流体剪切力对MC3T3-E1细胞OPG、RANKL蛋白表达的实验研究

・８４０・　主垦塑　科杂志２０１０年９月第ｌ０卷第９期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｉｎ　Ｉｎｖ　Ｓｕ　，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０１０．Ｖ０１．１０．Ｎ０．９　实验研究・　流体剪切力对ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬ蛋白　表达的实验研究　张　超　夏亚一　李　鹏　何万庆　王海明　汪　静　王翠芳　７３００３０）　（兰州大学第二医院骨科研究所，兰州【摘要】　目的探讨流体剪切力（ｆｌｕｉｄ　ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ，ＦＳＳ）作用下，两种调节骨骼重建的重要分子骨保护素（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ，　采用体外模　ＯＰＧ）和细胞核因子ＫＢ受体活化因子配体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ．ＫＢ　ｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）的蛋白表达情况。　方法型对ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞加载流体剪切力，细胞经不同时间加力后（０，３０，６０，９０，１２０　ｍｉｎ），对细胞分别进行染色和裂解，运用免疫　荧光和蛋白印迹法对ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的蛋白表达水平进行定量分析。　结果　ＦＳＳ作用３０，６０，９Ｏ，１２０　ｍｉｎ后能够显著增加　ＯＰＧ的蛋白表达（Ｐ＜０．０５），减少ＲＡＮＫＬ的蛋白表达（Ｐ＜０．０５）。两者共同作用使得ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ值显著增高（Ｐ＜０．０５）。　结论流体剪切力刺激提示ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值可能在成骨细胞和破骨细胞联合调节骨骼形成和吸收的过程中起着重要的　调节作用。　【关键词】　流体剪切力；　骨保护素；　破骨细胞分化因子；　ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞　中图分类号：Ｒ一３３２　文献标识：Ａ　文章编号：１００９—６６０４（２０１０）０９—０８４０—０５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｆｌｕｉｄ　Ｓｈｅａｒ　Ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＯＰＧ　ａｎｄ　ＲＡＮＫＬ　ｉｎ　ＭＣ３　Ｔ３－Ｅ１　Ｃｅｌｌｓ　Ｚｈａｎｇ　Ｃｈａｏ，Ｘｉａ　Ｙａｙｉ，Ｌｉ　Ｐｅｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００３０，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｆｕｉｄ　ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ（ＦＳＳ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）ａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ—ＫＢ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｗｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ａｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｏｄｅｌ　ｔｏ　ｌｏａｄ　ＦＳＳ　ｏｎ　ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｄｕｒａｔｉｏｎｓ（０，３０，６０，９０，ａｎｄ　１２０　ｍｉｎ），ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＯＰＧ　ａｎｄ　ＲＡＮＫＬ　ｗｅｒｅ　ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｗｈｅｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌｙｓｅｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＯＰＧ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ＲＡＮＫＬ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ａｔ　３０，６０，９０，ａｎｄ　１２０　ｍｉｎ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｒａｉｓｅ　ｏｆ　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ　ｒａｔｉｏ（Ｐ＜０．