16S rDNA与gyrB序列联合法鉴定一株蜡样芽孢杆菌

卢佳琦;李市场;王大红;刘永康;陈龙

【摘 要】以从凝结芽孢杆菌活菌片中分离得到的一株YSSNJ-005菌株为目的菌株,经16S rDNA与gyrB序列联合法对其精确鉴定.研究结果表明:经过16S rDNA序列分析,初步判定菌株YSSNJ-005属芽孢杆菌属.由gyrB基因序列同源性分析及构建系统发育树对菌株YSSNJ-005继续鉴定.BLAST在线对比可知:菌株YSSNJ-005为芽孢杆菌属,且与蜡样芽孢杆菌标准菌株Bacillus cereus ATCC14579基因序列同源性达100％,可精确断定菌株YSSNJ-005是蜡样芽孢杆菌. 【期刊名称】《河南科技大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2018(039)001 【总页数】6页(P73-77,83)

【关键词】蜡样芽孢杆菌;序列分析;系统发育树;菌种鉴定;16S rDNA 【作 者】卢佳琦;李市场;王大红;刘永康;陈龙

【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471023 【正文语种】中 文 【中图分类】Q93-331

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为兼性好氧、革兰氏阳性菌(G+)，属芽胞杆菌科芽胞杆菌属。其生长温度为20～45 ℃，10 ℃以下不生长或者生长较慢，在食物、泥土、动物肠道及空气等处普遍存在。蜡样芽孢杆菌与人类关系非常紧密，不仅能够引起食物中毒，也能产生多种酶类及营养物质，增进机体消化吸收[1]。除此之外，它还可以产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境等[2]。目前，中国蜡样芽孢杆菌的检测主要依赖于传统的生理生化实验，过程繁琐，所耗时间长，而且大多实验结果由主观来判断，易引起误差[3]。因此，对蜡样芽孢杆菌可靠、快速的分类和鉴定在微生物学研究中是必要的。文献[4]报道的16S rDNA和gyrB基因序列联合鉴定法不仅科学，而且也是国际上识别新分离物种身份的标准。本文由菌落形状及生化特性对菌种进行初步判定，然后采用16S rDNA与gyrB序列联合法继续对一株蜡样芽孢杆菌分析鉴定[5]。 1.1 材料

“爽舒宝”牌凝结芽孢杆菌活菌片，青岛东海药业有限公司生产;营养琼脂培养基，上海研生实业有限公司生产。 1.2 方法

1.2.1 菌株的分离培养

制备稀释液：称量凝结芽孢杆菌活菌片粉末10 g，添加在存有玻璃珠和90 mL无菌生理盐水的250 mL容量的锥形瓶中，在漩涡混合仪上振荡1 h，使凝结芽孢杆菌活菌片粉末与生理盐水均匀混合，即配成质量分数为10%的菌悬液，之后继续连续6次梯度稀释菌悬液。

平板培养：在1×105 Pa、30 min条件下，把灭菌后的营养琼脂(nutrient agar,NA)液体培养基倾倒于灭菌平皿中，在无菌环境下待其凝固后，用移液枪取不同稀释度的凝结芽孢杆菌活菌片稀释液各0.1 mL于营养琼脂固体平皿中，涂布使之均匀分散。然后，把涂布过的带菌平皿倒置在37 ℃培养箱中恒温培养24 h。

为方便进行后续检测，将分离得到的菌株命名为YSSNJ-005。 1.2.2 菌株的生理生化鉴定

乙酰甲基甲醇试验、淀粉水解试验、硫化氢(H2S)试验、精氨酸双水解酶及糖醇类发酵试验方法参考文献[6]。

1.2.3 菌株YSSNJ-005的分子生物学鉴定 (1)16S rDNA序列分析法鉴定所分离菌株种属

16S rRNA是核糖体RNA的一个亚基，16S rDNA是编码该亚基的基因。16S rDNA是种属鉴定的标准标识序列。由于对16S rDNA的分析[7]，Woese与Olsen等构建了系统发育进化树。因为其敏锐、精确、高速的优点，16S rDNA序列已被普遍运用于细菌遗传特性及归类研究。GenBank数据库现有丰富的细菌16S rDNA序列，是细菌判定和分类的有效参考系统[8-9]。

(Ⅰ)菌株YSSNJ-005基因组DNA提取。根据DP302细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书方法来提取YSSNJ-005菌株基因组DNA。 (Ⅱ)16S rDNA 通用引物序列为16S(F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16S(R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

(Ⅲ)16S rDNA PCR反应体系。采用16S rDNA 通用引物进行PCR扩增。采用50 μL PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP (2.5 U/μL) 4 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，模板 2.5 μL，16S(F)和16S(R)各1 μL，加去离子水补足到50 μL。反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸 100 s，进行30个循环，之后72 ℃延伸7 min扩增结束。PCR扩增产物于4 ℃保存。

(Ⅳ)PCR产物电泳。于质量分数为1%的琼脂糖凝胶上90 V电泳1 h，紫外分析仪观测结果且拍照。

(Ⅴ)PCR产物凝胶回收纯化。根据TransGen胶回收试剂盒(EG101)说明书的详细

步骤进行PCR产物的回收纯化。

(Ⅵ)PCR纯化产物测序及同源性分析。凝胶回收产物的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。得到序列信息后登陆美国国家生物技术信息所(national center for biotechnology information,NCBI)页面，利用局部相似性基本查询工具(basic local alignment search tool,BLAST)对比分析所测得的序列和

GenBank中现有细菌的16S rDNA序列，挑选相似性序列，利用MEGA5.0软件建立菌株系统发育树，分析同源性关系较近的菌株[10-11]。 (2)利用gyrB基因法进一步鉴定所分离的菌株YSSNJ-005

