血管抑制基因治疗对增生性瘢痕的病理学影响

血管抑制基因治疗对增生性瘢痕的病理学影响

目的：研究血管抑制基因治疗对兔耳增生性瘢痕的病理学影响。方法：复制兔耳增生性瘢痕，待创面上皮化后10天瘢痕组织局部多点注射基因重组血管抑制剂Ad-METH1（血管生成抑制因子-1，extracellular protein with metalloprotease and thrombospondin1 domains），30天后观察兔耳瘢痕组织形态、超微结构的变化。 结果：Ad-METH1注射后30天，兔耳瘢痕组织学染色显示微血管分布明显减少，超微结构显示内皮细胞肿胀、变性，部分血管丧失功能，成纤维细胞增殖及分泌活性明显降低。结论：Ad-METH1对增生性瘢痕的形成有明确的抑制作用，血管抑制基因治疗有望为增生性瘢痕的防治提供新的方法。

Abstract:ObjectiveTo investigate the pathological influence of antiangiogenesis gene therapy on hypertrophic scar of rabbits’ ears.Methods The hypertrophic scar of rabbits’ ears was reproduced. At the 10th day after epithelization on the surface of wound, Ad-METH1 was injected into parts of scar tissue on different points. 30 days later, changes of structure and ultrastructure of scar tissue of rabbits’ ears were observed.ResultsAt the 30th days after injection, H&E deying of the hypertrophic scar of rabbits’ ears showed that the distribution of micrangium declined distinctly. Ultrastructure revealed that endotheliocytes were tumefied and destructured, some blood vessels lost functions and proliferation and secretion of fibroblast reduced markedly.Conclusion Ad-METH1 has marked inhibitory function on the form of hypertrophic scar. Antiangiogenesis gene therapy could provide a new method to prevent and cure hypertrophic scar.

Key words: gene therapy; antiangiogenesis; hypertrophic scar; ultrastructure

众多的临床观察及实验研究显示，血管及其相关因子的表达与增生性瘢痕的形成有着密切的关系，通过血管生成抑制或其相关促成因子的拮抗治疗，可有效抑制瘢痕增生[1-2]。随着基因技术研究的不断深入，基因治疗在增生性瘢痕防治研究领域也取得了一定的进展。本研究拟利用携带高效血管抑制因子METH1的腺病毒表达载体pAdEasy-meth1，转染兔耳增生性瘢痕[3]，研究血管抑制基因治疗对兔耳增生性瘢痕组织形态、超微结构的影响。

1材料和方法

1.1 实验分组及模型复制：选日本大耳白兔l0只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg/只，人工混合饲料喂养。随机将每只兔子的一只耳归入实验组，另一只耳归入对照组，每组各l0只。实验组与对照组均进行模型复制[4]，速眠新1ml／kg，兔耳缘静脉注射麻醉后，常规消毒铺单，于兔耳腹侧面用打孔器复制6个直径约1cm的圆形创面，去除皮肤全层，保留软骨，待其自然愈合。

1.2 基因转染：待兔耳创面上皮化后10天实施。① 实验组行兔耳瘢痕局部多点注射pAdEasy-meth1重组腺病毒质粒；②对照组注射等量空腺病毒。

1.3 指标观察：30天后观察两组瘢痕形态外观、组织结构、超微结构的差异，分析基因转染血管抑制治疗对兔耳增生性瘢痕的影响。

1.3.1 外观形态：观察对比实验组与对照组瘢痕组织颜色、质地、厚度的差异。

1.3.2 组织形态：分别切取实验组与对照组瘢痕，取材部位位于瘢痕组织中央与周边交界区，随即将其固定于Bouin氏液12h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋后制成厚度约5μm的石蜡切片，苏木素-伊红染色，200×光镜下对比分析两组瘢痕组织学差异。

1.3.3 超微结构：取材部位同前，将标本切割为大小为1mm×3mm组织块，用4℃预冷的3%戊二醛固定24h，1%锇酸固定，系列乙醇－丙酮脱水，环氧树脂包埋，常规制作切片，电子染色，在透射电镜下采用不同放大倍数对瘢痕组织超微结构进行观察。