０５）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ＯＰＧ　ｔｏ　ＲＡＮＫＬ　ｃａｎ　ｂｅ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．　【Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ】　Ｆｌｕｉｄ　ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ；　Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）；　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ—ＫＢ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）；　ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１　ｃｅｌｌｓ　自１９９７年发现骨保护素（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ，ＯＰＧ）　ＲＡＮＫＬ结合不但阻止骨组织的吸收，而且减少了破　和细胞核因子ＫＢ受体活化因子配体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ．ＫＢ　ｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）后，大量的研究结　骨细胞的产生。因此，深入探讨流体剪切力（ｆｌｕｉｄ　ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ，ＦＳＳ）作用下ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的蛋白表　达机制是很有必要的。以往的研究证实，应力刺激　果显示ＯＰＧ与ＲＡＮＫＬ的平衡直接影响着骨组织代　谢¨０　。ＲＡＮＫＬ是一种膜结合蛋白，它可以和前破　骨细胞上的细胞核因子ＫＢ受体活化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　可以影响成骨细胞中前列腺素Ｅ　（ＰＧＥ　）、雌激素、　ＴＮＦ、ＩＬ、等因子的表达　，这些因子又分别通过不　同的途径对ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的表达产生影响，进而调　节骨组织的代谢。本实验通过研究处于骨组织代谢　中心环节的两种分子ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ在不同时段的　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ．ＫＢ，ＲＡＮＫ）结合从而激活前破骨细　胞　Ｊ，使其分化为破骨细胞，故也称为破骨细胞分　化因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ，ＯＤＦ）　在骨质　形成和吸收中发挥作用。间质和成骨细胞都可表达　ＯＰＧ，它是ＲＡＮＫ的一种竞争性抑制剂　，ＯＰＧ与　流体剪切力作用下蛋白表达的变化，探讨流体剪切力　对促进骨组织形成和抑制骨组织吸收的作用。　・基金项目：甘肃省自然基金（０９６ＲＪＺＡ０６８）　・・通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉａｙａｙｉ＠１２６．ｃｏｒｎ　中国微创外科杂志２０１０年９月第ｌ０卷第９期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｉｎ　Ｉｎｖ　Ｓｕｒｇ，Ｓｅ　・８４１・　１材料与方法　中，用０．０１％磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）冲洗１０　ｍｉｎ，吸出洗液加入４％多聚甲　１．１细胞培养　将小鼠胚胎细胞系ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞植入无菌细　醛固定细胞，室温孵育１０　ｍｉｎ，弃多聚甲醛后ＰＢＳ　冲洗３次，每次５　ｍｉｎ，加入０．２％聚乙二醇辛基苯　基醚（ＴｒｉｔｏｎＸ一１００）透化去交联５　ｍｉｎ，弃ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　后ＰＢＳ冲洗１０　ｍｉｎ，加人１％牛血清白蛋白封闭非　胞培养瓶中，瓶中加入含有１０％胎牛血清和１００　Ｕ／ｍｌ青霉素、链霉素的培养基，放人温度３７　ｏＣ、ＣＯ：　饱和度５％的孵育箱中培养，细胞每隔３天换液一　次。同时观察细胞形态和生长状态，当细胞生长面　积达到瓶底面积的８０％时，用０．