一种新的细菌学检验与鉴定方法_PCR扩增16S_23SrRNA区间多态性分析

从表1至表7可见:所测“704”玉米胚芽油中,水分及挥发物含量为0.1987%m/m,不超过规定标准0.2%m/m;杂质为0.04922%m/m,不超过规定标准0.05%m/m;酸价为0.535mgKOH/g油,不超过规定标准0.6mgKOH/g油;含皂量为0.0049%m/m,不超过规定标准0.005%m/m;含铅量为0.0982mg/kg,不超过0.1mg/kg;汞为0.0021mg/kg,不超过规定标准0.05mg/kg;铜为0.08mg/kg,不超过规定标准0.4mg/kg;砷为0.03mg/kg,不超过规定标准0.1mg/kg的要求。3　结论

3.1　经过改良精炼后的“704”玉米胚芽油,上述所测各项指标,基本符合国家及国外参考标准规定,说明该厂精炼技术已过关。

3.2　用“704”栽培优良玉米品种提取的胚芽油质量高,食用性基本安全可靠。

3.3　因地制宜地扩大“704”玉米品种的试种面积,以

中国卫生检验杂志1998年第8卷第4期

扩大玉米胚芽油的生产,可使玉米增值,为人们提供更多的保健食品生活用油。

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󰀁综　述󰀁

一种新的细菌学检验与鉴定方法——

PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析

李君文综述　晁福寰审校

军事医学科学院卫生学环境医学研究所(天津　300050)

　　PCR技术在细菌等微生物检测与鉴定领域得到了长足的发展,有些技术已应用于临床检验和流行病学调查,并取得了一定的效益。近年来,人们发现16S及23SrRNA在细菌等原核生物中具有高度的保守性,而其间隔部位的核酸序列却有较大变异。利用这一特点,人们建立起了一种新的细菌学检测与鉴定方法—PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析。本文对这一技术的发展及应用情况作一综述。

传统的细菌学检验与鉴定需要进行细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测,环境样品中的细菌检测与鉴定还需要前增菌培养、选择性培养及生化鉴定等程序,既费时又费力,对有些细菌尚不能给出理想的鉴定结果。核酸探针及PCR技术已被广泛用于细菌的检测与鉴定,并取得了可喜成果。近年来,人们发现16S及23SrRNA在细菌等原核生物中具有高度的保守性,而其间隔部位的核酸序列却有较大变异。利用这些特点,人们建立起了一种新的细菌学检测与鉴定方法—PCR

1,2〕扩增16S～23SrRNA区间多态性分析〔。本文对这一技术的发展及应用情况进行了较详细综述,以便为广大同行参考。

1　细菌rRNA基因简介

1.1　16S～23SrRNA基因的特点:rRNA基因是所有生物体生存所必需的,而且在细菌等原核生物中具有高度的保守性。rRNA基因一般包括以下几部分:16S、间隔、tRNA、间隔、23S、间隔及5SrRNA。它们由单一的30S前体RNA分解而来。编码30SrRNA的DNA称

3〕

为rRNA基因或rDNA〔。

图1显示的是16S～23SrRNA及其两侧的基因结构情况。图中显示的1～10区段是指可用于PCR扩增引物的rRNA基因上的保守片段。目前,16SrRNA基因的全序列已有报道(来源于2500种不同的细菌结果),长度为1.5kp左右,含有高度保守的基因片段,同时在不

3〕同菌株间也含有变异的核酸片段〔。

1.2　16S～23SrRNA基因在细菌中的拷贝数及长度:现已确定16SrRNA全长为1543bp,23SrRNA为2905bp,16S与23SrRNA基因之间的片段(tRNA)不中国卫生检验杂志1998年第8卷第4期

3〕

同的细菌其长度也不尽相同〔。

・253・

人们利用Southern杂交技术及限制性内切酶切技

图1　16S～23SrRNA结构及保守区段所在的位置

术研究了细菌的16SrRNA基因序列,发现不同的菌种间16SrRNA的拷贝数是不同的:埃希氏大肠杆菌7个、枯草

5〕6〕7〕杆菌10个〔、梭状芽胞杆菌10个〔、分枝杆菌属1个〔、支原8〕9〕10〕体属1～2个〔、嗜血流杆菌6个〔、肠球菌6个〔、金葡菌911〕12〕个〔、肺炎链球菌6个〔,而有关23SrRNA基因的情况目前

〔4〕

些引物中,23SrRNA上的7和10区段与16SrRNA上的2区段组合可以成功地检测不同的细菌属或/和种以及

13,14〕

血清型〔。

2.2　PCR扩增产物的进一步分析:PCR扩增产物依据不同情况可以用不同方法进行分析与检测。下面介绍几种较常用的检测方法。

2.2.1　普通琼脂糖凝胶电泳检测:当扩增产物为多个拷贝,或扩增片段长度不同时,可用琼脂糖凝胶电泳进行检测,通过与已知的标准株结果比较定性。2.2.2　当扩增产物为单一条带,且片段长度相同或相近时,可用下面5种检测方法中的一种或几种来检测。2.2.2.1　限制片段长度多态性分析(RFLPs):在电泳前,用限制性核酸内切酶对PCR扩增产物进行酶切,电泳后可产生多条DNA条带,据此可以对细菌进行分

