分子生物学技术在鸭坦布苏病毒检测中的应用研究进展

水禽世界　综　述　２Ｏ１５．４　分子生物学技术在　鸭坦布苏病毒检测中的应用研究进展　米　于新友　，李天芝　，莫玲　，沈志强１，２　（１．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州　２５６６００；　２．山东省滨州畜牧兽医研究院１　摘　要：本文综述了分子生物学技术在鸭坦布苏病毒检测上的几种方法．主要包括核酸　探针、ＲＴ—ＰＣＲ方法、套式ＰＣＲ方法、荧光定量定量ＲＴ—ＰＣＲ方法、环介导等温扩增方法、竞　争定量ＰＣＲ方法等６种方法，对鸭坦布苏病毒病的诊断和防控有一定的参考价值。　关键词：分子生物学技术；鸭坦布苏病毒；检测　中图分类号：￥８１８．９　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—１０８５（２０１５）０４—００３６—０４　禽坦布苏病毒（Ａｖｉａｎ　Ｔｅｍｂｕｓｕ　ｖｉｒｕｓ．ＡＴ．　ＭＵＶ）可感染鸭、鹅、鸡等多种禽类引起禽坦布苏　病毒病［１１（Ａｖｉａｎ　Ｔｅｍｂｕｓｕ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．ＡＴＭＵ．　年来禽坦布苏病毒的分子生物学检测方法研究　进展作一简要概述．以期为疾病的快速检测和防　控提供参考　１核酸探针　核酸探针技术是常用的分子生物学诊断技　术，它具有操作简单．不受抗原抗体反应的限制．　结果易于判定等优点，适合在基层推广使用　高　绪慧等【　］根据ＧｅｎＢａｎｋ中Ｂａｇａｚａ株ＭＤＴＵＶ基因　组序列设计一对特异性引物．扩增ＮＳ３基因　ＶＤ）．该病自２０１０年在我国暴发以来．迅速波及　到全国多个省份＿２Ｊ．给我国养禽业造成了严重的　经济损失＿３＿。禽坦布苏病毒为黄病毒科、黄病毒属　成员．引起鸭发病的病毒又称为鸭坦布苏病毒　（Ｄｕｃｋ　Ｔｅｍｂｕｓｕ　ｖｉｒｕｓ，ＤＴＭＵＶ）。感染鸭群的发　病率高达１００％．死亡率在５％～１５％．临床表现为　高热、蛋鸭产蛋率严重下降、部分感染鸭拉绿色　稀便并出现神经症状．病理剖检主要表现为卵巢　充血、出血、萎缩、坏死，卵泡破裂，心内膜出血，　脾脏肿大．该病造成约１．２亿只蛋鸭和１５００万只　４０６ｂｐ的特异性片段．将纯化的ＰＣＲ产物用地高　辛进行探针标记．建立了地高辛标记探针检测　ＭＤＴＵＶ的方法。该法敏感性高，最低检出限量为　１００ｐｇ／Ｌ，特异性好，不与鸭瘟病毒、Ｈ９Ｎ：亚型禽　流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减　蛋综合征病毒的核酸发生杂交反应　２　ＲＴ—ＰＣＲ方法　ＲＴ—ＰＣＲ是以病毒的ＲＮＡ为模板进行反转　录．再以ＰＣＲ进行核酸扩增来检测病毒的方法．　肉鸭感染发病．经济损失达数十亿元ｌ　４】　本文就近　收稿日期：２０１５—０７—０２　基金项目：山东省现代产业技术体系家禽生产与环境　控制创新团队项目ｆＳＤＡＩＴ一１３—０１１—１０１　作者简介：于新．￣（１９８３一），男，汉族，山东菏泽人，助理　研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究。　Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｘｉｎｙｏｕ２００６＠１２６．ｃｏｒｎ　一以其简便、迅速、灵敏等优点在动物疾病诊断上　得到了广泛的应用　张帅等［６１建立了ＤＴＭＵＶ的　２０１５．４　一综　述　ＳｈｕｉＱｉｎ　ＳｈｉＪｉｅ　步法ＲＴ—ＰＣＲ检测方法，该法具有特异、快速、　立了检测鸭坦布苏病毒的套式ＲＴ—ＰＣＲ方法．　该套式ＲＴ—ＰＣＲ比一般ＰＣＲ敏感性高１０倍　采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省、　敏感、准确等特点．可以检出１．８２个ＴＣＩＤ５０的　病毒的核酸　李国平【，］根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的　ＤＴＭＵＶ基因组序列．设计１对引物．建立了检测　ＤＴＭＵＶ的ＲＴ—ＰＣＲ诊断方法．该法对Ｉ型鸭肝　上海市等地发病鸭场的６３份样品进行了检测．　阳性检出率为４８／６３（７６．２％）。而病毒分离率仅为　１３／６３（２０．６％）　唐熠等［１２１根据ＧｅｎＢａｎｋ中Ｂａｇａｚａ　株ＤＴＭＵＶ　ＮＳ３基因序列设计了３条引物．