２５％胰酶一０．１％ＩＩ　特异性位点３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗１０　ｍｉｎ，弃液。每张爬　片滴加３０　ｌ稀释好的一抗（１：１００），放入湿盒４℃　冰箱孵育过夜。次日，ＰＢＳ冲洗３次，每次１０　ｍｉｎ，　型胶原酶消化，按照５×１０　个细胞接种于无菌培养　瓶中，取第三代稳定的传代细胞用于应力加载实验。　１．２应力加载装置　应力加载系统由蠕动泵、硅胶导管、流体小室、　储液管组成。储液管、硅胶导管和流体小室形成了　一个闭合的回路，用蠕动泵挤压使得液体流动。其　中流体小室由两块透明的有机玻璃组成，上方的有　机玻璃前端和后端分别有进液口和出液口通过硅胶　导管与储液管相连，下方的有机玻璃板中间凿有载　玻片大小的凹槽，以便载玻片全部卡入凹槽，使细胞　受到流体剪切力作用。流体小室的尺寸设计基于　Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ流动腔模型　，置入盖玻片的凹槽长５　ｅｍ，宽２．５　ｅｍ，高０．２　ｍｍ。该凹槽的大小满足长、　宽远远大于高，长／高远远大于１Ｏ，能够保证液体流　过时层流、二维流动充分发展为标准的液流，使得实　验细胞均匀受力。流室底面剪切力计算公式是：Ｔ：　６．ｑＱ／Ｈ　×Ｗ。１１：流体液的黏滞系数（ｄｙｎ／ｃｍ　）；Ｑ：　单位时间内流经流体小室的液量（ｅｍ　／ｓ）；Ｈ：流室　高度（ｅｍ）；Ｗ：流室宽度（ｅｍ）。　１．３细胞爬片加力　对状态良好的ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞进行消化，按照　１×１０。个细胞均匀接种到放有盖玻片（用Ｉ型鼠尾　胶原包被，以便细胞爬片）的无菌培养皿中，每次传　４个培养皿，每个皿中放人３张盖玻片（１０张进行实　验，即ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ实验组各５张，分别加载０，　３０，６Ｏ，９０，１２０　ｍｉｎ的流体剪切力；另外２张作为备　用），然后将培养皿置于ＣＯ　培养箱中继续培养，待　细胞均匀爬满盖玻片，以备加力时使用。将灭菌后　的加力装置连接好放入３７　ｃＣ恒温箱内，储液管中加　入４０　ｍ１培养基作为流体液。在无菌条件下，迅速　取出爬满细胞的盖玻片，细胞面向上嵌人流体小室　下层的凹槽中，启动精密蠕动泵提供１２　ｄｙｎ／ｅｍ　的　流体剪切力对细胞进行加力，加力装置连接５％　ＣＯ：以维持流体液ｐＨ值在７．２～７．４之间。　１．４免疫荧光实验　将完成加力后的盖玻片放入准备好的培养皿　避光条件下加入３０　ｌ稀释好的二抗（１：１５０），室温　孵育３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗３次，每次１０　ｍｉｎ，封片后荧　光显微镜下镜检每张玻片选２个不同的视野拍照。　以上实验重复３次，用ＩＰＰ软件分析各水平蛋白表　达的累积光密度值。　１．５蛋白印迹实验　将完成加力的盖玻片迅速放入冰盒内，ＰＢＳ冲　洗２次，加入细胞裂解液进行裂解，所得的产物即为　总蛋白，运用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法可以测定各加力水平细胞　的总蛋白浓度，将样本以相同的蛋白量加人电泳槽　中，选择６％（分离胶）和１２％（浓缩胶）的十二烷基　硫酸钠（ＳＤＳ）一聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，转膜　后用ＰＢＳ漂洗３０　ｍｉｎ，５％脱脂奶粉封闭２　ｈ后，再　次洗膜３０　ｍｉｎ，加入～抗（１：５００）４℃冰箱孵育过　夜。次日，再次洗膜３０　ｍｉｎ，加入辣根过氧化物酶　（ＨＲＰ）标记二抗（１：１０００），室温下孵育６０　ｍｉｎ，暗　室中细胞外基质（ＥＣＭ）显色液显影，Ｘ光胶片曝　光。以上实验重复３次，ＩＰＰ软件分析各水平蛋白　表达的累积光密度值。　１．６软件分析　运用ＳＰＳＳ１６．０软件进行数据分析，实验数据采　用　±ｓ表示，对不同作用时间段ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ在　细胞中蛋白表达的差异采用单因素方差分析，进一　步两两比较使用ＳＮＫ检验，Ｐ＜０．０５表示差异有统　计学意义；图像采用Ｉｍａｇｅ．ｐｒｏ－ｐｌｕｓ６．０进行分析；图　表采用ＳｉｇｍａＰｌｏｔｌ０．０软件制作。　２　结果　２．１　ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的蛋白表达　运用１２　ｄｙｎ／ｃｍ　的流体剪切力对ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１　细胞分别加载０，３０，６０，９０，１２０　ｍｉｎ后，荧光显微镜　下观察ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ不同时间段的表达情况（图　１）。运用积分光密度值对不同时间段ＯＰＧ和　ＲＡＮＫＬ在细胞内的表达情况进行半定量分析。结　果显示：ＦＳＳ作用３０，６Ｏ，９０，１２０　ｍｉｎ后能够显著增　加ＯＰＧ的蛋白表达（Ｐ＜０．