[12]发明专利申请公布说明书
[21]申请号200810037098.2
[51]Int.CI.
A01H 4/00 (2006.01)
[43]公开日2008年9月17日[22]申请日2008.05.08[21]申请号200810037098.2
[71]申请人上海交通大学
地址200240上海市闵行区东川路800号[72]发明人曹越平
[11]公开号CN 101263786A
[74]专利代理机构上海交达专利事务所
代理人王锡麟 王桂忠
权利要求书 2 页 说明书 7 页
[54]发明名称
利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法[57]摘要
一种农业技术领域的利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，包括以下步骤：第一步，种子灭菌，划破种皮，在萌发培养基上培养无菌苗。第二步，待无菌苗长至10cm，切下无菌苗幼茎顶端3－4cm插入生根培养基。第三步，将切去顶端的实生苗移栽到灭菌的基质或土中，待长出新枝移至户外。一周后移栽到田间或盆栽。第四步，将第二步得到的幼茎在生根培养基中培养至生根。采用上述方法，多年生野生大豆的成活率可以达到99％－100％，本发明可用于多年生野生大豆Glycine亚属22个种的材料的繁殖，并可为大豆属其它种、属内或与其它属间杂种的无菌播种和繁殖提供方法。
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权 利 要 求 书
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1、一种利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，种子灭菌及多年生野生大豆无菌苗的获得：取成熟的多年生野生大豆种子，用氯气或过饱和漂白粉精片溶液进行种子灭菌，用手术刀将种皮划破，将划破种皮的多年生野生大豆种子接种到萌发培养基上，经过培养得到无菌苗，为第二步提供植物材料；
所述萌发培养基为现有的MS培养基，B5培养基，或MS培养基的无机成分加上B5培养基的有机成分；
第二步，增殖及生根：待实生苗长至10cm，从无菌苗顶端向下3cm-4cm处切下茎端，将无菌苗茎段的植物学下端插入生根培养基中生根，作为第四步的材料，切去顶端的野生大豆实生苗作为第三步的材料； 所述生根培养基为MS固体培养基；
第三步，盆栽：将装有切去顶端的实生苗的瓶子打开，在培养室内生长3天，再移栽到装有灭菌的基质或土的盆中，待长出新枝后，将盆转移到户外，盆栽野生大豆在户外生长一周后移栽到田间；
第四步，第二步得到的已经生根的实生苗顶端幼茎，在生根培养基中经过半个月的培养，长出很多健康的根。
2、根据权利要求1所述的利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征是，第一步到第三步中，所述培养的温度为24℃-26℃。 3、根据权利要求1所述的利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征是，第四步中，如果需要继续繁殖，将已经伸长的茎端切下，重复第二步的步骤。
4、一种利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步，种子萌发：取成熟的多年生野生大豆种子，用手术刀将种皮划破。将划破种皮的多年生野生大豆种子接种到萌发培养基上，使种子萌发，为第二步提供植物材料；
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所述萌发培养基为现有的MS培养基，B5培养基，或MS培养基的无机成分加上B5培养基的有机成分；
第二步，盆栽：待种子萌发3-4天，种子长出幼根，脱掉种皮，将幼苗植入经过灭菌的土壤或基质中，一个月后，换盆移栽到田间。
5、根据权利要求4所述的利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征是，第一步中，所述萌发培养基中进行培养，其培养温度为24℃-26℃。
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说 明 书
利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法