15〕型〔。

研究的较少,其全序列也不清楚。

16S～23SrRNA的间隔序列长度随细菌的不同而有明显的差异,从60bp～1529bp不等。出现这一结果的部分原因是由于细菌中含有的tRNA数目和种类不同之故。大多数革兰氏阴性菌16S～23SrRNA间隔处含有一个tRNAala和tRNAile基因,而其他的革兰氏阴性菌(如亲水气单胞菌、嗜血流感菌等),只含有一个tR-NAglu基因。革兰氏阳性菌或含有一个tRNAala基因,或含有一个tRNAile基因,或两者都有。然而,大多数革兰氏阳性菌(15/19)根本没有tRNA基因(3)。

从目前资料看,tRNA基因的保守性不高,往往是细菌16S～23SrRNA基因中变异最多的区域。有人报道在嗜血流感菌、金葡菌及肠球菌等tRNA基因片段外侧只有一个19bp的核酸序列是同源的。因此,在进行PCR检测时,只能以此作为细菌种的特异性引物,而不

3〕

能用于细菌的通用引物〔。

2.2.2.2　变性梯度凝胶电泳(DGGE):DGGE是一种利用DNA片段的解链特性,在琼脂糖凝胶电泳时将DNA分离开来的系统,可检测只有一个碱基差异的在电泳时,线性增加变性液(核苷酸碱基配DNA片段。

对抑制剂,由尿素和甲酰胺组成)的梯度,直到使变性液的浓度达到相当于解链温度(Tm)。此时,具有较低解链温度的DNA片段开始解链,在凝胶上显示出

DNA片段在此点上迁移速度发生了改变,通过比较迁移速度的变化情况来判断分析结果。

2.2.2.3　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):原理和方法与DGGE基本相同,只是电泳凝胶为聚丙烯酰

11,14〕胺〔。

2　PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析2.1　PCR引物的选择:为检测不同细菌种间或种内的差异,近年来有人用PCR技术扩增16S～23SrRNA区间的核酸序列,并通过分析其拷贝数与扩增片段长度等来达到上述目的。进行PCR检测的关键因素之一就是如何成功地选择PCR引物。在16SrRNA上有四个保守的区段常被用于PCR引物(图1)。2、3、4区段的引物可被用于扩增16SrRNA1400—1500bp之间的片段,其中2区段引物是最保守的。在1～4区段中,2和3区段的使用频率最高。在23SrRNA上,有6个区段(5～10区段)曾被用于PCR引物,它们之间或单独使用,或与16SrRNA上的引物组合使用,但并不是所有的区段或组合都能成功地扩增出目的DNA片段。据报道,在这2.2.2.4　温度梯度凝胶电泳:温度梯度凝胶电泳系统也可用于单个碱基差异的DNA片段分析。具体方法是在聚丙烯酰胺垂直电泳装置上增加两个铝片(板)对电泳缓冲液进行加温。温度梯度改变可垂直于电泳方向,也可平行于电泳方向。与DGGE或PAGE比,温度梯度凝胶电泳操作更方便,它不需要改变溶剂梯度,不需要

16〕大体积的缓冲液池〔。・254・

中国卫生检验杂志1998年第8卷第4期

表1　PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析在细菌检测与鉴定领域的应用

细菌种类

革兰氏阴性菌　不动杆菌(种)　不动杆菌(种)　放线菌

　土壤杆菌(种)　百日咳博德氏菌　弗氏柠檬酸杆菌　丛毛单胞菌　肠杆菌(种)　肠杆菌(种)　埃希氏大肠杆菌　军团菌　军团菌

　脑膜炎奈瑟氏球菌　硝化杆菌

　弓型菌、脱硫弧菌　洋葱假单胞菌　荧光甲单胞菌　恶臭甲单胞菌　根瘤菌(种)　肠炎沙门氏菌　沙门氏菌(种)革兰氏阳性菌

　苏云金芽胞杆菌　艰难梭状芽胞杆菌　艰难梭状芽胞杆菌　梭状芽胞杆菌(种)　类芽胞杆菌　粪肠球菌　屎肠球菌

　李斯特氏菌(种)　李斯特氏菌(种)　金黄色葡萄球菌　金黄色葡萄球菌　葡萄球菌(种)　米氏链球菌　嗜热链球菌其它

　伯氏考克斯氏体　化脓分支杆菌　鸟分支杆菌　偶发分支杆菌　戈氏分支杆菌　堪萨斯分支杆菌　结核分支杆菌　支原体　支原体

引物位置16S321,413313222**4*2331233223*323*2233133333333*

23S5786*510577*655*75567551075*575*107551055555556*

凝胶电泳

+++--+-+++++--++---++-++---++-+++---++++++/-+-

PCR产物检测测序--+-----------+-++---+--+-+--+---+-+-----+/---RFLP或SSCP

++-+--+-----++----+------+--------+-------++

出　　处(参考文献)15192021222324231313252627282930,313232333423351436373839132340121323414243444444444445,464748