０５），图１中随着加力时　・８４２・　中国微创外科杂志２０１０年９月第！　鲞箍！塑　！　垡！　堡竺　！　！　：　！！：！　：　！：！　间的延长，ＯＰＧ荧光亮度增加，这表明ＯＰＧ的蛋白　表达相应增加；同时ＦＳＳ也可以减少ＲＡＮＫＬ的蛋　明ＲＡＮＫＬ的蛋白表达相应减少。两者共同作用，　随着加力时问的延长，ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ值显著增高　（Ｐ＜０．０５）。具体数据见表１。　白表达，但是该作用没有ＯＰＧ的变化显著，图１中　随着加力时间的延长，ＲＡＮＫＬ荧光亮度降低，这表　６０ｍｉｎ　９０ｍｉｎ　图１　ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ在ＦＳＳ作用不同时间后免疫荧光表达（×４０）　随ＦＳＳ作用时间延长。ＯＰＧ荧光亮度增加。表达增多；ＲＡＮＫＬ荧光亮度降低，表达减少　表１　ＦＳＳ作用不同时间ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的积分光密度值（免疫荧光）（　±ｓ，ｎ＝３０）　４个实验组ＯＰＧ、ＲＡＮＫＩ　、ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ与对照组两两比较，均Ｐ＝０．０００　２．２　ＯＰＧ及ＲＡＮＫＩ　蛋白印迹结果　运用１２　ｄｙｎ／ｃｍ　的流体剪切力对ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细　胞分别加载０，３０，６０，９０，１２０　ｍｉｎ后，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　３　讨论　应力包括基底牵张力、流体剪切力和压应力等，　骨细胞所能感受到的应力强度为８～３０　ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法研究ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ在不同时间段的表　达情况（图２）。通过积分光密度值对不同时间段　ｄｙｎ／ｃｍ　。尽管骨组织特殊的腔隙——小管网络　ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ在细胞内的表达情况进行定量分析。　结果表明：ＦＳＳ作用３０　ｍｉｎ后，ＯＰＧ的表达开始增加，　当作用６０　ｍｉｎ后，ＯＰＧ的增长趋势到达高峰，与０　ｍｉｎ相比增加了５０％左右，而后增长趋势有所减慢，　结构决定了流体剪切力对骨组织的特殊作用…　，但　是有关流体剪切力作用下成骨细胞所做出应答的研　究却较少。本实验通过调节蠕动泵的转数将流体剪　切力控制在ｌ２　ｄｙｎ／ｃｍ　对ＭＣ３Ｔ３．Ｅ１细胞中ＯＰＧ　和ＲＡＮＫＬ的蛋白表达进行了研究，因为ＯＰＧ和　ＲＡＮＫＬ的表达直接影响着成骨细胞和破骨细胞的　但各组之间增加显著（Ｐ＜０．０５）；同时ＦＳＳ也可以减　少ＲＡＮＫＬ的表达，这一作用在９０　ｍｉｎ时达到高峰，　与０　ｍｉｎ相比减少了３０％左右，但ＲＡＮＫＬ的变化趋　势相对较缓。两者共同作用，随着加力时间的延长，　功能，进而影响着骨组织形成与代谢的动态平衡，因　此将ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值作为量化成骨活性的标　准，从而揭示流体剪切力对骨组织代谢的调节作用。　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ值显著增高。具体数据见表２。　中国微创外科杂志２０１０年９月箍　堂箜！塑　！　！垡！　！　竺　！　！　！！：！　：　！：！　・８４３・　Ｂ—ａｃｌｉｎ　ＯＰＧ　ＲＡＮＫＬ　图２　ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ在ＦＳＳ作用不同时间后蛋白印迹表达　随ＦＳＳ作用时间延长。ＯＰＧ蛋白量表达增多；ＲＡＮＫＬ蛋白量表达减少　表２　ＦＳＳ作用不同时间ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的积分光密度值（蛋白印迹）（ｘ±ｓ。Ｈ＝３０）　各实验组与对照组两两比较，ＯＰＧ　０　ｍｉｎ　ＶＳ　３０　ｍｉｎ　Ｐ＝０．０１１，ＲＡＮＫＬ　０　ｍｉｎ　ＶＳ　３０　ｒａｉｎ　Ｐ＝０．００７，其余均Ｐ＝０．０００　Ｔｙｒｏｖｏｌａ等　证实ＲＡＮＫＬ可以与前破骨细胞　等　运用基底形变给小鼠骨细胞加力也使得　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值增加，但是与基底牵张力只减少　ＲＡＮＫＬ的量相比。本实验中ＦＳＳ一方面增加ＯＰＧ　的表达，另一方面还减少ＲＡＮＫＬ的表达，使　ＯＰＧ／ＰＡＮＫＬ的比值增加更显著。　上的ＲＡＮＫ结合从而激活前破骨细胞，使其分化为　破骨细胞，使得骨组织向着加速吸收的方向发展。　而ＯＰＧ是ＲＡＮＫ的一种竞争性抑制剂，ＯＰＧ与　ＲＡＮＫＬ结合不但阻止骨组织的吸收，而且减少了破　骨细胞的产生。本实验中，空白组（０　ｍｉｎ）细胞处于　静态培养状态下，ＯＰＧ的表达较少，相应的ＲＡＮＫＬ　的蛋白表达则较为丰富。