16SrRNA基因在诊断慢性非细菌性前列腺炎中的应用

——－——２２０——－——　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａ耶，Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００７。Ｖｏｌ　ｌｌ，Ｎ０．２　文章编号：１００ｒ７—４２８７（２０Ｃｒ７）ｏ２—０２２０—０３　１６ＳｒＲＮＡ基因在诊断慢性　非细菌性前列腺炎中的应用　任应鹏，喻长法，张仙森　（台州市第一人民医院，浙江台州３１８０２０）　．摘要：目的探索快速可靠的检测慢性非细菌性前列腺炎细菌感染的新方法。方法应用ＰｅＲ方法检测７０例　慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液和尿道拭子中细菌１６ＳｒＲＮＡ基因。用ＰｅＲ技术扩增实验室保留株１Ｏ株的　１６ＳｒＲＮＡ基因，以人类基因组ＤＮＡ、ＨＢＶ－ＤＮＡ和白色念珠菌为对照，检测该方法的特异性；采用倍比稀释法进行该方　法的灵敏度检测。结果细菌１６ＳｒｔｌＮＡ基因的检出率在前列腺液中和尿道拭子中分别为５４．３％和７．１％，差异有显　著意义（Ｐ＜０．０１）。对所测细菌株均获得９２０　ｂｐ扩增产物，而与人基因组ＤＮＡ、ＨＢＶ．ＤＮＡ和白色念珠菌无交叉反应；　ＰｅＲ最低能检测１．５　１０６／Ｌ大肠杆菌ＤＮＡ。结论慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液中有细菌１６ＳｒｔｌＮＡ基因的　检出。其病因可能与细菌感染有关。ＰｅＲ具有快速，特异性和敏感性高的特点。关键词：１６Ｓ核糖体核糖核酸；聚合酶　链反应；前列腺炎　中图分类号：１１６９７　．３３　文献标识码：Ａ　Ａｐｐｌｉｅ￣ｏｆ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎ０ｓｉｓ　ｏｆｃｈｒｏｎｉｃ　ａｂａｅｔｅｒ￣ｌ　ｐｒＤｓ蛐　ＲＥＮＩｑｎｇ－ｐｅｎｇ，ｌ，　ｃ￣－ｆａ，ＺＩｔＡＮＣ，Ｘｉａｎ－　３ｅ　．（　￡ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　ｈｏｓｐｌ，ｔｏｌ　ｏｆＴａｉ如ｕ，Ｔａｉ￣ｕ　３１８０２０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂ！血＿ａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｉｔｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｔｅｌｌａｂｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｅｈｍｎｌｅ　ａｂａｅｔｅｆｉａｌ　ｐｍｓｔａｔｉ－　ｔｉｓ．Ｍｅ￣ｌｓ　ＰｅＲ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｉｎⅡｌｓｓ　ａｎｄ　ｕｒｅｔｈｒ￣ｓｗａｂｓ　ｏｆ７０　ｍｉｅｎ　ｗｉｔｈ　ｅｈｗｎｉｃ　ａ！￣ｅｔｅｒｉａｌ　ｐｒ￣ｔａｔｌｔｌｓ；１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｔｅｎ　Ｉ￣ｅｔｅｒｉａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ（＝Ｒ，ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ、ＨＢＶ－ＤＮＡ　ａｎｄ　ｅ￣ｔｉｄａ　ａｌ－　Ｎｅａｎｓ缸∞ｍ　她；　￣ｍｉｔＭｔｙ　ｔｅｓｔ　ｗ踞ｄｏｎｅ　ｂｒｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈ￣ｔ　ｏｆ　ｇｒａｄｕａｌ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ．　