双水相萃取技术

D09生物 张燊睿 092203112

内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。

Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application

关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。 引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。

双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。 当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。

例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。这是一个很有前途的新的分离方法，特别适用于生物工程得出的产品的分离。

一． 双水相萃取原理：

双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术（partition of two aqueoue phase

system）近年来发现的、引人注目的、极有前途的新型分离技术。早在1896年，荷兰微生物学家Beijerinck[1]发现，把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时得到一种不透明的混合溶液，静止后风味两相，上相含大部分水，下相含大部分琼脂，而两相的主要成分都是水，人们把这种现象称为聚合物的不相溶性，由此产生了双水相萃取。1955年，瑞典伦德大学的Albertsson[2]首次利用双水相技术从单细胞藻类中分离淀粉核，从此开创了双水相分配技术。1979年德国GBF的Kula和Kroner等[3]水相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶提取过程大为改善。几十年来，国内外的研究者们已经就双水相分配技术的各个方面展开了系统的研究，包括新型双水相体统的开发，成相机理研究、系统物性的测定、热力学性质的研究生物大分子及小分子活性物质的分配、萃取工艺流程的设计、工业化大生产中的应用以及聚合物的回收等等，并取得很大进展。

双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大

的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。

可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。 生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用。因此，分配系数是各种相互作用的和。

部分各类型的双水体系[4] 物质类型 物质P的名称 物质Q的名称 两种非离子型聚合物 聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇 葡聚糖（Dx） 羟丙基葡萄糖 聚乙烯醇 葡萄糖 (Dx) 聚乙烯吡咯烷酮 聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素 聚乙二醇（PEG） P为带电荷聚电解质 盐 钠盐 硫酸葡聚糖钠羧甲基葡聚糖P Q都为聚电羧甲基葡聚糖羧甲基纤维素钠盐 解质 钠盐 P为聚合物 聚乙二醇 磷酸钾、硫酸铵、硫Q为盐类 酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠 二.双水相萃取操作及设备： 1．相系统的选择;成功的利用双水相萃取技术分离提取目标蛋白质的第一步是选择合适的双水相系统，使目标蛋白质的收率和纯化程度均达到较高的水平，并且成相系统易于利用静置沉降或离心沉降法进行相分离。如果以胞内蛋白质为萃取对象，应使破碎的细胞碎片分配于下相中，从而增大两相间地密度差，满足两相的快速分离、沉降操作成本和操作时间的产业化要求。

2．水相萃取工艺设计：条件：待分离物质与原料液中的杂质应分配在不同的相中；待分离物质在双水相体系中的某一相中的分配系数相对较大，使得经过一次萃取后就能得到较高的提取率；双水相系统的上下相应易于分离。

双水相萃取技术的工艺流程一般分为三部分：目的产物的萃取；PEG的循环；无机盐的循环。

2.1 目的产物的萃取：(1)如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。一步双水相萃取是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，分离上下相，其中下相含有大多数杂质，而上相在通过超过滤操作进行进一步的提纯目标产物，同时

高聚物一相可以得到回收。在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标，而且可以通过浓缩可以进行回收再利用。

(2) 细胞内蛋白质的萃取：双水相萃取法可选择性地使细胞碎片分配于双水相系统下的下相，而目标产物分配于上相，同时实现目标产物的部分纯化和细胞碎片的除去，从而节省利用离心法或膜分离法除去碎片的操作过程。因此，双水相萃取应用于胞内蛋白质的分离纯化是非常有利的。从细胞匀浆中萃取目标产物时，除成相系统外，匀浆液浓度是影响分离效率的重要因素。一方面，为降低设备体积，减少城乡聚合物用量，即降低设备投资和操作成本，添加匀浆液浓度应尽量高。但令一方面，如果匀浆液添加过多，其中细胞碎片、核酸和蛋白质的浓度达到与成相系统浓度相当的值，会不同程度地扰乱成相系统，改变相体积比。因此，一般来说，根据细胞种类与目标产物的不同，每千克系统的处理量上限为200~400g湿细胞。

从细胞匀浆中双水相萃取细胞内酶的部分研究结果[5] 酶 延胡索酸酶 天门冬氨酸酶 菌种 Brevibacterium ammoniagenes E. Coli 相系统 收率分配系纯化因细胞浓度(%) 数 子 (%) PEG/盐 83 PEG/盐 96 PEG/盐 93 PEG/盐 87 PEG/Dx 98 PEG/盐 94 PEG/盐 86 PEG/盐 93 3.3 5.7 3.6 6.2 9.5 11 3.0 3.2 7.5 6.6 2.3 9.3 2.4 - 2.5 3.4 20 25 20 12 20 20 20 25 异亮氨酰tRNA 合E. Coli 成酶 β-半乳糖苷酶 亮氨酸脱氢酶 甲醛脱氢酶 葡萄糖异构酶 延胡索酸酶 E. Coli Bacillus sphaericus Candida boidinii Streptomyces sp. E. Coli (3)如果细胞匀浆液中的目标产物的分配产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。第一步萃取使细胞碎片、大部分杂蛋白和亲水性核酸、多糖等进入下相，而目标产物分配在上相；如目标产物尚未有杂质时，可在上相中加入适量的盐使其重新形成双水相，进行第二步萃取，除去大部分多糖与核酸；为便于目标产物与PEG分离和PEG的重复利用，在第三步萃取中，使目标产物分配与盐相。如第一步选择性足够大，目标产物的纯度已达到要求，则可直接进入第三步，将目标产物分配与盐相，再用超过滤法去除残余的PEG，以提高产品的纯度。