随着培养时间的延长，　ＲＡＮＫＬ的表达继续增加，这导致ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比　骨骼细胞对流体剪切力作用更加敏感且有效。　加力６０　ｍｉｎ后，ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值增长最为显著。　在这一时期，ＦＳＳ进一步促进了ＯＰＧ的表达，相反　ＲＡＮＫＬ的蛋白表达则被抑制。ＦＳＳ在促进成骨细　胞产生的同时也抑制了破骨细胞的形成和活化，从　值降低，ＲＡＮＫＬ的增多可以促进破骨细胞的形成，　使骨组织代谢向着加快吸收的方向发展，这也许可　以说明长期卧床缺乏运动的病人由于应力对骨骼的　刺激减少，使得ＯＰＧ的表达减少，相反ＲＡＮＫＬ的表　达增加，破骨细胞形成增多，最终导致骨质疏松的发　生。　而抑制了骨组织的吸收，使得骨组织向着成骨的方　向发展。Ｗａｎｇ等　用基底牵张力给成骨细胞加　力，需要６～１２　ｈ的连续作用才能有效，而ＦＳＳ的作　用在６０　ｍｉｎ后就显示出同样的效果，这说明成骨细　胞对ＦＳＳ响应更快。各种形式的应力最终以牵拉和　剪切的形式作用于骨骼细胞，其中又以ＦＳＳ作用最　为重要。刘易军等　证实，ＦＳＳ可以在很短时间内　增加细胞内钙离子的水平，可在数十分钟内增加前　列腺素的产量，而前列腺素可以在短时间内导致　ＲＡＮＫＬ表达减少，同时使ＯＰＧ表达增加。这也与　成骨细胞对ＦＳＳ的响应要经历一个短暂的潜伏　期，但ＦＳＳ的作用较显著。加力３０　ｍｉｎ后，阻滞了　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ变小的趋势，蛋白检测提示ＦＳＳ促进　了ＯＰＧ的表达，抑制了ＲＡＮＫＬ的表达，二者的协同　作用使ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值较０　ｍｉｎ组有所增加，　但这种增加较轻微，可能是ＦＳＳ对ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞　的作用要经历一个短暂的潜伏期。尽管Ｒｕｂｉｎ　我们的研究不谋而合，加力６０　ｍｉｎ后ＯＰＧ的表达增　加最大，ＲＡＮＫＬ减少最多，ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ增加最显　・８４４・　主圄　型盘查　生！旦箜　鲞箜　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｉｎ　Ｉｎｖ　Ｓｕｒｇ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１０，Ｖｏ１．１０．Ｎｏ．９　著。同时，Ｋａｎｚａｋｉ等　运用挤压力对牙周膜细胞　进行加力时观察到，ＲＡＮＫＬ的表达有所增加，但是　ＯＰＧ的表达没有发生变化。Ｍａｄｄｉ等¨　运用超声　波对成骨细胞进行作用，观察到与对照相比ＯＰＧ的　表达明显增加，但ＲＡＮＫＬ的表达无变化。相比之　下，本实验运用ＦＳＳ对ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１细胞加力，一方面　增加了ＯＰＧ的表达，另一方面抑制了ＲＡＮＫＬ的表　达，二者的协同作用使ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ显著增加。这　些结果提示，与其他机械刺激相比，ＦＳＳ对成骨细胞　中ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的表达更加有效。　流体剪切力对ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的作用影响骨组　织形成与吸收的动态平衡。加力９０　ｍｉｎ后，　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值仍在增大，但ＯＰＧ的增长及　ＲＡＮＫＬ的减少趋势较６０　ｍｉｎ时相对放缓，说明成　骨组织逐渐适应了ＦＳＳ的作用，对ＦＳＳ的敏感性有　所下降。在１２０　ｍｉｎ内，加力的时间越长，　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ的比值增长得越多，这说明对成骨细胞　而言ＦＳＳ可能具有剂量依赖性和可蓄积性。张成俊　等¨副证实，一些影响成”　胞增殖周期的因子　ＣＤＫ２和ＣＤＫ４对ＦＳＳ作用也具有剂量依赖性和可　蓄积性。与Ｔｉｎｔｕｔ等　相同，本实验中流体剪切　力对ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的作用使得大量的ＯＰＧ中和　了ＲＡＮＫＬ，造成破骨细胞的产生和活化障碍并且促　进破骨细胞的凋亡，进一步影响了骨组织新陈代谢　的动态平衡。　在本研究中，流体剪切力对ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ的　影响在蛋白水平被定量化，流体剪切力作为骨组织　新陈代谢的重要调节器之一得到验证，流体剪切力　对ＯＰＧ的上调和对ＲＡＮＫＬ的下调作用直接影响着　成骨细胞和破骨细胞，进而影响骨组织代谢的动态　平衡，有关这方面的研究将在骨组织形成和修复、生　物工程、骨质疏松及骨病的研究和治疗中发挥巨大　的作用。