ｕＨｓ　Ｐ￣ｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｂａｅｔｅｒｉｅｌ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｉｎＥＰＳｓ　ａｌｌｄ　ｕｒｅｔｈｒａｌ　ｓｗａｂｓ　ｓａ【ｌｌｐｌｅｓｗｅｒｅ　５４．３％ａｎｄ　７．１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｐｅｃｉｅｓｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ９２０　ｂｐｉｎｋｎｇｔｌｌ，ｂｕｔ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅＤＮＡ、ＨＢＶ－ＤＮＡ　ａｎｄ　ｅａｎｄｉ＆ａｌｂｉｅ￣ｓ　ｓｌ￣ｗｅｄ　ｎｏ　ａｍｐｌｉｉｆｅ￣ｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｓｅｎ－　ｓｉｉｆｖｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｄｅｔｅｃｔ　ａｓ　ｌｏｗ　ａｓ１，５　１０￣／Ｌ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡ．Ｃｏｎｄｕｄ帆　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｉ　ｈｏｂ　ｂｅｅｎ　ｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ　ＥＰＳ　ｏｆｌ￣ｄｅｎｔｓｗｉｔｈ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ａｂａｅｔ￣ａｌ　ｐｍｓｔａｔｉｔｌｓ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｉｎｆｅｅ￣ｎｉｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｅｄｅｄｔｏ　ｃｈｌ切１ｉｃ￣ｅｔｅｒｉａｌ　ｐｍｓｔ￣ｉｔｉｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌ　０ｆ　Ｐ（＝Ｒ　ｉｓ　ｍｐｊｄ　ａｎｄ　ｈｉｇ｝ｄｙ　ｓｐｅｅｉｔ￣ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ．　１（ｅｙ　ｗｏｒｄｓ：１６ＳｒＲＮＡ；ｐ０１）ｒｒｒｌｅｒａｓｅ　ｅｌａｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；ｐｒ￣ｔａｔｉｔｉｓ　（Ｃｈｉｎ　Ｊｌａｂ晰，２０Ｏ７，１１：０２２ｏ）　检出机体内存在病原菌是诊断细菌性感染疾病　腺炎的患者７Ｏ例，年龄１８—６４岁，平均３４．５岁。　的重要指标。到目前为止，临床确立细菌性感染的　１．１．２标本收集和保存在无菌条件下取尿道分　诊断仍依赖于细菌培养法，但有些细菌在常规和特　泌物拭子和前列腺按摩液，将尿道拭子和前列腺液　殊环境中很难生长，不易通过细菌培养来鉴定。近　分别用无菌水洗脱后一２０℃保存。　年来分子生物学技术迅速发展，以聚合酶链反应　１．１．３菌株和人基因组ＤＮＡ、ＨＢＶ—ＤＮＡ、白色念珠　（ＰＣＲ）技术的应用尤为广泛…。本研究应用ＰＣＲ技　菌来源菌株来源于我院检验科微生物室保存的常见　术特异性扩增细菌１６ＳｒＲＮＡ基因方法，对临床诊断　引起前列腺炎的菌株１Ｏ株，包括：大肠埃希氏菌、肺　为慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液和尿道拭　炎克雷伯氏菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、枯草杆　子作细菌１６ＳｒＲＮＡ基因检测，取得了较好的结果，现　菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，沙门氏菌、志贺　报道如下。　氏菌、溶血葡萄球菌。白色念珠菌、ＨＢＶ—ＤＮＡ和人　１材料与方法　类基因组ＤＮ由台州学院微生物教研室提供。　１．１材料　１．１．４引物设计用ＰＣＲ引物设计软件ｐｒｉｍｅｒ　５．０　１．１．１标本来源标本来源于我院泌尿外科门诊２　设计２条引物。上游为５　ＡＧＡＧＴＩＴＧＡＴＣＣＴＧ．　００５年１月一２００６年１月诊断为慢性非细菌性前列　ＧＣＩ＇￣＿ＡＧ３　；下游为５＂ＣＣＧＷＡＡＴｒＣＣＩＴＩ￣ＡＧＴＩＴ３　，扩　维普资讯 http://www.cqvip.com