2结果

2.1 外观形态：实验组pAdEasy-meth1注射后30天，瘢痕颜色接近正常兔耳肤色，表面平整，质地接近正常。对照组瘢痕明显高出兔耳腹侧皮面，呈淡红色，质地坚硬。两组瘢痕形态外观有显著差异。

2.2 组织形态：pAdEasy-meth1注射后30天，实验组瘢痕微血管分布明显减少，成纤维细胞散在，胶原排列有序。对照组瘢痕组织中见大量成纤维细胞，血管分布丰富，浅层组织胶原纤维粗大、排列紊乱。实验组与对照组组织学存在显著性差异。

2.3 超微结构：pAdEasy-meth1注射后30天，瘢痕组织成纤维细胞核仁不明显，内质网数量减少、结构不清，血管腔狭窄、内皮细胞肿胀，空泡化明显，胞质密度低，微绒毛消失(图1、2)。对照组成纤维细胞核仁明显，胞质中粗面内质网发达，线粒体丰富，蛋白分泌物较多，瘢痕组织毛细血管基膜完整，血管周围可见扁平状周皮细胞（图3、4）。

3讨论

增生性瘢痕是整形外科的常见病症，由于发生机理尚不十分清楚，目前除手术外尚无非常有效的防治手段，研究增生性瘢痕的发生机理，探索行之有效的非手术防治方法有着重要的意义。

越来越多的研究显示，血管生成与增生性瘢痕的形成有着密切的关系[5,8,9]。在皮肤软组织创伤后所经历的炎症反应、肉芽组织形成、组织重塑、瘢痕形成等阶段中，血管及其相关生物活性物质发挥了重要作用，其中TGF-β、VEGF、FGF和IGF等生长因子参与并调控了创伤修复的过程[6-7]，影响着伤口的愈合及增生性瘢痕的形成。研究还显示，处于增生期的瘢痕组织血管密度高于成熟期瘢痕[5,8]，通过激光多普勒对瘢痕组织微循环检测显示，增生期瘢痕组织微循环灌注高于成熟期[9-10]，通过对瘢痕组织血管的抑制可促进瘢痕的软化[1-2]，提示血管生成抑制方式防治增生性瘢痕的可行性。

本研究中，我们选用了一种新型的血管抑制剂METH-1作用于兔耳增生性瘢痕，研究血管抑制治疗对增生性瘢痕的影响。METH-1是TSP-1的结构类似物， TSP-1是生理条件下最主要的血管生成抑制因子，可以抑制内皮细胞的增殖和迁移[11]，TSP-1由于分子量大，不易制备，易被蛋白酶降解等特点，其应用受到了一定的限制。体内、外实验表明，METH1可通过对内皮细胞的直接作用抑制血管生成过程，其作用比TSP-1强15～20倍[11-12]。我们利用基因重组技术成功构建了携带METH1的腺病毒载体pAdEasy-meth1，并在293细胞中完成病毒的重组、包装[3]。我们将该载体转染增生性瘢痕动物模型，研究了基因转染血管抑制对增生性瘢痕的影响。

结果显示pAdEasy-meth1注射后30天，与对照组相比，兔耳瘢痕增生受到明显抑制，组织学染色显示实验组瘢痕血管减少，成纤维细胞及胶原分布为成熟期表现，超微结构观察发现，成纤维细胞增殖及分泌活性差，血管内皮细胞出现肿胀、变性，部分血管丧失功能，提示 pAdEasy-meth1对瘢痕组织血管生成、组织增生抑制的有效性。

METH1作为血管抑制剂通过抑制血管生成抑制的方式抑制增生性瘢痕的形成，考虑与其对瘢痕组织中血管及其相关因子的抑制有关，该结果证实了METH1抑制增生性瘢痕的可行性，有望为增生性瘢痕的防治研究提供新的方法。

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