建立　了一种适用于ＤＴＭＵＶ快速检测的半套式ＲＴ—　ＰＣＲ方法　该方法对２个分离株ＤＴＭＵＶ均能扩　炎病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、鸭肠炎病　毒等常见鸭病的扩增结果均为阴性．检测的敏感　性达ｌｎｇＲＮＡ　张艳芳等＿８１根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＤＴ—　ＭＵＶ　Ｅ基因和鸭圆环病毒ＲＥＰ基因的保守序　列．设计合成了２对引物，建立了鸭坦布苏病毒　和鸭圆环病毒的二重ｌｉｔ—ＰＣＲ方法　结果表明－　该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏　增出２７７ｂｐ的特异性条带，而对鸭瘟病毒、禽流　感病毒ｆＨ。亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病　毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性．该法　第１次扩增的敏感性为１Ｘ１０ｓ拷贝／Ｉｘ１．第２次扩　增的敏感性为１ｘｌ０２拷贝／ｔｚＬ．第２次扩增的敏感　感性达到ｌＯＯｆｇ，对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝　炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、Ｈ。亚型　禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为　阴性　赵虹等［９１针对ＧｅｎＢａｎｋ中ＤＴＭＵＶ　ＮＳ２基　因、所有亚型ＡＩＶ　Ｍ基因和Ｈ。亚型ＡＩＶ　ＨＡ基　性比第１次高１０００倍　４荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法　实时荧光定量ＰＣＲ是在ＰＣＲ技术基础上发　展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术．它融汇　了传统ＰＣＲ技术灵敏、快速、特异的特点以及光　谱技术的高敏感性和高精确定量的优点．具有特　异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、　全封闭反应等优点　Ｙａｎ等ｌｌ３］针对ＤＴＭＵＶ　Ｅ基　因设计引物．建立了的ＤＴＭＵＶ　ＴａｑＭａｎ探针荧　因的保守序列．分别设计了３对特异性引物．建　立了一种同时快速检测ＤＴＭＵＶ、所有亚型ＡＩＶ　和Ｈ。亚型ＡＩＶ分型检测的多重ＰＣＲ检测方法．　并对其它鸭病病原体进行ＰＣＲ扩增．结果均为阴　性．敏感性测定结果显示．该方法能检测到４５ｐｇ　的ＤＴＭＵＶ，７．６ｐｇ的Ｈ。亚型ＡＩＶ和７６ｐｇ的Ｍ基　因　孙敏华等＿　ｌｏＩ建立了可同时检测ＤＴＭＵＶ和　ＥＤＳＶ两种病毒的二重ＰＣＲ检测方法．特异性试　验结果显示．该法可以同时检测ＤＴＭＵＶ和　光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法．该法比常规ＲＴ—ＰＣＲ敏感　１００倍．最低可检测到５０个拷贝的病毒核酸　Ｙｕｎ等【Ｈ］针对ＡＴＭＵＶ　３　端非编码区设计ＭＧＢ　探针．建立了检测ＡＴＭＵＶ的荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ　ＥＤＳＶ．且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠　孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、Ｈ　亚型禽流　感病毒、新城疫病毒以及大肠杆菌的核酸发生交　叉反应．敏感性试验表明．该法对ＤＴＭＵＶ的最低　检出限为５９０个拷贝．对ＥＤＳＶ的最低检出限为　３２６０个拷贝．该方法重复性良好．对不同批次的　样品扩增效果良好　方法．检测时间短．２ｈ内即可完成检测　万春和等　ｌｌ５］根据ＤＴＭＵＶ　ＮＳ５基因序列特征设计引物．建　立基于ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ检测模式的实时荧光定量　ＲＴ—ＰＣＲ．该方法检测ＤＦＶ　ＮＳ５基因２．