中国实验诊断学２ＯＯ７年２月第ｌｌ卷第２期　・－－—－２２１－－－——　增产物长度为９２０　ｂｐ。　１．１．５试剂与仪器ＤＮＡ提取试剂、ＰＣＲ反应试剂　盒、引物合成均由宝生物工程（大连）公司提供，琼脂　珠菌、ＨＢＶ　ＤＮＡ和人类基因组ＤＮＡ无相应条带，表　明其无相应产物。见图１。　糖购于上海华美生物工程公司，９６ＯＯ型ＰＣＲ反应仪　器购于美国Ｐｅｒｋｉｎ　ｅｌｍｅｒ公司，ＤＹＹ－ＵＩ型稳压稳流　电泳仪为北京六一仪器厂产品，Ｇｅｌ　ｄｏｅ　１０００型凝胶　图象处理系统购自美国ＢＩＯ—ＰＡＤ公司，ＫＲ－ＣＺＴ－Ｂ２　Ｃｌａｓｓ　ＩＩ　Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ　Ｃａｂｉｎｅｔ超净工作台购自杭州科锐净　化成套设备有限公司。　１．２实验方法　１．２．１模板ＤＮＡ提取ＤＮＡ提取试剂盒由大连宝　生物工程公司提供，主要步骤为：１０株实验室保存　待检菌株于血平板上３７℃培养１８—２４小时，挑取　０．５　ｃｍ大小的菌落溶于２００　ｒａＴＥ中，再加入４０Ｏ　ｌ　裂解液。，３　蛋白酶Ｋ混匀，５５℃水浴１　ｈ；加入６００　氯仿混匀，１００００￣／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ，取５００　ｌ上清　液移至１．５　Ｔｎｌ离心管中，加入５００　沉淀液混匀，室　温放置２　ｍｉｎ，１００００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ；吸去上清液，　立即加入１００　ｌ的１．２　ｍｏｌ／Ｌ　Ｎａｃｌ，轻轻震荡至ＤＮＡ　样品完全溶解，加入３　ＲＮＡ酶Ａ，３７℃作用１０　ｍｉｎ　后，再加入３００　４￣Ｃ预冷的无水乙醇，一２０℃放置　１０　ｍｉｎ，１００００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｍｌｎ。弃乙醇层，用７０％　乙醇洗涤１次：倒置室温干燥１０　ａｒｉｎ，１００　１，ＩＥ溶解　ＤＮＡ。前列腺液、尿道拭子ＤＮＡ提取方法同上。　１．２．２　ＰＣＲ反应体系总体积为５０　ｌ。包括：２５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇｃｌ２　４　ｌ，２．５　ｍｎ￣ｌ／Ｌ　ｄＮＴｅ８　４　，１０　Ｂｕｆｆｅｒ　５　，２０　ｗｎｏｌ／Ｌ引物各１　，５　Ｕ／ｕｌ　Ｔａｑ酶０．２５　，模　板５．０　ｌ，加双蒸馏无菌水至５Ｏ　ｌ。９４℃预变性５　ｍｉｎ，９４℃变性３０＂，６０℃退火．４５　，７２℃１　ｍｉｎ共循环　３５次，最后延伸５　ｍｉｎ。　１．２．３　ＰＣＲ扩增产物分析将ＰＣＲ产物３　ｍ与ｌ　ｌ上样缓充液混匀后，加样于１．３％琼脂糖凝胶（含　溴化乙锭），１００　Ｖ电压电泳３０　ｍｉｎ，将电泳后的琼脂　糖凝胶置于凝胶图象分析仪上，紫外线透射扫描观　察并拍照。　１．２．４敏感性检测按倍比稀释法ｌ０倍递减稀释　大肠杆菌并提取其ＤＮＡ，然后ＰＣＲ扩增并电泳，检　测其敏感性。　１．２．５统计学处理数据采用　检验。　２结果　２．１实验室保存的１Ｏ株菌所分离的１６ＳｒＲＮＡ基　因ＰＣＲ扩增结果被检测的ｌＯ株菌进行ＰＣＲ扩增　后，均获得阳性条带，与ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ－２０００相对　照，其扩增产物长度为９２０　ｂｐ。而对照组的白色念　１．