豆渣中大豆异黄酮不同提取方法对比研究

ＨＯＲＩＺＯＮ　ＯＦ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＡＮＤ　ＴＥＣＨＮＯＩ　ＯＧＹ　ｌ科技视野　亘渣中大豆导黄酮不同提取方法时比研究　李万林钟姣姣刘军海　（陕西理工学院化学与环境科学学院）　［中图分类号］Ｓ一３　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００２—８３５８（２０１４）０７—４１—４　摘要：本课题以豆渣为原料．通过比较不同提取方法　津泰斯特仪器有限公司）：ＤＺＦ一６０２０型真空干燥箱（上海精　宏实验仪器有限公司）；ＳＨＢ型循环水式真空泵（郑州长城　科工有限公司）；ＢＳＩ１０Ｓ型电子天平（日本ＡＮＤ）等。　１．１＿３试剂　对豆渣中大豆异黄酮提取率的影响，以异黄酮提取率为指　标，分别采用超声波辅助和微波辅助提取大豆异黄酮。在单　因素实验基础上，通过正交试验确定最佳工艺条件。结果表　明，从豆渣中提取大豆异黄酮的最佳工艺是超声辅助提取　法，其最佳工艺条件为：料液比１：２０．乙醇浓度８０％，超声时　间２０　ｍｉｎ，超声温度５Ｏ℃，在此最佳工艺条件下．大豆异黄　芦丁标准品（生产批号１０００８０—２００７０７，上海哈灵生物　科技有限公司）、亚硝酸钠（５％）、硝酸铝（１０％）、氢氧化钠　（４％）、无水乙醇等试剂均为市售ＡＲ级。　１．２实验工艺流程　酮的平均提取率为０．３９４２％。　关键词：豆渣；超声波；微波；异黄酮　豆渣一干燥一脱脂一乙醇为提取液超声提取异黄酮一　冷却—＋过滤—　离心—　备用。　大豆异黄酮在医药保健和饲料生产中已经被广泛应用，　是目前国际上公认的一种安全有效的天然植物雌激素．它的　保健功效和类雌性激素生物活性已得到科学的认证　１９７４　年匈牙利科学家首次将异黄酮用于饲料添加剂。大豆中有　９７％～９８％的异黄酮是以葡萄糖苷的形式存在。大豆异黄酮　１．３最大吸收峰波长的确定　准确称取干燥豆渣粉末２．Ｏ０ｇ，８０％的乙醇溶液为提取　剂，料液比为１：２０（豆渣２．００ｇ：８０％乙醇溶液４０　ｍＬ）在超卢　温度为５０℃，超声时间为２０　ｍｉｎ的条件下，提取大豆异黄　酮，提取液冷却后过滤，离　ｆｌ，，用移液管小　ｆｌ，吸取上层清夜５　具有降血脂、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用　大豆　异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，具有　广泛的生物活性。在家禽的应用研究中发现，日粮中添加适　量的大豆异黄酮能显著促进家禽生长、调控机体养分代谢、　ｍＬ。加入５％亚硝酸钠０．３　ｍＬ混匀，静置６　ｍｉｎ；再加入１０％　的硝酸铝０．３　ｍＬ，混匀静置６　ｍｉｎ后再加入４％氢氧化钠３　ｍＬ摇匀静置１５　ｍｉｎ后．以所用的试剂混合液做空白．用　Ｃａｒｙ一５０００型分光光度计在４００—５００　ｎｍ波长范围扫描．确　定波长。　１．４标准品的选取与标准曲线的绘制　以芦丁为标准品．采用硝酸铝显色法，在５００　ｎｍ波长　下进行测定。准确称取干燥的芦丁，用３０％乙醇水溶液配置　成浓度为０．２１２２　ｇ／ｍＬ的标准溶液，置于冰箱备用。准确吸　取上述贮备液１．０、２．Ｏ、３．０、４．０、５．０、６．０　ｍＬ分别置于２０　ｍＬ　比色管中，各加入５％亚硝酸钠０．３　ｍＬ混匀．静置６　ｍｉｎ：再　改善饲料利用率、提高产蛋率、延长产蛋期并具有抗氧化作　用，可改善动物产品品质，提高动物免疫机能等作用　１材料与方法　１．１仪器、试剂及原料　１．１＿１原料预处理　豆渣，粉碎后分别过２Ｏ目、３６目、６０目、８０目筛，保存　在烘箱里５０　条件下烘至绝干备用。　１．１．２仪器　加入１０％的硝酸铝０．３　ｍＬ．混匀静置６　ｍｉｎ后再加入４％氢　氧化钠３　ｍＬ摇匀静置１５　ｍｉｎ后，以所用的试剂混合液做空　白．在５００　ｎｍ波长处测取吸光度。