植物甾醇酯的分析方法

分析检测　叶ｒ　ｌ中外食品　植物甾醇酯的分析方法　周丽平刘明徐维锋吴文忠　（大连医诺生物有限公司，辽宁大连１１６１００）　摘要：建立了植物甾醇酯的分析方法，包括植物甾醇酯中的总甾醇、游离甾醇和甾醇酯含量的分析。样品通过与ＫＯＨｄ￣　化，提取出植物甾醇，进行气相分析。采用内标法测定总甾醇和游离甾醇含量，通过计算得到甾醇酯含量。结果表明，此方　法经济简单，分离度和重复性较好，准确度高。　关键词：植物甾醇酯总甾醇内标法　中图分类￣－：ＴＱ６４５．９　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—５３３６（２０１３）１８－００１６—０３　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｆｏｒ　ａ￣ｓａｙｉｎｇ　ｐｈｙｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａｓｓａｙｉｎｇ　ｏｒ　ｆｔｏｔａｌ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ，ｌｆｅｅ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ　ａｎｄ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓａｐ０ｎｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＫＯＨ，ｔｈｅｎ？ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｓｓａｙｅｄ．Ｗｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆｔｏｔａｌ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ　ａｎｄ　ｆｒｅｅ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆｐｈｙｔｏｓｔｅｍｌ　ｅｓｔｅｒｓ　ｗａｓ　ａｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔｔｈｅ　ｅｃｏｎｏｍｙ　ｏｆｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｇｏｏｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒｓ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒｓｉｎｔｅｍａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ　植物甾醇是从植物油工业副产物中得到的一种具　１材料与方法　有多种生理活性的天然活性物质，主要功效在于可降　低人体低密度脂蛋白水平【１１并有抗癌、抗动脉粥样硬　１．１材料与试剂　无水乙醇（ＡＲ）、ＫＯＨ（ＡＲ）、硫酸（ＡＲ）、丙酸酐（ＡＲ）、　化、抗氧化和抗炎等功能【２】。但是由于植物甾醇的疏水　吡啶（ＡＲ）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；植物　性和弱油溶性导致了其在人体内的溶解性和生物利　甾醇（９５）购于江苏春之谷生物制品有限公司；植物甾　用性较差［３１。研究发现，不饱和脂肪酸和植物甾醇结合　醇酯（９５）购于ｃｏｇｎｉｓ生物制品有限公司；胆固醇（９５）购　形成的不饱和脂肪酸植物甾醇酯可以提高植物甾醇　于湖南湘原植物生化有限公司；Ｎ，０一双（三甲基硅烷　的油溶性，并且安全性更高［４ｌ，应用范围更广。由于植　基）三氟乙酰胺（简称ＢＳＴＦＡ）（９８）购于上海益民化工有　物甾醇酯的应用越来越广泛，传统的一些甾醇分析方　限公司。　法并不能够满足应用的需求，因此建立方便快捷的植　物甾醇酯分析方法日趋重要。传统对甾醇的分析方法　主要是毛地黄皂甙法、酶法、薄层色谱法、高效液相色　谱法［６】、气相色谱　等方法，其中气相色谱分析法对各　甾醇组分分离度较好，但需要经过衍生化处理导致步　骤比较繁琐，另外，植物甾醇酯的沸点很高需要采用　高温色谱柱来分析　，这对设备的要求很高且色谱柱　１．２主要仪器　Ａｇｉｌｅｎｔ　６８２０气相色谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ—ｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ；　氢火焰离子化检测器，Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ；　ＤＢ－５高温色谱柱（０．