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技术领域
本发明涉及一种农业技术领域的繁殖野生大豆的方法，具体涉及一种利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法。背景技术
多年生野生大豆是豆科(Leguminosae)、蝶形花亚科(Papiliomatae)、大豆属、Glycine亚属。Glycine亚属有22个多年生野生种。主要分布在澳大利亚及南太平洋岛屿，我国台湾及福建、广东沿海岛屿有G.tabacina Benth.(烟豆)和G.tomentella Hayata(短绒野大豆)2个种分布。大豆属还有soya亚属，有两个种，分别是栽培大豆(G.max Merr.)和一年生野生大豆(G.soja Sieb.&Zucc.)。一年生野生大豆是栽培大豆的祖先。野生大豆遍布东亚的中国、朝鲜、日本及俄罗斯远东地区。栽培大豆起源于中国。大豆属物种二倍体的基因组2n＝40。单倍体基因组分析、RFLP标记分析表明大豆是一个古四倍体，其基因组经过长期进化而二倍化。由于人类的干预，野生大豆资源的栖息地不断缩减，这些植物资源如同石油，矿产一样，是不可再生的。野生大豆被列为国家二级保护植物。Glycine亚属的野生种和栽培大豆相比，很多性状具有潜在的应用价值，如中日性、耐热、耐旱、耐冷、耐盐、抗大豆孢囊线虫、抗花叶病毒病、抗根腐病、花序多花性、荚的多粒性等。但迄今将野生多年生大豆的外源性状引入栽培大豆尚未成功。随着有性杂交和体细胞杂交研究的不断深入，以及基因克隆及基因转移技术的应用，可望使以前大豆改良中难以利用的种质资源加入大豆的育种计划中。
野生大豆都具有厚厚的种皮，或者种皮外长有泥膜，可以防止种子在不利生长的环境中因遇水吸涨而过早萌发。这个特性对于生长在原生境下野生大豆非常有利，但是对于需要在栽培条件下栽培和繁殖的野生大豆资源来讲，对于播种及出苗是不利的。尤其对于种子数量很少的多年生野生大豆资源，其繁殖主要存在
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两个问题：一是出苗率低。为使多年生野生大豆的种子及时萌发，常规的方法是在播种前破坏种皮，然后播种于土壤或基质中。但在田间种植时，过早划破种皮的种子往往受到土壤中微生物的影响，损失部分种子。在种子萌发后至成为壮苗之前，会遇到土壤害虫的为害，也会降低成苗率。另一个问题是，多年生野生大豆一粒种子只能长出一棵幼苗，对于在苗期材料，或者那些根部不能发出新枝的材料来说，一粒种子只能长成一棵植株，如果在收获成熟种子之前遇到不利环境，造成植株死亡就不能留下后代。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利申请号200410050905.6，发明名称为：万带兰的无菌播种和组织培养技术，该专利提出涉及一种万带兰的无菌播种和组织培养技术，采用人工营养基利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌实生苗的茎尖或茎节进行丛生芽的增殖并通过生根培养能形成完整植株。该专利涉及万带兰的无菌播种和组织培养繁殖的方法及所使用的培养基。是利用无菌播种，利用无菌实生苗的茎尖或茎节进行丛生芽的增殖。这种方法往往是利用无菌实生苗来得到茎尖，节间等来产生丛生芽，进行大量繁殖，而对于实生苗本身不再利用，这样对于一些珍稀材料，或种子很少的材料来讲，直接采用组织培养方式进行大量繁殖会有一些风险，必须保证有一定数量的种子，才能进行组织培养的方法增殖。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种利用组织培养技术高效繁殖多年生野生大豆的方法，既解决了种子数量少，进行组织培养方法增殖会损失种子的风险，也解决了目前多年生野生大豆繁殖出苗率低，以及在收获成熟种子之前遇到不利环境或因素，植株整株死亡，不能留下后代的问题。 本发明是通过以下技术方案实现的，根据繁殖材料性质和种子的数量的差别，可以采用以下两种方案，即在种子数量极少，每份遗传上同质的材料只有1-2粒种子时，采用方法一；当要繁殖的材料有2粒以上的种子，采用方法二。 所述方法一，包括以下步骤：
第一步，种子灭菌及多年生野生大豆无菌苗的获得：取成熟的多年生野生大豆种子，用氯气或过饱和漂白粉精片溶液进行种子灭菌，用手术刀将种皮划破。