因此，详尽地研究流体剪切力与骨组织的　关系对了解骨组织的作用具有重大意义。　参考文献　１　Ｈｏｆｂａｕｅｒ　ＬＣ．ＫＵｈｎｅ　ＣＡ．Ｖｉｅｒｅｃｋ　Ｖ．Ｔｈｅ　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｂｏｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ　Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ，２００４，４（３）：２６８—２７５．　２　Ｎａｇａｉ　Ｍ，Ｓａｔｏ　Ｎ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅ０ｃｌａｓｔ０ｇｅｎｅｓＩｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｏｓｔｅｏｅｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｅｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２５７：　７ｌ９—７２３．　３　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　Ｍ．ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ／ＯＰＧ　ｄｕｒｉｎｇ　ｏｒｔｈｏｄｏｎｔｉｃ　ｔｏｏｔｈ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ．Ｏｒｔｈｏｄ　Ｃｒａｎｉｏｆａｃ　Ｒｅｓ，２００９，１２（２）：１１３—１１９．　４　Ｔｓｕｄａ　Ｅ，Ｇｏｔｏ　Ｍ，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｔｈａｔ　ｓｐｅｃｉｉｆｃａｌｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７，２３４：１３７—１４２．　５　Ｍｕｌｌｅｎｄｅｒ　Ｍ，Ｅｌ　Ｈａｊ　ＡＪ，Ｙａｎｇ　Ｙ．Ｍｅｅｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ：ｍｅｅｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ．Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ　Ｅｎｇ　Ｃｏｍｐｕｔ，　２００４，４２（１）：１４—２１．　６　Ｋｉｄｏ　Ｓ，Ｋｕｒｉｗａｋａ　Ｒ，Ｉｍａｍｕｒａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１　１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｏ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．　Ｂｏｎｅ，２００９，４５（６）：１１２５—１１３２．　７　Ｇｅｎｅｔｏｓ　ＤＣ，Ｇｅｉｓｔ　ＤＪ，Ｌｉｕ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｆｌｕｉｄ　ｓｈｅａｒ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ＡＴＰ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，２０（１）：４１—４９．　８　庄礼贤，夷协远，马晖扬．流体力学．合肥：中国科学技术大学出　版社，１９９１．１３５—１３７．　９　Ｓｗａｎ　ＣＣ，Ｌａｋｅｓ　ＲＳ，Ｂｒａｎｄ　ＲＡ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ　ｂａｓｅｄ　ｐｏｒｏｅｌａｓｔｉｃ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｌｆｕｉｄ　ｌｆｏｗ　ｉｎ　Ｈａｖｅｒｓｉａｎ　ｂｏｎｅ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｃｈ　Ｅｎｇ，　２００３，１２５：２５—３７．　１Ｏ　Ｙｏｕ　Ｊ，Ｙｅｌｌｏｗｌｅｙ　ＣＥ，Ｄｏｎａｈｕｅ　ＨＪ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｒｅ　ｌｅｓｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ｔｏ　ｂｏｎｅ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｏ　ｌｏａｄｉｎｇ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｅｉｌｌａｔｏｒｙ　ｆｌｕｉｄ　ｆｌｏｗ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｃｈ　Ｅｎｇ，　２０００，１２２：３８７—３９３．　