７４ｘ１０３～　２．７４ｘ１０７拷贝／ｌｘ１．反应范围内有很好的线性关　系　扩增产物的熔解曲线分析只出现１个单特异　３套式ＰＣＲ方法　套式ＰＣＲ，又称巢式ＰＣＲ，使用两对ＰＣＲ引　物扩增完整的片段．以第一对引物的扩增产物为　模板进行第二轮扩增反应．检测的特异性更好．　敏感性也更高　颜丕熙等ｌｌ１］根据ＤＴＭＵＶ　Ｅ基因　峰，无引物二聚体。Ｔｍ值为ｆ８６．２３±０．１８１℃，对禽　流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽Ｉ型副粘病毒、鸭　减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性　信号扩增。可重复性好．组内变异系数为０．５２％～　１．４８％．组间变异系数０．７１％～２．２１％　彭珊等Ｉｌ６】建　立了ＤＴＭＵＶ的ＴａｇＭａｎ荧光定量ＰＣＲ检测方　序列，设计了２对重叠引物Ｐｌ、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４，建　３７　水禽世界　综　述　２０ｌ５．４　法．该法检测敏感性是普通ＰＣＲ方法的１００倍。　并且该方法对ＤＴＭＵＶ的最低检侧限是０．０１半　数鸡胚致死量（ＥＬＤｓｏ）　通过批内和批间实验的变　异系数表明．优化的荧光定量ＰＣＲ方法的重复性　比未优化的荧光定量ＰＣＲ方法好．该法特异性　好．对其它鸭病毒核酸扩增结果均为阴性　靳宇　田等［１７］根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的ＤＴＭＵＶ保守基因　序列．设计了１对特异性引物及ＴａｑＭａｎ探针．建　立了检测ＤＴＭＵＶ的荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法．该　法特异性好．仅能在ＤＴＭＵＶ样本中检出荧光信　号，与其它病原不发生交叉反应；敏感性高，最低　即可完成扩增．敏感性达２拷贝／ｔｘｌ　李兆龙等［２１１　建立的ＡＴＭＵＶ　ＲＴ—ＬＡＭＰ方法在常规水浴锅中　４５ｍｉｎ内即可完成，灵敏度达ｌｐｇ．比常规ＲＴ—　ＰＣＲ方法高１００倍　ＲＴ—ＬＡＭＰ方法本质是一种　核酸扩增检测方法．故具有极高的敏感性与特异　性，且该方法简便、快速、无需特殊仪器设备。特　别适合基层兽医部门使用．具有广阔的应用前　景。董嘉文等［２２】根据ＤＴＭＵＶ　Ｅ基因保守区域设　计了一套引物．建立了检测ＤＴＭＵＶ的ＲＴ—ＬＡＭＰ　方法．该法的最低检测限可达７．８ｃｏｐｉｅｓ．其灵敏　度是普通ＲＴ—ＰＣＲ的１００倍．对其它常见鸭源病　毒核酸扩增结果均为阴性　欧全宾等　根据　ＧｅｎＢａｎｋ发布的坦布苏病毒Ｂａｇａｚａ毒株Ｅ基因　检测限可达２５ｃｏｐｉｅｓ／ｔｘｌ质粒　张艳芳等［１８１根据　ＧｅｎＢａｎｋ中ＤＴＭＵＶ　Ｅ基因和ＤＰＶ　ＵＬ６基因的　保守序列．设计合成了２对引物和２条ＴａｑＭａｎ　探针．建立了同时检测ＤＴＭＵＶ和鸭瘟病毒的二　重荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法　该法对ＤＴＭＵＶ和鸭　的保守序列设计１套引物．建立了环介导等温扩　增快速检测鸭坦布苏病毒的方法　该法的检测敏　感性可达１０拷贝／　１，对鸭坦布苏病毒山东分离　株的检测呈阳性，而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（Ｈ。　亚型）、鸭新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋　综合征病毒扩增结果均为阴性　瘟病毒的检测灵敏度均达１００个模板拷贝数．同　时该方法对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭　细小病毒．Ｈ日亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒　的检测结果均为阴性　王楠楠等【ｌ９】根据坦布苏病　毒Ｅ基因设计１对特异性引物．建立了检测坦布　苏病毒的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ　Ｉ绝对荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ　方法，标准曲线的线性关系显著（ｒ２＞０．