以芦丁的含量Ｃ为横坐　标，吸光度（Ａ）为纵坐标，绘制标准曲线。　２豆渣中提取大豆异黄酮的工艺　微波快速反应器（北京瑞利分析仪器公司）；超声波清洗　机（宁波新生物科技股份有限公司，６００Ｗ）；７２２Ｅ型紫外可　见分光光度计（上海光谱仪器厂）：ＦＷＩ１７中草药粉碎机（天　基金项目：陕西理工学院大学生科技爱好者协会——　大学生创新实验项目（项目编号ＵＩＲＰ１４００２）。　２．１超声辅助提取法　２．１．１料液比对大豆异黄酮提取率的影响　饲料广角・４１　科技视野ｌ　ＨＯＲＩＺＯＮ　ＯＦ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＡＮＤ　ＴＥＣＨＮＯＩ　ＯＧＹ　准确称取干燥的豆渣粉末２．００　ｇ，以８０％的乙醇溶液为　浸提剂浸提１ｈ后，在超声温度为５０℃．超声时间为２０　ａｉｒｎ，　在料液比分别为１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０的情况下提取大　提取液冷却后过滤，离一ｔｌ，，用移液管小心吸取上清夜５　ｍＬ放　人１０　ｍＬ具塞试管中，其他步骤按照最大吸收峰波长确定的　实验过程操作，测定吸光度，计算提取率，结果如图３所示。　２．１．４超声温度对大豆异黄酮提取率的影响　豆异黄酮，提取液冷却后过滤，离心，用移液管小心吸取～ｈ　清夜５　ｍＬ放入１０　ｍＬ具塞试管中，其他步骤按照最大吸收　峰波长确定的实验过程操作，测定吸光度，计算提取率，结　果如图１所示　准确称取干燥的豆渣粉末２．００ｇ，８０％乙醇溶液为浸提刹　浸提１　ｈ后，在料液比１：２０，超声时间２０ｒａｉｎ的条件下．改变　超声温度分别在４０、４５、５０、５５、６０℃提取大豆异黄酮，提取　液冷却后过滤．离心，用移液管小心吸取上清夜５　ｍＬ放人　１０　ｍＬ具塞试管中，其他步骤按照最大吸收峰波长确定的实　验过程操作，测定吸光度，计算提取率．结果如图４所示　２．１－２乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响　准确称取干燥的豆渣粉末２．００　ｇ，分别用７０％、７５％、　８０％、８５％、９０％的乙醇溶液为浸提剂浸提１　ｈ后，在料液比　１：２０．超声温度５０℃．超声时间２０　ｍｉｎ的条件下，提取大豆　异黄酮，提取液冷却后过滤，离心，用移液管小心吸取上清　夜５　ｍＬ放人１０　ｍＬ具塞试管中，其他步骤按照最大吸收峰　波长确定的实验过程操作，测定吸光度，计算提取率，结果　如图２所示　拿　时　５　１０　１　５　２０　２５　３０　３５　时柳（ｗｉｎ）　鬟　图３提取时间对大豆异黄酮提取率的影响　Ｏ　３９　０　３８　０　３７　图１　料液比对大豆异黄酮提取率的影响　Ｏ　４　整０斟　＿３６　０　３５　０　３４　Ｏ．３６　薯０　３２　３５　４０　４５　５０　５５　６０　６５　鐾。－ｚｅ　ｏ　２４　温度（　Ｃ）　图４超声温度对大豆异黄酮提取率的影响　０．２　６５　７０　７５　８０　８５　９０　９５　由图３可得：大　异黄酮的提取率随着超声时　的增加　而增加．存超声时间为２０　ｍｉｎ时，大豆异黄酮的提取率达到　最大值．而后提取率随着超声时间的增加人豆异黄酮的提取　率逐渐降低，其原因可能是长时问的超声导致大　肆黄酮的　结构受到了破坏　由图４可得．随着超声温度的【　升大　异黄酬的提取半　浓度（％）　圈２乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响　南图１可知．料液比小于１：２０时，大豆异黄酮的提取率　随着料液比的提高而增加，当料液比为１：２０时提取率达到　最大值。当料液比大于ｌ：２０时大豆异黄酮的提取率又有所　会有所提高，存超声５０℃的条件Ｆ大豆异黄酮的提取率达　到最大值。而后大豆异黄酮的提取牢随着温度的上升而彳『　所下降　这是因为温度越高对豆渣细胞的破坏作用越大，在　一降低．其原因是溶剂的量增大太多使得其提取率降低。从经　济方面考虑，所以选择料液比１：２０为最佳条件。　