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒＤＬ－２（Ｘ￣，２—１１分别为大肠埃希氏菌、肺炎克　雷伯氏菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、金黄色葡　萄球菌、表皮葡萄球菌，沙门氏菌、志胡氏菌、溶血葡萄球菌，　１２—１４分别为白色念珠菌、ＨＢＶ．ＤＮＡ和人类基因组ＤＮＡ，１５　为阴性对照。　２．２　７０例前列腺液和尿道拭子ＰＣＲ扩增结果见　表１。　表１　７０例前列腺液和尿道拭子ＰＣＲ扩增后１６ＳｒＲＮＡ结果　７０例前列腺液１６ＳｒＲＮＡ阳性率为５４．３％（３８／　７０），尿道拭子阳性率为７．１％（５／７０），有显著性差异　（ｐ＜０．０１）　２．３　ＰＣＲ敏感性检测用无菌双蒸馏水按倍比稀　释大肠杆菌悬液，然后提取ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，电　泳后在１．５　１（ｙ５／Ｌ处有条带，其后面继续稀释的无　相应条带，表明ＰＣＲ可检测低至１．５　ｌ（ｙ６／Ｌ。见图２　ｌｌ　ｌＴ　广＿　：ＥＩ’‘　５０’Ｊ　２　・　１’　１　１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｏｒ　×１０　。／Ｌ，４１．５×］Ｏ￣／Ｌ，５．１．５×ｌＯＳ／Ｌ，６１．５×ｍＴ／Ｌ．．，７．１．５　×１０Ｓ／Ｌ．８—１２＜１．５×ｚ０ｓ　维普资讯 http://www.cqvip.com

一２２２—　３讨论细菌感染目前主要的诊断方法为细菌培　养，但由于费时及阳性率低，使其在临床诊断应用上　受到一定限制，特别是一些培养条件较为苛刻的细　菌，一些实验室无法培养出其阳性结果。近年来基　因诊断技术在临床上应用１３趋广泛，特别是ＰＣＲ给　生物医学带来光明的前景。　细菌１６ＳｒＲＮＡ由可变区和保守区交叉排列组　成，保守区序列在所有细菌菌种中高度一致，而可变　区序列则随菌种的不同有较大的变化，本研究利用　１６ＳｒＲＮＡ基因这一特点，在１６ＳｒＲＮＡ基因保守区内　设计了一对引物Ｌ２Ｊ，此引物能够扩增所有细菌的　１６ＳｒＲＮＡ基因相应片段而得到９２０ｂｐ的ＤＮＡ片段。　由于人类基因组ＤＮＡ、白色念珠菌、病毒等都不存　在高度保守的１６ＳｒＲＮＡ序列，所以用此法检测细菌，　不会与真菌，病毒和其它病原体发生交叉反应。从　前列腺液和尿道拭子结果可以看出，前列腺液内检　出细菌１６ＳｒＲＮＡ阳性率显著高于尿道拭子，两者有　显著意义（Ｐ＜０．Ｏ１），说明前列腺液流经尿道时没　有被污染，只要前列腺液内能检出１６ＳｒＲＮＡ，则可认　为其内存在细菌。　慢性非细菌性前列腺炎是泌尿科的一种常见　病　Ｊ，随着生活方式的改变，有不断上升的趋势。由　于其病因不明，临床表现多种多样，个体差异大，给　诊断和治疗带来很大困难，是泌尿外科中较为棘手　的疾病　］。传统的诊断方法中，以细菌培养来划分，　若培养出细菌，则为细菌性前列腺炎；若未培养出细　菌，则为非细菌性前列腺炎。但众所周知，细菌的培　养生长受众多条件的限制，比如：培养前用过抗生索　等药物、培养基、温度、湿度、培养时间、技术人员的　操作熟练程度都起到了不可估量的影响，所以只凭　前列腺液培养来区分细菌性前列腺炎和非细菌性前　列腺炎并不合适。从本次实验可以看出，５４．３％非　细菌性前列腺炎患者的前列腺液中检出了　Ｃｈｉｎ　Ｊ　ｌａｂ　Ｄｉａ即。Ｆｅｂｒｕｓｒｖ。２０ａ７。Ⅷ１１，Ｎｏ．２　１６ＳｒＲＮＡ，说明许多非细菌性前列腺炎患者的前列　腺液中存在细菌【５５，因此有必要对传统的非细菌性　Ｊ前列腺炎做一新的认识。ＰＣＲ技术具有高灵敏度　（最低可达１．５　１（ｙ６／Ｌ），高准确度等诸多优点［６－９】，　能检测出传统培养方法无法检测出的细菌的存在，　指导临床医师经验用药，具有及为广泛的应用前景。　本实验研究表明，１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ技术可作　为慢性非细菌性前列腺炎的病原学存在的诊断依　据，它具有灵敏、快速、准确可靠等诸多优点，因此在　临床中具有广泛的应用价值。　作者简介：任应鹛（１９６９一），男，主管技师，研究生，主要从事　于分子生物学方面的研究。　