９９９），平均　试验问变异系数为０．２６％．检测敏感性可达到２×　６竞争定量ＰＣＲ方法　竞争定量ＰＣＲ是先构建一个与靶基因相同　的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不　同的内标．在同一反应管内，靶基因和内标物和　引物竞争性结合．进行同步扩增．由于竞争作用．　当一种模板量逐渐增加时．另一种模板的扩增产　物相对逐渐减少．但两种扩增产物的比值和两种　初始状态时模板分子数的比值是一致的　根据标　准品的准确含量制作标准曲线．从而进行准确核　酸定量　袁朋等［２４１建立了检测ＤＴＭＵＶ的竞争定　量ＰＣＲ方法．该法特异性强、灵敏性高．竞争模板　和目标模板可在４００个分－￣／ｔｘｌ的水平上共扩　增．能够满足简单快速确定病毒含量的要求　１０１ｃｏｐｉｅｓ／ｐＪ　曾婷婷　２０】建立了可鉴别坦布苏病　毒和产蛋下降综合征病毒的二重实时荧光定量　ＲＴ—ＰＣＲ方法．该法只扩增这两种病毒的目的片　段．无交叉扩增反应．与其它常见禽类病原体也　无扩增反应．该检测体系最低可同时检测１００个　拷贝的坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒．比常　规ＰＣＲ和ＲＴ—ＰＣＲ敏感１０～１００倍　５环介导等温扩增技术　环介导等温扩增ｆｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＬＡＭＰ）方法是日本学者Ｎｏｔｏｍｉ等发　明的一项恒温核酸扩增技术．具有操作简便、快　速、高效、敏感、特异、经济等特点，特别适合在现　场和基层部门应用。Ｗａｎｇ等建立的可视化检测　ＡＴＭＵＶ的ＲＴ—ＬＡＭＰ方法在６３　水浴５０ｍｉｎ内　７小结与展望　虽然ＤＴＭＵＶ分子生物学鉴别诊断方法有很　多，但各有利弊．常规ＲＴ—ＰＣＲ方法具有特异性　强、敏感性高、检出率高等特点，但不能准确地定　量、容易污染，且敏感性有限。荧光定量ＲＴ—　ＰＣＲ技术弥补了常规ＲＴ—ＰＣＲ方法的缺点．但　２Ｏ１５．４　综　述　ＳｈｕｉＱｉｎ　ＳｈｉＪｉｅ　是荧光定量ＰＣＲ仪器和探针的合成价格昂贵．检　测成本比较高，这也限制了它的普遍应用。ＬＡＭＰ　方法检测快速、简便，适合在基层兽医和养殖场　进行推广使用．但ＬＡＭＰ方法灵敏度高导致假阳　性　相信随着分子生物学的发展，不久的将来，一　些操作简单、敏感度高、特异性好、检测速度快、　价格低廉的ＤＴＭＵＶ新型分子生物学检测方法将　会被建立起来　参考文献：　【１】　吕桂霞，裴苹苹．坦布苏病毒的最新研究进展【ＪＪ．山东　畜牧兽医，２０１３，３４（５）：７９—８０．　（４）：５１７—５２０．　　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　【ｌ３］　Ｙａｎ　Ｌ　Ｐ，Ｙａｎ　Ｐ　Ｘ，Ｚｈｏｕ　Ｊ　Ｗ，ｅｔａ　Ｔａｑ？Ｍａｎ－Ｂａｓｅｄ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄｑｕａｎｔｉｉｆｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｗｌｙ　Ｃ—　ｍｅｒｇｅｄ　ｄｕｃｋ　ｔｅｍｂｕｓｕ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＪＶｉｒ０１　２０１　１．８：４６４．　　Ｚ，Ｈｕａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｏｎｅ—　【１４］　Ｙｕｎ　Ｔ，Ｎｉｓｔｅｐ　ｒｅａｌ—　ｔｉｍｅ　ＲＴ——ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｉｎｏｒ——　ｇｒｏｏｖｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｕｃｋ　Ｔｅｍｂｕｓｕ　ｖｉｕｓ［ｒＪ】１Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，１８１（２）：　１４８－１５４．　鸭坦布苏病毒ＳＹＢＲ　［１５］　万春和．朱海侠．施少华．等．Ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时荧光定量检测方法的建立［Ｊ］．中国兽医　学报，２０１３，３３（７）：９７３—９７８．　