。按照公式计算指标。　抑瘤率＝（１一实验组平均瘤重／对照组平均瘤　基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究（面上）项目（Ｎｏ．１２５４１７５７）　作者简介：陶永梅（１９７２一），女，硕士，副主任药师，从事中药学研究。　重）ｘ　１００％；肿瘤体积抑制率＝（１一实验组平均瘤体　２０１５年４月第４３卷第２期　Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．２，Ａｐｒ．２０１５　中　医　药　学　报　Ａｃｔａ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　积／对照组平均瘤体积）×１００％；其中肿瘤体积Ｖ＝最　大长径×最大短径的平方／２。　１．６数据统计　实验数据以均数±标准差（　±Ｓ）表示，应用　ＳＰＳＳ１８．０统计软件进行方差分析，组间比较ｔ检验，　Ｐ＜０．０５时为差异有统计学意义。　２结果　表４大黄素对人宫颈癌ＨｅＬａ细胞裸鼠　移植瘤生长体积的影响（　±Ｓ。ｎ＝６）　２．１　大黄素对人宫颈癌Ｓｉｈａ细胞裸鼠移植瘤瘤重和　注：与对照组比较，‘Ｐ＜０．０５，‘‘Ｐ＜０．Ｏ１。　生长体积的影响　与对照组相比，低剂量和高剂量大黄素对人宫颈　癌Ｓｉｈａ细胞裸鼠移植瘤瘤重均有不同程度的抑制作　用，Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１；高剂量组抑瘤率达４９．０８％，　明显高于低剂量。高剂量组对移植瘤生长体积有明显　抑制作用，Ｐ＜０．０１，对肿瘤体积抑制率达４９．６９％。　结果见表１、２。　表１　大黄素对人宫颈癌Ｓｉｈａ细胞裸鼠移植瘤瘤重　的影响（　±ｓ，ｎ＝６）　注：与对照组比较，‘Ｐ＜Ｏ．０５，　Ｐ＜０．０１。　表２大黄素对人宫颈癌Ｓｉｈａ细胞裸鼠移植瘤生长　体积的影响（元±ｓ，ｎ＝６）　注：与对照组比较，‘Ｐ＜０．０５，　‘Ｐ＜０．Ｏ１。　２．２大黄素对人宫颈癌ＨｅＬａ细胞裸鼠移植瘤瘤重　和生长体积的影响　与对照组相比，低剂量和高剂量大黄素对人宫颈　癌ＨｅＬａ细胞裸鼠移植瘤瘤重均有不同程度的抑制作　用，Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１；高剂量组抑瘤率达５４．９８％，　明显高于低剂量。高剂量组对移植瘤生长体积有明显　抑制作用，Ｐ＜０．０１，对肿瘤体积抑制率达５５．５４％。　结果见表３、４。　表３大黄素对人宫颈癌ＨｅＬａ细胞裸鼠　移植瘤瘤重的影响（ｉ±ｓ，ｎ＝６）　注：与对照组比较，‘Ｐ＜Ｏ．０５，　‘Ｐ＜０．０１。　２．３大黄素对人宫颈癌Ｃ３３Ａ细胞裸鼠移植瘤瘤重　和生长体积的影响　与对照组相比，低剂量和高剂量大黄素对人宫颈　癌Ｃ３３Ａ细胞裸鼠移植瘤瘤重均有不同程度的抑制作　用，Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１；高剂量组抑瘤率为３７．４２％，　明显高于低剂量。高剂量组对移植瘤生长体积有明显　抑制作用，Ｐ＜０．０１，对肿瘤体积抑制率达３７．４９％。　结果见表５、６。　表５大黄素对人宫颈癌Ｃ３３Ａ细胞裸鼠　移植瘤瘤重的影响（　±Ｓ，ｎ＝６）　注：与对照组比较，‘Ｐ＜０．０５，‘‘Ｐ＜０．叭。　表６大黄素对人宫颈癌Ｃ３３Ａ细胞裸鼠移植瘤　生长体积的影响（　±ｓ，１１＝６）　注：与对照组比较，‘ｐ＜０．０５，　Ｐ＜０．０ｌ。　３讨论　宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染尤其　是高危型ＨＰＶ１６／１８关系密切，常引起癌前病变或癌　变　。在宫颈癌的发生发展中ＨＰＶ病毒的Ｅ６、Ｅ７　基因起着重要的作用，在Ｅ７的刺激下，Ｅ６基因可以　抑制ＨＰＶ阳性细胞的凋亡效应，使细胞异常生长并最　终导致基因异常的细胞生长失去控制而产生癌变＿４　Ｊ。　通过抑制ＨＰＶ病毒Ｅ６、Ｅ７癌基因的表达从而对宫颈　癌治疗是目前的新的治疗靶点。本实验所选用Ｓｉｈａ、　Ｈｅｌａ细胞株分别是是ＨＰＶ一１６和１８ＤＮＡ阳性的宫颈　癌细胞株，它们活性表达ＨＰＶ１６／１８Ｅ６和Ｅ７蛋白，而　Ｃ３３Ａ细胞株是ＨＰＶ阴性细胞株。　大黄素可以明显增强Ｈｅｌａ细胞的Ｃａｓｐａｓｅ一８、　中　・医　药　学　报　２０１５年４月第４３卷第２期　Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．２，Ａｐｒ．２０１５　４６・　Ａｃｔａ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　Ｃａｓｐａｓｅ一９和Ｃａｓｐａｓｅ一３表达，并呈剂量依赖性，表　明其具有诱导Ｈｅｌａ细胞凋亡作用　Ｊ。本实验表明：与　相应对照组相比较，大黄素低剂量组对肿瘤生长体积　抑制作用不明显，大黄素高剂量组肿瘤瘤重和生长体　积均受到显著抑制；三种模型中，大黄素对ｓｉｈａ、Ｈｅｌａ　ｎｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｒｈｕｂａｒｂ［Ｊ］．Ｍｅｄ　Ｒｅｓ　Ｒｅｖ，２００７，２７（５）：６０９—３０．　［２］Ｄｕｃｎｓｉｎｇ　Ｓ，Ｍ　ｕｎｇｅｒ　Ｋ．Ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ　ａｂｎｏｎｌｌ　ａ　ｌｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｉｎ—　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍ　ａｖｉｒｕｓ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ　Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ　Ｒｅｓ，２００３，５５：２４４—２６５．　