参考文献：　［１］Ｂｉｎｇｅｎ　ＥＮ。１．ａｍｂｅＷＺｅｃｈｏｖｓｋｅ　Ｐ，Ｍａｒｉａｎｉ．Ｋｍ＇ｋｄｊｉａｖ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｂａｃｔｅｉｒａｌ　ｃｏｕｎｔｓ　ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒｓｏｐｉｎａｌ　ｌｆｕｉｄ　０ｆｗｉｔｈ　Ｉ　１ｉｎ　８［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｅｔ　Ｄｉｓ，１９９０．９（１）：２７８．　［２］Ｋａｗａ￣Ｍ。Ｍａｔ￣ｔｅｍ　Ｅ，Ｋａｎｄａ　Ｈ。ｅｔ　１ａ．１６Ｓ　ｒｉｂｏｓｏｍ　ｌａ　ｌ　ｂａｓｅｄ　ａｎｌａｙ．　８ｉ８　ｏｆｂａｃｔｅｒｉｌａ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｗｌｌｔｃｒ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｐｌｌａＩＴｎ　ａｃｅｕｔｉｃａｌ　１３ｔｉｓｎｕ－　ｆａｅｔｕｒｉｎｇ　ｐｍｅｅｓｓｅｓ　ｂｙＰＣＲ　ａｎｄ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌｅｌｅｔｍｐｈｚｒｅｓｉｓ［Ｊ］．　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｏｒｎ　Ｍｉｃｍｂｉｏｌ，２Ｏ０２．６８：６９９．　［３］郭应禄．李宏军，主编．前列腺炎［Ｍ］．北京：人民军医出版社，　２ＯＯ３．７９—９８．　［４］周立权，沈明．慢性骨盆疼痛综合症前列腺液１６ＳｒＲＮＡ基因检　测及临床意义［Ｊ］．中华男科学．２０Ｏ３，９（４）：２６３．　［５］胡小朋，白文俊．慢性前列腺炎细菌及免疫学研究［Ｊ］．中华泌尿　外科杂志，２／）０２，３２（１）：２９．　［６］刘政军，朱雪阳，蒋先镇．慢性非细菌性前列腺炎患者前列腺液革兰　阴性菌１６ＳｒＲＮＡ基因检测［Ｊ］．中华泌尿外科杂志．砌．２４（７）：枷．　［７］Ａｓｈｏｋ　Ｋ　Ｙａｄａ，，，ＣＧ　Ｗｉｌｓｏｎ，ＰＬ　ｈｓｓａｄ，ｄ　１ａ．Ｐｏｌｙｒａｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｌｌ￣ｇｔｉｏＩＩ　ｉｎ　ｒａｐｉｄｄｉａｇｎｏｓｉｓ　０ｆ眦ｍａｔ日】ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｄｅｉｎｅ　Ｐｅｄｉａｔｉｒｃｓ，２ＯＯ５．４２：８６１．　［８］ＢａｒＩｌｃＢ　，Ｂｈｓｔａｒａ　Ｓ，Ｔｕｂｂｓ　ＲＳ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｌｙｒａｅｒａｓｅ　ｅ￣ｌｉｕ　ｔ￣ｖａ．ｇｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　０ｆ　ｃｅｒｅｂｒｓｏｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｓｈｕｎｔ　Ｏｒ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｓｏｔｏｍｙ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　［Ｊ］．Ｎｅｕｒｃｍｔｒｇｅｒｙ，２００５。５７（６）：１２３７．　［９］Ｓｈａｎｇ　Ｓ，Ｃｈｅｎ　Ｇ，Ｗｕ　Ｙ，ｅｔ　１ａ．Ｒａｐｉｄ　ｉｄａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｌａ　ｓｅｐｓｉｓ　ｉｗｔｈ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｃｍａｒｒａｙ　ｈｙｂｒｉｉｄｚａｔｉｎｏ　ｉｎ　１６ＳｒＲＮＡ　ｔ￣ｅ［Ｊ］．Ｐｅ－　ｄｉａｔｒ　Ｒｅｓ，２ＯＯ５，５８（１）：１４３．　（收稿日期：２００６一ｏ４—２３）