３２＊３０），Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ；　ＰＬ２０３电子精密天平，梅特勒一托利多仪器（上海）　损耗大进一步提高了分析成本。鉴于此，本文中采用　有限公司；　的方法的优势在于植物甾醇酯样品经处理后，不需衍　水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。　生化，可直接用气相色谱分析植物甾醇酯中总甾醇含　量和游离甾醇含量并且对设备要求低，重复性好，操　作简单，准确度高。　１．３气相色谱分析条件　检测器：ＦＩＤ，温度３００＂Ｃ；　气体流量：氢气３０ｍＬ／ｒａｉｎ，空气３００ｍＬ／ｍｉｎ，载　作者简介：周丽平（１９８０），女，本科，工程师，主要从事多不饱和脂肪酸等功能因子分离纯化及改性技术研究。　１　６　中外食品工业５．ｍ—ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｉ。０　ｌ！　！曼　－ｒ业　时　（ｒａｉｎ）　图１、植物甾醇经丙酸酐衍生化后气相谱图（圈中峰为　未反应甾醇）　１一胆固醇内标，２一菜籽甾醇，３一菜油甾醇。４一．　豆甾醇，５一￥一谷甾醇　＾　盛　Ｖ　出　．　时Ｉ暮ｌ（ｍｉｎ）　图２、植物甾醇经硅烷化衍生化后气相谱图（圈中峰为　未反应甾醇）　１一胆固醇内标，２一菜籽甾醇。３一菜油甾醇，４一．　豆甾醇，５一Ｂ一谷甾醇　＾　蠡　Ｖ　嘲　删　时　（ｍｉｈ＞　图３、植物甾醇直接气相分析谱图　１一胆固醇内标，２一菜籽甾醇，３一菜油甾醇，４一．　豆甾醇，５一Ｂ一谷甾醇　气：氮气，２５ｍＬ／ｒａｉｎ；　进样温度３００℃；　分流进样，分流比为５０：１；　柱温（程升）：起始温度１８０￣Ｃ，保持ｌｍｉｎ，以５℃／ｒａｉｎ　升温至２６０￣２，保持２０ｍｉｎ；　分析检测　进样量０．６　Ｌ，柱压１０ｐｓｉ。　１．４样品的处理　１．４．１植物甾醇９５的标准曲线绘制　称取０．０５　ｇ植物甾醇９５配成２５ｍＬ浓度为２ｍｇ／ｍＬ　的标准品溶液；称取０．０５ｇ内标物配成２５ｍＬ浓度为　２　ｍｇ／ｍＬ的内标物溶液；分别取标准品１ｍＬ、１．５ｍＬ、　２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ￣Ｉ入ｌｍＬ内标物溶液后稀释到　５ｍＬ，进样量为０．６　Ｌ。　１．４．２总植物甾醇含量的测定　在２５０ｍｌ锥形瓶中加入０．３５００ｇ植物甾醇酯样品、　０．０６ｇ胆固醇内标物、５ｇ氢氧化钾和５０ｍｌ无水乙醇，在　７９￣Ｃ下回流搅拌３０分钟后向反应瓶中加入２５ｍｌ水并用　２５ｍｌ正己烷萃取静置分层。最后，取２ｍＬ的上层液稀释　４倍后进行气相检测（进样量为０．６　Ｌ），测定样品中总　甾醇含量。　１．４．３游离植物甾醇含量的测定　称取样品０．５０００ｇ，加入０．０１ｇ胆固醇内标物以及　１０ｍＬ正已烷，稀释３倍后进行气相检测，测定样品中游　离甾醇的含量。　２结果与讨论　２．１气相色谱分析条件的选择　２．１．１色谱柱的选择　植物甾醇属于高沸点、热稳定性好的物质，必须选　择能耐高温、有良好惰性的柱子。本文采用具有以上　特性的ＤＢ一５色谱柱（３０ｍ×０．３２ｒａｍ×０．１０“ｍ）。　２．１．２程序的选择　程序升温速度应该适当，过快会使植物甾醇中各　组份无法完全分离而过慢会使分析时间变长，峰型也　较差。起始温度考查了１６０℃一２１０￣Ｃ，最终确定的最适　合温度为１　８０℃，保持１ｒａｉｎ。另外，升温速率考查了３℃　／ｒａｉｎ、５℃／ｒａｉｎ和１０℃／ｒａｉｎ，并确定了５℃／ｒａｉｎ的　最佳升温速度，在此升温程序下的植物甾醇分离效果　好，出峰时间适合。最后当程序升温至２　６　０℃时保持　２０ｒａｉｎ。　２．２衍生化方法的选择　・　分别考查了用丙酸酐酰化衍生化法、ＭＳＴＦＡ硅烷　化衍生化法及直接进样法对分析结果的影响。　丙酸酐衍生化法在吡啶溶剂下进行，回流１０分钟，　中外食品工业Ｓｉｎｏ—ｆｏｒｅｉ￣Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　１７　｛　分析检测　ｊ　…　最终的气相色谱分析表明衍生化不完全（如图１），且溶　３结语　剂用吡啶污染大；　本实验对植物甾醇酯样品的分析方法进行了系统　ＭＳＴＦＡ硅烷化试剂衍生化在正己烷溶剂下进行，　的研究，最终确定了选择ＤＢ一５色谱柱，采用程序升温　７０℃衍生化３５分钟，气相色谱分析表明其衍生化也不　的方法，不需要衍生化，并确定了以胆固醇为内标物　完全（如图２）；　的标准曲线法定量分析样品中总植物甾醇和游离植　最后，在不衍生化直接进样条件下的分析结果显　物甾醇，计算得出植物甾醇酯的含量。该方法条件温　示（如图３），植物甾醇的分离度良好，峰型较好，重复三　和，准确度高，重复性好适用于植物甾醇酯样品的分　次的结果基本一致，表明直接进样的方式适用于植物　析。　