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将划破种皮的多年生野生大豆种子接种到萌发培养基上，经过培养得到无菌苗，为“第二步”提供植物材料。如果只用种子直接繁殖，不需要组织培养增殖，此步骤不需要种子灭菌。
所述萌发培养基为现有的MS培养基、B5培养基或MS培养基的无机成分加上B5培养基的有机成分，培养温度为24℃-26℃。
第二步，增殖及生根：待实生苗长至10cm，从无菌苗顶端向下3cm-4cm处切下茎端，将无菌苗茎段的植物学下端插入生根培养基中生根，作为第四步的材料；切去顶端的野生大豆实生苗作为第三步的材料。
所述生根培养基为MS固体培养基，培养温度为24℃-26℃。为第三步的盆栽及第四步的继续增殖准备材料。
第三步，盆栽：将装有切去顶端的实生苗的瓶子打开，在培养室内生长3天，移栽到装有灭菌的基质(或土)的盆中。在24℃-26℃条件下培养，待长出新枝后，将盆转移到户外。盆栽野生大豆在户外生长一周后移栽到田间。如果该材料不能在当地室外越冬，则采用盆栽方式。
第四步，第二步得到的已经生根的实生苗顶端幼茎，在生根培养基中经过半个月的培养，长出很多健康的根。如果需要继续繁殖，可以将已经伸长的茎端切下，重复第二步的步骤。
所述方法二，包括以下步骤：
第一步，种子萌发：取成熟的多年生野生大豆种子，用手术刀将种皮划破。将划破种皮的多年生野生大豆种子接种到萌发培养基上，使种子萌发，为“第二步”提供植物材料。
所述萌发培养基为现有的MS培养基、B5培养基或MS培养基的无机成分加上B5培养基的有机成分，培养温度为24℃-26℃。
第二步，盆栽：待种子萌发3-4天，种子长出幼根，脱掉种皮，将幼苗植入经过灭菌的土壤或基质中，一个月后，换盆移栽到田间。如果该材料不能在当地室外越冬，则采用盆栽方式。
本发明虽然也是使用无菌播种及组织培养技术，但不同的是在无菌苗长到足够大之后，切下上端，将带有正常根系的下端移栽到土壤或基质中，使其成苗。
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这样用来播种得到无菌实生苗的种子也长成一棵植株，对于种子稀少的材料或杂交得到的种子可以采用这种方式繁殖，采用这种方法可以保证每一粒种子都能够得到健康的植株，同时利用组织培养的方式大量繁殖遗传上同质的植株。另外实生苗的根系强壮，将培养基中的实生苗移栽得到的植株，比经过丛生芽生根得到的植株强壮，根系发达，生长迅速，开花，结实早，移栽的成活率高。另外对于多年生野生大豆的繁殖，现有技术中尚没有使用无菌播种组织培养繁殖。 采用上述两种方法，从方法一的第一步至第三步，方法二的第一步至第二步，如果没有人为操作失误，种子的成苗率可以达到99％-100％。方法一经过第四步，一粒多年生野生大豆种子可以得到两株或两株以上更多的在遗传上同质的植株。该方法也可以用于杂交种F0代的繁殖，用较少的F0种子得到较多同质的F1植株，并得到更多的F1种子。这样对于杂交困难或者结实周期长的物种来说，只要一次杂交成功，一粒杂交种子就可以繁殖多个F1植株。因此这种方法不但可以用于资源的繁殖、保存，还可以用于杂交育种及科学研究，可以最大限度地利用种子及种质资源繁殖材料。
本发明可用于多年生野生大豆Glycine亚属22个种的材料的繁殖，并可为大豆属其它种、属内或与其它属间杂种的无菌播种和繁殖提供方法(对于种皮较薄，种子可以吸水萌发的种子，可以省去用刀划破中皮的步骤)。 具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 实施例1 步骤1：
种子灭菌：用漂白粉精片过饱和溶液浸泡野生大豆种子15分钟，无菌水漂洗3次或用氯气消毒2-10小时；
割破种皮：无菌条件下用手术刀将野生大豆种皮划破；
播种及萌发培养基：将划破种皮的种子接种到萌发培养基上，萌发培养基为MS、B5或MS无机+B5有机固体培养基；
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种子萌发培养：培养基上的种子在24℃-26℃条件下萌发。 步骤2
种子在萌发培养基中培养：待无菌实生苗长至10cm高时，切下上部茎端； 步骤3
生根：从无菌苗顶端向下3-4cm处切下茎段，将茎段的植物学下端插入生根培养基，生根培养基为MS固体培养基，培养温度为24℃-26℃；
移栽：将切去顶端的实生苗移栽到灭菌的基质(或土)的盆中。24℃-26℃条件下培养，待长出新枝后，将盆转移到户外，如果该材料不能在当地室外越冬，则采用盆栽方式； 步骤4