由于16S rDNA分子较小，信息量具有局限性，仅能区别属水平上的细菌，无法说明关系较近的种间关系[12]。很多细菌中都有gyrB基因。gyrB基因是一个蛋白编码基因，呈单拷贝，在细菌系统发育分析和鉴别中常被用到[13]。故联合gyrB序列法对分离菌株YSSNJ-005进行进一步确认。

(Ⅰ)gyrB引物：上游引物：5’-ATTGGTGACACCGATCAAACA-3’，下游引物：5’-TCATACGTATGGATGTTATTC-3’。

(Ⅱ)gyrB基因序列的PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55～62 ℃(优化后)、1 min，72 ℃、2 min，30个循环；72 ℃、10 min。4 ℃保存产物。使用NCBI数据库中的Blastn工具，在GenBank中进行同源性序列检索，挑选同源性最近的基因序列，运用MEGA5.0邻接法构建系统发育进化树[14]。

2.1 菌株的分离筛选

初步在NA培养基上经划线纯化，37 ℃培养24 h后菌株的菌落及菌株显微镜下形态见图1。由图1a可看出：菌落呈近圆形，表面蜡状，平伏，不透明，边缘不整齐。对分离出的菌株YSSNJ-005进行芽孢化染色，从图1b中可看出：在光学显微镜下观测到菌体为G+，呈杆状，(0.8～0.9) μm×(1.8～3.5 )μm，单个、成

对或链状排列；芽孢特点是椭圆形，近端生或中生，孢囊膨大。 2.2 菌株的生理生化特征

表1是菌株YSSNJ-005的生理生化特征。该菌株能够分解淀粉，明胶水解、精氨酸双水解酶等实验结果均呈阳性。菌株YSSNJ-005能利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、纤维二糖等，但无法利用棉籽糖。参照文献[15]可以发现，以上特征与芽孢杆菌属极为相似。

2.3 菌株YSSNJ-005的分子生物学鉴定 2.3.1 16S rDNA法PCR扩增菌株

通过上述16S rDNA通用引物PCR扩增菌株YSSNJ-005的16S rDNA片段，电泳结果见图2。图2中:1号为Marker参照，2号为菌株YSSNJ-005的16S rDNA扩增片段。从电泳结果可知：条带清晰，没有拖尾情况。PCR扩增产物的分子量为1.4 kb左右，与16S rDNA片段大小符合，可进行后续实验。 2.3.2 菌株YSSNJ-005的16S rDNA鉴定及系统发育树构建

经由生工生物工程(上海)股份有限公司对菌株YSSNJ-005 16S rDNA的PCR产物测序，结果见图3。由图3可知：其16S rDNA序列共1 401 bp。将测得的16S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中，进行BLAST在线分析。运用MEGA5.0软件，将测出的序列与16S rDNA序列进行同源性对比，邻位连接法构建菌株YSSNJ-005与有关种的16S rDNA序列的菌株发育树(相似度重复计算1 000次)。菌株YSSNJ-005的16S rDNA系统发育树如图4所示。图4中，上标T表示模式菌株，括号内的字母和数字组合为检索号。

由图4可看出：菌株YSSNJ-005和进化树上与其相邻的几株芽孢杆菌的16S rDNA的同源性达到80%以上。文献[16]指出：通常在种的分类等级上，若两个分类单位间的16S rDNA序列的同源性高于97.5%，则可把这两个分类单位归于同一个种。根据图4中16S rDNA序列分析结果，可把菌株YSSNJ-005初步归类

为芽孢杆菌属，然而无法确定该菌株具体为哪一种菌。 2.3.3 gyrB基因PCR扩增片段

把提取的菌株YSSNJ-005基因组DNA继续进行gyrB基因PCR扩增，扩增产物的电泳结果见图5。由图5可看出：条带明显、没有拖尾现象，测序后gyrB基因序列片段长度为1 200 bp。

2.3.4 gyrB基因BLAST结果系统发育树分析

图6为根据gyrB基因序列对比结果建立的系统发育树。本文挑选了相似度到达90%以上的多个不同菌株基因序列进行分析，构建系统发育树。由图6可知：菌株YSSNJ-005与蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus ATCC14579标准菌株同源性达100%。因此，利用gyrB基因序列结合16S rDNA可准确鉴定菌株YSSNJ-005为Bacillus cereus。

常用菌种的分类地位主要从菌落的形态特征及一系列生理生化试验来确定[17]。细菌鉴定手册是菌种鉴定中常用的参考手册。传统的鉴别方法步骤繁琐、鉴定过程较慢、大多性状由主观来判断，易给试验结果判定带来误差[18]。16S rDNA基因序列普遍应用于细菌鉴别或构造细菌的系统发育进化树，以弥补现有方法的缺陷。然而鉴于16S rDNA序列间过高的相似度，此方法难区别亲缘关系接近的菌种[19]。近年研究发现gyrA基因、gyrB基因可弥补16S rDNA/RNA基因法的缺点。本文通过菌落形状、生理生化测定、结合16S rDNA和gyrB基因有效确切地鉴别了菌株YSSNJ-005。

由于传统菌种鉴别方法的局限性，通过菌落形状、生理生化测定及16S rDNA基因序列法的结果，虽不易明确菌株YSSNJ-005的分类地位，但可初步判定菌株YSSNJ-005属芽孢杆菌属。通过16S rDNA联合gyrB基因序列法，构建系统发育树，在BLAST对比结果中，挑选了许多相似性90%以上的基因序列的不同菌株当作分析目标。菌株YSSNJ-005与蜡样芽孢杆菌标准菌株Bacillus cereus

ATCC14579的gyrB基因序列同源性达100%。综上可断定菌株YSSNJ-005是芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌。

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