甾醇的气相色谱分析。　２．３内标物的选择　总植物甾醇定量分析采用内标标准曲线法，选用　与植物甾醇性质相同的胆固醇作内标物。在气相色谱　分析中胆固醇的出峰与其它峰能完全分开，峰型好，　不拖尾而且试剂价格便宜，因此相比较而言胆固醇是　一种理想的内标物。　２．４标准曲线的绘制　以标准品溶液中植物甾醇与加入内标物质量之比　（∑Ｍ／Ｍｓ）作为横坐标（Ｘ），植物甾醇各组分峰面积之和　与内标物峰面积之比（∑Ａ／Ａｓ）作为纵坐标（Ｙ），从而得　到植物甾醇与内标物的相关曲线，其线性回归方程　为：Ｙ＝１．２１６８Ｘ＋０．０１２７，Ｒ＝０．９９８８，具有良好的现性　关系。　２．５样品分析　２．５．１总植物甾醇的计算　按１．４．２中的方法处理样品，测得Ｙ＝３．１６２，计算　得出Ｘ＝３．４８８，根据总植物甾醇含量（Ｃ）＝ｘ×Ｍｓ／ｍ，得　出Ｃ＝５９．８％；其中：Ｃ为总植物甾醇含量；ｉｎ为甾醇酯样　品的质量　２．５．２游离植物甾醇的计算　按１．４．３中的方法处理样品，测定Ｙ＝Ｏ．５８９，计算得　出Ｘ＝０．０６５，因此，游离植物甾醇含量（ｃ）＝１．３％其中：Ｃ　为游离植物甾醇含量。　２．５．３植物甾醇酯含量的计算　由于植物甾醇酯转化来的植物甾醇含量ｗ＝Ｃ—ｃ＝　５９．８％一１．３％＝５８．５％；则植物甾醇酯含量Ｚ＝Ｗ×６７２／４￣１０　×ｌ００％＝９５．９％，结果与样品提供的检测报告相符。其　中：６７２为植物甾醇酯的平均分子量，４１０为植物甾醇的　平均分子量。　１　８　中外食品工业Ｓｉｎｏ—ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　参考文献　［１］ＣＨＯＩ　Ｙ　Ｈ，ＫＯＮＧ　Ｋ　Ｒ，ＫＩＭ　Ｙ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｘ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｂｅｔａ——ｓｉｔｏ——　ｓｔｅｒｏｌ——ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｌ］０ｆｌＣＯ］，２００３，２３：１　６５７——１　６６２．　［２］ＮＡＳＨＥＤ　Ｂ，ＹＥＧＡＮＥＨ　Ｂ，ＨＡＹＧＬＡＳＳ　Ｋ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．　ＡｎｔｊａｔｈｅｒＯｇｅｎ１ｃ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｅｔａｒｙ　ｐｌａｎｔ　ｓｔｅｒｏｌｓ　ａｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒＯ１ｎｆ］ａｍｍａｔ０ｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｐｏ　Ｅ—ＫＯ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｕｔｒ，２００５，　１　３５：２４３８—２４４４．　［３］ＥＮＧＥＬ　Ｒ，ＳＣＨＵＢＥＲＴ　Ｈ．Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒ—　ｏｌｓ　ｉｎ　ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏ　ｎｓｅ　ｉｎ　ｆｕｎｃ——　ｔｉｏｎａｌ　ｆｏｏｄｓ［Ｊ］．Ｉｎｎｏｖ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ　Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，　２Ｏ０５，６（２）：２３３—２３７．　［４］ＢＹＵＮＧ　Ｈ．ＣＡＳＩＭＩＲ　Ｃ．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐａｓｅ——ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒｓ　ｏｆ　ｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌ　ｏｇｙ［Ｊ］．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，１　０（２）：３３６—３４２．　［５］顾欣．植物甾醇的气相色谱分析．宁波化工，２００１，（２）：３０—　３２．　［６］Ｋ．Ｗａｒｎｅｒ．ＨＰＬＣ结合蒸发光散射检测法分析植物油中的　维生素Ｅ和植物甾醇。国外分析仪器，２００１，４：５３—５７．　［７］吴时敏，裘爱泳．植物甾醇及其制品分析．粮食与油脂，　ｌ　９９９。（３）：４１－４４．　［８］姜媛媛．高温ＧＣ—ＦＩＤ法分析植物甾醇酯．大连工业大　学学报．