增殖：步骤2中得到的实生苗茎端，在生根培养基中长出健康的根(15天)。如需继续繁殖，将已经伸长的茎端切下，重复步骤2的操作，生根培养基为MS固体培养基，培养温度：24℃-26℃；
本实施例效果：从步骤第1步至第3步的成苗率达99％-100％，再通过第4步的增殖，一粒多年生野生大豆种子可以得到两株或两株以上更多的在遗传上同质的植株。
本实施例应用：该方法可用于杂交种F0代的繁殖，用较少的F0种子得到较多同质的F1植株，得到更多的F1种子。尤其适于杂交困难或者生长周期长的物种。该方法可用于资源的繁殖、保存，以及杂交育种及相关研究，可最大限度地利用种子繁殖材料。 实施例2 步骤1
种子灭菌、割破种皮、萌发培养基同实施例1。 种子萌发：培养基上的种子在24℃-26℃条件下萌发。 步骤2
种子在萌发培养基中培养及移栽：3天后长出幼根，将幼苗转移到灭菌的土壤或基质中。30天后移栽到室外(不能在陆地越冬时盆栽)。
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本实施例效果：只要种子能够正常萌发，成苗率可以达到99.5％-100％。 本实施例应用：该方法适用于种子较少的野生大豆材料(包括一年生野生大豆和多年生野生大豆)的繁殖。 实施例3 步骤1
种子灭菌、割破种皮、萌发培养基同实施例1。
种子萌发：培养基上的种子在室温萌发(18℃-28℃)。。 步骤2
种子在萌发培养基中培养及移栽：3-4天后幼苗移栽到灭菌的土壤或基质中(18-23℃，4d，23-28℃，3d)其余同实施例2。
本实施例效果：只要种子能够正常萌发，成苗率可以达到99.5％-100％。 本实施例应用：该方法适用于种子较少的野生大豆材料(包括一年生野生大豆和多年生野生大豆)的繁殖。 实施例4 步骤1
割破种皮：手术刀将野生大豆种皮划破。
萌发培养基：将种子种于改良的MS、B5或MS+B5固体培养基。 种子萌发：培养基上的种子在室温萌发(18℃-28℃)。。 步骤2同实施例3
本实施例效果：和实施例2相比，不需无菌操作，成苗率高可以达到99％-100％。
本实施例应用：适用种子较少的野生大豆材料、未成熟大豆种子的萌发和成苗，适合生产和科研单位用。
以上实施例中使用的培养基为现有技术，具体说明如下： 注：基本培养基配方(mg/L) MS固体培养基配方：
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无机成分：硝酸钾KNO3 1900，硝酸铵NH4NO3 1650，磷酸二氢钾KH2PO4170，硫酸镁MgSO4.7H2O 370，氯化钙CaCl2.2H2O 440，碘化钾KI 0.83，硼酸H3BO3 6.2，硫酸锰MnSO4.4H2O 22.3，硫酸锌ZnSO4.7 H2O 8.6，钼酸钠Na2MoO4.2 H2O 0.25，硫酸铜CuSO4.5 H2O 0.025，氯化钴CoCl2.620.025，乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA 37.3，硫酸亚铁FeSO24.7H2O 27.8。 有机成分：肌醇100，甘氨酸2，盐酸硫胺素VB1 0.1，盐酸吡哆醇VB60.5，烟酸VB5或VPP 0.5，蔗糖30000，琼脂10000。 Ph值：5.8。
B5固体培养基配方(mg/L)
无机成分：NaH2PO4·H2O(磷酸二氢钠)150，KNO3(硝酸钾)2500，(NH4)2SO4(硫酸铵)134，MgSO4·7H2O(硫酸镁)250，CaCl2·2H2O(氯化钙)150，Na-Fe-EDTA(乙二胺四乙酸铁钠)28，MnSO4·H2O(硫酸锰)10，H3BO3(硼酸)3.0，ZnSO4·7H2O(硫酸锌)2.0，NaMoO4·2H2O(钼酸钠)0.25，CuSO4·5H2O(硫酸铜)0.025，CoCl2·6H2O(氯化钴)0.025，KI(碘化钾)0.75。
有机成分：盐酸硫胺素10，盐酸吡哆素1，烟酸1，肌-肌醇100，蔗糖20000。琼脂10000。 pH值：5.5。
改良的MS固体基本培养基、改良的B5固体基本培养基和改良的MS无机+B5有机固体培养基：其它成分分别同MS固体基本培养基、B5固体基本培养基和MS无机+B5有机固体培养基，只是不加蔗糖。
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