【２】Ｔａｎｇ　Ｙ，Ｄｉａｏ　Ｙ，Ｙｕ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｔｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｈｏｕｓｅ　鸭坦布苏病毒ＴａｑＭ　ａｎ　［１６】　彭珊，闰丽萍，李国新，等．荧光定量ＰＣＲ方法的优化【Ｊ］．中国预防兽医学报，　２０１３，３５（４）：２９４—２９８．　ｓｐａｒｒｏｗｓ（Ｐａｓｓｅｒ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｃｈｉｎａ『Ｊ】．　Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ　Ｅｍｅｒｇ　Ｄｉｓ，２０１３，６０（２）：１５２－１５８．　【３】庄金秋，梅建国，王艳，等．苏病毒实验室检测方法研　究进展【ＪＪ．中国家禽，２０１４，３６（１３）：４１—４４．　许秀梅．等．鸭坦布苏病毒实时荧　［１７］　靳宇田．黄显明．光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立及应用［Ｊ］．中国　［４］朱丽萍，颜世敢．鸭坦布苏病毒研究进展［Ｊ１．中国预防　兽医学报，２０１２，３４（１１：７９—８２．　【５】高绪慧，刁有祥，唐熠探，等．针检测鸭黄病毒的地高　辛标记ＤＮＡ的制备与应用『Ｊ１．中国兽医学报，　２０１２，３２（４）：５２５—５２８．　动物传染病学报，２０１３，２１（４）：４６—５０．　谢芝勋，谢丽基，等．鸭坦布苏病毒和鸭瘟　【１８】　张艳芳，病毒二重荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法的建立［Ｊ］中国畜　牧兽医，２０１４，４１（３）：７７—８２．　坦布苏病毒荧光定量ＲＴ—　［１９］　王楠楠，刘芳．许漩，等．ｆ６】　张帅，云涛，叶伟成，等．鸭坦布苏病毒一步法ＲＴ—　ＰＣＲ检测方法的建立和应用ｌＪ１．浙江农业学报，　ＰＣＲ检测方法的建立及初步应用［Ｊ】．中国兽医科　学，２０１５，４５（０１）：１５—１９．　谢芝勋．谢丽基．等．应用二重实时荧光定　［２０】　曾婷婷，２０１２，２４（１）：３７－４０．　ｆ７］李国平．鸭坦布苏病毒ＲＴ—ＰＣＲ诊断方法的建立与　应用［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１３，１０（１）：６９—７２．　量ＲＴ—ＰＣＲ鉴别坦布苏病毒与产蛋下降综合征病　毒［Ｊ１．中国家禽，２０１５，３７（１）：１７—２１．　［２１］　李兆龙．陈仕龙．林锋强．等．禽新型黄病毒ＲＴ—　ＬＡＭＰ检测方法的建立【Ｊ】＿畜牧兽医学报，２０１２，４３　（４）：６５９—６６３．　【８】张艳芳，谢芝勋，谢丽基，等．鸭坦布苏病毒与鸭圆环　病毒二重ＲＴ—ＰＣＲ方法的建立［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，　２０１４（１２）：４４—４７．　【９】赵虹，谢芝勋，谢丽基，等．鸭坦布苏病毒和禽流感病　毒多重ＰＣＲ检测方法的建立『Ｊ】．畜牧与兽医，　２０１５，４７（３）：９０—９３．　孙敏华．李林林．等．实时荧光技术在鸭坦布　［２２］　董嘉文，苏病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法中的应用【ＪＪ．广东农业　科学，２０１５（１）：１０９—１１２．　鸭坦布苏病毒Ｅ基因环　［２３】　欧全宾，刁有祥．唐熠，等．［１０】孙敏华，李林林，董嘉文，等．鸭坦布苏病毒和产蛋下　降综合征病毒二重ＰＣＲ检测方法的建立【Ｊ１．广东畜　介导等温扩增检测方法的建立与应用［Ｊ］．中国兽医　学报，２０１３，３３（９）：１３２９—１３３２．　牧兽医科技，２０１５，４０（１）：２９—３１．　［１１】颜丕熙，李国新，吴晓刚，等．应用套式ＲＴ—ＰＣＲ快　速检测鸭坦布苏病毒［Ｊ］．中国动物传染病学报，　２０１１，１９（３）：３４－３７．　【１２】唐熠，刁有祥，高绪慧，等．鸭黄病毒感染逆转录半套　式ＰＣＲ检测方法的建立『Ｊ１．中国兽医学报，２０１２，３２　许传田．等．鸭坦布苏病毒竞争定量ＰＣＲ　【２４］　袁朋．王斌，检测方法的建立与应用［Ｊ］．山东农业科学，２０１５，４７　（３）：１１３—１１７．　口　３９