2.2 PEG循环：在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：（1）加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；（2）将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱机先洗去PEG，再洗出蛋白质。

2.3 无机盐的循环：一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6摄氏度，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类或出去PEG相的盐。三．双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用。

双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。到目前为止，双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面：

3.1 提取酶和蛋白质。这是双水相体系研究和应用最多的方面。对发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶。绝大多数是用PEG作上相聚合物，葡萄糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。

3.2 进行萃取性生物转化。应用实例有：利用葡萄糖和淀粉生产乙醇、利用葡萄糖生产丙酮丁醇、利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖、水解酪蛋白、发酵生产乳酸、将青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸等。

3.3 食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质。在生物技术方面，可用来提取DNA。

3.4 萃取细胞、细胞器、膜等粒子.主要目的有：分离提纯、分级分离、探测体内反应或体外处理时颗粒表面的变化、研究颗粒表面结构与生物学功能的相互关系、研究细胞与细胞或细胞与生物大分子间相互作用、探测种属关系十分接近的细胞表而细微的差别，大多数都是用亲和萃取方法来达到目的的。

3.5 应用与液—液分配层析(LLPC).将一种聚合物连接在固体颗粒（支持物）上，另一种聚合物的溶液作为流动相。这种柱层析技术课分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。 分离物质 核酸 生长素 病毒 干扰素 细分离含有胆碱受体三甲胺胞组织 的细胞 PEG/Dextran - 4 分离β-干扰素 PEG-磷酸酯/盐 脊髓病毒和线病毒 PEG/NaDS - 0 630 7 3.67 95DNA 人生长激素的纯化 PEG/盐 6.4 0 96举例 分离有活性核酸体系 PEG/Dextran 分收配系数 率/% - - 四．双水相萃取分离技术的发展方向。 4.1开发廉价的新型双水相系统

聚合物成相价格昂贵是阻碍改技术应用于生产的主要因素，磷酸盐会带来环境问题，体系盐浓度高，无法实现亲和分配，并会破坏某些生物物质的活性，使其应用范围受到一定限制。因此开发廉价的聚合物是该技术应用的急需解决的问题。

新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系。新型双水相体系主要有两类：廉价高聚物∕高聚物体系及新型功能双水相体系，廉价双水相得开发主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用的昂贵的高聚物。这样可以大大降低成本，利于工业放大。新的双水相体系表mean活性剂—水体系、双水相胶束体系的相继被发现，这些双水相体系各有优势，这些体系不仅操作成

本低，萃取效果好，还为活性物质提供了更温和的良好的环境。

4.2 双水相分配与相关技术的集成化

集成化概念引入化工分离领域，形成了过程集成化新概念是化工过程技术概念上的革命。过程集成化是指不同的分离技术上的相互渗透，实现优势互补，从而达到整体优化的目的。双水相分配技术与温度诱导相分离、电泳、层析和亲和技术可以实现集成化，具体表现在3方面：与常规技术结合来解决双水相萃取本身的难点问题；引进其他分离技术进行融合以提高分离效率，简化分离过程；为已有的技术提供新的思路。

4.2.1 与温度诱导相分离的集成：采用乙烯基氧与丙烯基氧的共聚物和PEG可形成温敏性双水性体系。蜕皮甾族化合物的提取是简便、快捷、便宜的温度诱导双水相萃取技术应用的成功例子。

4.2.2 与电泳技术的集成：电泳是生化工程中常规的分析和分离手段，引入到双水相分配中形成了一个新的概念——双水相电泳。

4.2.3 与层析分离技术的集成化;利用双水相分配去除细胞碎片等固体颗粒，并实现初步纯化后，将包含有目标物的富聚合物相或富盐相直接上层析柱进行层析分离。双水相分配与层析技术实现集成化，有望改善双水相分配的单步分离效率较低的缺陷。

4.2.4 与亲和沉淀的集成：双水相分配与亲和沉淀相互结合实现集成化，可优势互补，使亲和沉底技术能直接处理含固体颗粒物料，又提高了双水相分配的单步分离因子，同时解决了亲和配基与目标物和成相组分的分离问题。从肌肉匀浆液中提取LDH。

随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。双水相分配技术以其分离条件温和、易操作、可调节因素多并可借助传统溶剂萃取的成功经验而被认为将使一种生物下游工程的初步分离单元操作。随着时代的发展和变革，越来越多的新兴技术踊跃而出，而作为一个很有发展前景的生化分离单元，更应该致力于新兴的双水相系统的研究和开发。

参考文献

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