１１　Ｂｕｒｇｅｒ　ＥＨ，Ｋｌｅｉｎ・Ｎｕｌｅｎｄ　Ｊ，Ｂａｋｋｅｒ　ＡＤ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｔｏ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｔｉｃ　ｖｅｒｓｕｓ　ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ　ｄｏｎｏｒｓ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ，２００６，１７（６）：８２７—８３３．　ｌ２　Ｔｙｒｏｖｏｌａ　ＪＢ，Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓ　ＭＮ，Ｍａｋｏｕ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｒｏｏｔ　ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ　ｓｙｓｔｅｍ：ａ　ｍｉｎｉ　ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｓｅｉ，２００８，　５０（４）：３６７—３７６．　１３　Ｒｕｂｉｎ　Ｊ，Ｍｕｒｐｈｙ　Ｔ，Ｎａｎｅｓ　ＭＳ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｓｔｏｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，２７８：Ｃ１　１２６—１　１３２．　ｌ４　Ｗａｎｇ　Ｙ，ＭｃＮａｍａｒａ　ＬＭ，Ｓｅｈａｔｔｌｅｒ　ＭＢ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ｉｎ　ｆｌｏｗ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉ０ｎ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，２００７，１０４（４０）：１５９４１—１５９４６．　１５　刘易军，盂广伟，宫赫，等．人工加载对悬吊大鼠骨组织形态计　量学影响的实验研究．中国生物医学工程学报，２００８，２７（６）：　８３８—８４１．　Ｋａｎｚａｋｉ　Ｈ，Ｃｈｉｂａ　Ｍ，Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｕｎｄｅｒ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅ　０ｓｔｅ０ｃｌａｓｔ０ｇｅｎｅ８ｉ８　ｂｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａＢ　ｌｉｇａｎｄ　ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｖｉａ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ，２００２，１７（２）：２１０—　２２０．　１７　Ｍａｄｄｉ　Ａ，Ｈａｌ　Ｈ，Ｏｎｇ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｎｇ　ｗａｖｅ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｍａｙ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｂｏｎｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｌｔｅｒｉｎｇ　ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ　ｒａｔｉｏ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｎｅ，２００６，３９：２８３—２８８．　１８　张成俊，夏亚一，王常德，等．流体剪切力下ＳＩＶＡ・１凋亡诱导因　子促成骨细胞增殖分化的双向调节作用．中国微创外科杂志，　２００９，９（８）：７４１—７４６．　１９　Ｔｉｎｔｕｔ　Ｙ，Ｄｅｍｅｒ　Ｌ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｌｉｇａｎｄｓ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｅ　ｃａｌｃｉｉｆｃａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ　Ｍｅｄ，　２００６，５４（７）：３９５—４０１．　２０　Ｓａｎｎｄｅｒｓ　ＭＭ，Ｔａｙｌｏｒ　ＡＦ，Ｄｕ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ　ＭＧ－６３　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ，２００６，（３９）：１４１９—１４２７．　（收稿日期：２０１０—０２—１１）　（修回日期：２０１０—０４—２２）　（责任编辑：王惠群）