　　注:*示所用引物在16S或23SrRNA上,但不在1～10区段内。2.2.2.5　PCR—单链构象多态性分析(SSCP):SSCP主要用于碱基突变或变异的检测。其方法是将PCR产

物在中性聚丙烯酰胺上进行电泳,利用在中性条件下,解链后的两条单链DNA将形成一定的二级机构,具有中国卫生检验杂志1998年第8卷第4期

一定的构象,使其在电泳过程中显现出不同的DNA条带。该方法灵敏度也很高,能检测到只有一个碱基的突

17〕变或差异的DNA片段〔。

・255・

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这一技术自从90年代初建立以来,在细菌学检测与鉴定等研究领域得到了长足发展。尤其近2年来,采用PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析技术检测与鉴定各种细菌的报道明显增多,已涉及到了临床细菌学检验、环境细菌学检验、流行病学调查等领域;被检测的细菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌及支原体等。尤其与各种改进的PCR产物检测(测序)方法结合使用,使检测范围更加广泛。表1给出了近年来这一技术在细菌学检测与鉴定方面应用的各种实例,供参考。

3　PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析应用前景与展望

本文介绍了一种新的细菌学检测与鉴定技术—PCR扩增16S～23SrRNA区间多态性分析,该技术的建立主要依据以下事实:几乎所有的细菌都含有16S和23SrRNA,且具有高度的保守性,这为PCR检测时引物的设计提供了依据;每种细菌或其16S和23rRNA的拷贝数不同,或其16S～23SrRNA间隔区长度和基因序列不同,这使得不同细菌的PCR扩增产物在凝胶电泳时可被明显分离开来,为确定细菌的种属或血清型提供了依据。这一技术已被广泛用于各种细菌的检测与鉴定,尤其与各种改进的PCR产物检测(测序)方法结合使用,使检测范围更加广泛。除可检测与鉴定已知细菌外,这一技术还被广泛用于土壤等环境样品中未知菌的检测与鉴定,以及新发现菌株的鉴定等。尽管目前有关16S～23SrRNA区间序列及长度的知识尚很有限,但相信在不久的将来,这一技术将成为微生物工作者检测与鉴定细菌的重要手段之一。

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󰀁短篇报道󰀁

家,抽检了餐饮具434件,大肠菌群合格率为35%;抽检了12家个体经营户,抽检了48件餐饮具,大肠菌群合格率仅为1%。国有、集体饮食单位的餐饮具的消毒卫生状况,明显好于个体经营户。3　讨论与建议

3.1　这次调查中,所有饮食单位的餐具消毒为电子消毒柜消毒、蒸汽消毒及药物84消毒液浸泡消毒,之所以抽查中餐具的大肠菌群合格率如此之低,是因为从事饮食的经营者卫生意识淡漠。日常经营中,有的消毒柜只当着摆设或嫌操作麻烦等原因而不使用;餐饮具质量不佳的蒸汽消毒,餐饮具有所耗损,因而不使用;采用84消毒液的经营户多为个体,也因经济因素不能做到经常一用一消毒的习惯,经常是洗刷后直接给顾客使用。这次调查中个体餐饮的大肠菌群合格率仅为1%。由此看来,在个体经营户中强制配备消毒设备的必要性。

3.2　抽查的61家饮食单位,大部分都无专职的消毒员,从业人员卫生意识差。

3.3　大肠菌群纸片在使用时塑料袋内不应有多余的水分,以免渗出污染而出现假阳性,贴于食具表面的时间应为30s,放置时间不能过长,否则被空气污染,影响结果的准确性。

3.4　提高餐饮具的卫生是阻断肠道传染病传播及其它传染病的一项重要措施,监督单位要对被监督单位加强法制教育和食品卫生知识的培训工作,提高食品从业人员的法制观念和卫生知识水平。自觉搞好餐饮具的消毒工作,对不进行餐饮具消毒的饮食单位,要依法严肃处理。氰化高铁法测定血红蛋白放置

时间对结果的影响

亓跃蓉　蒋利康

建德市卫生防疫站(浙江311600)

　　血红蛋白(Hb)测定是常用的检验贫血程度及造血功能的方法之一。采血稀释后至比色测定含量的间隔时间对结果有无影响?为此我们每天采样20人,共5天,100份进行实验观察。取血20󰀁l,加至5ml稀释液中,充分混匀,分别于加血后的0.5h、1h、2h、4h、8h和12h,用1cm比色皿,波长540nm分别比色,测得吸光度A,求得Hb含量为130.89±17.02,132.71±16.75,133.34±16.57,132.12±16.78,132.27±16.63,132.35±16.55,但经显著性检验后可见,P均大于0.05。

食单位餐饮具消毒现状调查及分析

张亚玲　刁海玉

铜陵市卫生防疫站　(安徽244000)

1　材料与方法

“大肠菌群快速检测纸片法”。由北京赛蒂克生物制品有限公司生产,按说明书方法进行。2　结果分析

调查了60家饮食单位,抽检了482件餐具,大肠菌群的合格率仅为33%。其中抽检了国有、集体单位49