［３］Ｄａｌｓｔｅｉｎ　Ｖ，Ｒｅｉｔｍｕｌｌｅｒ　Ｄ，Ｓａｕｔｉｅｒｅ　Ｊ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｌｅｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｐｒｅｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｎ　ａ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｅｎｅｆｉｔｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｆｏｒ　两种细胞移植瘤抑制效果优于Ｃ３３Ａ细胞移植瘤。大　黄素具有抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长的作用，对ｓｉ．　ｈａ和Ｈｅｌａ细胞移植瘤作用更为明显，推测可能与其　抑制ｓｉｈａ和Ｈｅｌａ细胞ＨＰＶ１６／１８的Ｅ６、Ｅ７基因表达　有一定关系。　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍ　ａｖｉｍｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃ　ａｎｃｅｒ，２００４，４０：１２２５—１２３２．　［４］Ｚｕｒ—Ｈａｕｓｅｎ　Ｈ．Ｐａｐｉｌｌｏｍ　ａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ：ｆｒｏｍ　ｂａｓｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｔｏ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ，２００２，２（５）：３４２—３５０．　［５］　王耀先，郝惠南，陈秀玮，等．大黄素对人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞Ｃａｓｐａｓｅ　一３、Ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｃａｓｐａｓｅ～９表达的影响［Ｊ］．中国中医药科技，　２０１３，２０（３）：２３８．　参考文献：　［１］Ｈｕａｎｇ　Ｑ，Ｌｕ　Ｇ，Ｓｈｅｎ　ＨＭ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａｎｔｈｒａｑｕｉ．　基于原子力显微镜的姜黄素对肺癌细胞机械特性　的影响研究　王晓慧，粟亚，蔡文辉，刘宏，孙力，姜颖，史海蛟　（黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨１５００４０）　摘要：目的：基于Ｈｅｒｔｚ弹性接触模型，基于原子力显微镜（ＡＦＭ）研究姜黄素对肺癌细胞的机械特性　尤其是弹性模量的影响。方法：利用核小体酶联免疫吸附试验检测姜黄素作用后的细胞凋亡，利用　ＡＦＭ检测癌细胞的表面形貌和机械特性。结果：姜黄素明显诱导癌细胞产生凋亡，凋亡细胞的弹性模　量和硬度明显增加。结论：姜黄素诱导细胞凋亡的机制提示细胞骨架的参与，癌细胞的硬度增加可能进　一步抑制细胞的远处迁移和运动。　关键词：姜黄素；原子力显微镜；肺癌；机械特性；凋亡　中图分类号：Ｒ２８４．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—２３９２（２０１５）０２—００４６—０３　姜黄素是从姜黄根茎当中提取分离出来的一种天　用原子力显微镜技术，在纳米水平上研究姜黄素对肺　癌细胞机械特性的影响。　１材料与方法　然多酚类化合物，国内外的大量研究表明，它具有显著　的抑制癌细胞增殖的作用　Ｊ。目前对于姜黄素的研　究主要集中在抗癌机理上，包括引起细胞凋亡的途径、　１．１药物与试剂　姜黄素、小牛血清（Ｓｉｇｍａ公司）；ＤＭＥＭ细胞培养　基（Ｇｉｂｃｏ公司）；胰蛋白酶（Ｄｉｆｅｏ公司）；细胞培养板　所作用的细胞信号通路如ｍＴＯＲ／ｐ７０ｓ６ｋ通路和细胞　外信号调节激酶（ＥＲＫＩ／２）信号通路等等　。原子力　显微镜（ＡＦＭ）作为一种新发展的检测技术，可以实现　在微纳米水平上对样品进行表征，能在生物标本的生　理环境比如水环境下进行检测，对样品的损伤小且分　（Ｏｒａｎｇｅ公司）；青霉素和链霉素（哈尔滨制药总厂）。　１．２细胞系　人肺癌细胞系ＮＣＩ—Ｈ５２０由哈尔滨工业大学生　命科学与技术学院馈赠。　１．３实验仪器　原子力显微镜Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎ３１００（ＶＥＥＣＯ公司）；弹　辨率高，可以对样品进行实时的动态检测。本研究利　收稿日期：２０１４—０４—０４　修回日期：２０１４—０５—１０　基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（１１５５１４６２）　作者简介：王晓慧（１９８０一），女，硕士研究生，讲师，主要从事中医药抗　肿瘤研究。　性系数为０．０４６　Ｎ／ｍ的Ｖ型镀金针尖（ＡＰＰ　ＮａＮｏ公　司）；自行设计并安装的温度控制仪；酶标仪（Ｂｉｏ—　Ｒａｄ公司）；细胞培养箱（ＧＣＡ公司）。