由图２可知：随着乙醇浓度的增大，大豆异黄酮的提取　率逐渐增加．而随着乙醇浓度的进一步增加，脂溶性物质也　定温度范围内会利于大豆异黄酮的析…，但　温度超过　５０　０Ｃ时温度对大豆异黄酮的破坏程度太高从而导致其提取　牢的降低。　２．１．５正交试验结果及分析　在同时随着溶解增加，大豆异黄酮提取率也就降低了。　２．１３提取时间对大豆异黄酮提取牢的影响　准确称取干燥的豆渣粉末２．００ｇ，８０％乙醇溶液为浸提　刹浸提１　ｈ后，　料液比１：２０，超声温度为５０　ｏｃ的条件下，改　变超声时问为ｌＯ、１５、２Ｏ、２５、３０　ｍｉｎ分别提取大豆异黄酮，　根据单因素实验，为了进一步确定超　提取大　肆黄酮　的最佳丁艺条件．以超声温度、超　时问、乙醇浓度和料液比　勾考察因素，选用Ｌ１（３　）正交表进行４冈索３水平ＩＦ交文　验．网素水平见表１，正交试验结果见表２、　４２　ＨＯＲＩＺＯＮ　ＯＦ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＡＮＤ　Ｉ＇ＥＣＨＮＯＩ　ＯＧＹ｛科技视野　表１　正交试验因素水平设计表　Ｏ＿３９　Ｏ－３７　０．３５　ｌ　２　ｌ：ｌ５　７５　１５　４０　§ｏ３３　．譬ｏ　３ｌ　ｌ：２５　８５　２５　６０　Ｏ．２９　０・２７　０．２５　３　２　３　４　５　６　７　８　时间（ｍｉｎ）　图５微波时间对大豆异黄酮提取率的影响　｜　■■■＿１＿　｜　ｚ｜　－　－一　●＿　０．３９　０．３７　　■■■ｌ●■■■■■■■■●￡●■■■■■■■■●！●＿Ｏ　３５　■■■■●Ｅ■■＿　＾　｜　■■■■‘■■＿　■■＿：　＿　■■　－　孳　０　３３　蹲　０．３ｌ　０．２９　＿＿＿＿＿＿＿ｔ＿＿＿＿＿＿＿ｔ－＿＿＿Ｉ■■■■■＿　■■■■■一—－．－●Ｌ１■＿　０．２７　Ｏ．２５　２０　３０　４０　５０　６０　７０　８０　＿■　：●■■＿　ｌｅ■■臣１　１■●　ｌ‘＿　ｌｅ■ｒ－１　温度（℃）　图６微波温度对大豆异黄酮提取率的影响　■●●Ｉ●ｊ灌１　＿ｌ■ｔｎ１　■＿●、西　■●＿　ｌｔｌｌ觅，蠡　由衷２可知．影响超声提取豆渣中大豆异黄酮的因素主　次顺序为Ｃ＞Ｄ＞Ｂ＞Ａ，即超声时间影响最大，其次是超声温　度，乙醇浓度和料液比。同时可得超声波提取大豆异黄酮的　最佳＿ｒ艺条件是：Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｉ）２，即料液比为ｌ：２０，乙醇浓度为　８０％，超声时间为２０　ｒａｉｎ，超声温度为５０℃。　２．１．６验证实验　由图５可得：大豆异黄酮的提取率随着微波时间的增加　而增加．在微波时间为５　ｍｉｎ时，大豆异黄酮的提取率达到　最大值。而后提取率随着微波时间的增加大豆异黄酮的提取　率逐渐降低．其原因可能是长时间的微波导致大豆异黄酮的　结构受到了破坏，从而使得提取　的大豆异黄酮的量变小。　由图６可得．随着微波温度的』二升大豆异黄酮的提取率　会有所提高，存微波温度为５０℃的条件下大豆异黄酮的提　取率达到最大值。而后大厦异黄酮的提取率又会随着微波　为＿ｒ进一步考察ｔ　选工艺的稳定性．按２．１．５正交试验　所选取的最佳条件即：乙醇浓度为８０％．超声时间２０　ｍｉｎ，　超卢温度５０屯，料液Ｉ七ｌ：２０，进行ｉ次平行实验，并测得吸　光度，计算　大　异黄酮的提取牢，得大豆异黄酮的平均提　取　为０－３９４２％。　２．２微波辅助提取法　温度的上升而下降。这是冈为微波温度越高对大豆细胞的　破坏作用越大，在一定温度范罔内会利于大豆异黄酮的析　ｍ，但当温度超过５０℃时温度埘大　异黄酮的破坏程度太　高从而导致其提取率的降低。　２．２．３乙醇浓度对大豆异黄酮提取牢的影响　准确称取十燥的豆渣粉末２．００　ｇ，分别用７０％、７５％、　８０％、８５％、９０％的乙醇溶液为浸提剂浸提１　ｈ后，在微波功　率为４００　Ｗ．存微波温度为５０℃．微波时间为２０　ｍｉｎ的条　件下提取大豆异黄酮，提取液冷却后过滤，离心，用移液管小　心吸取上清夜５　ｍＬ放入ｌ０　ｍＬ具察试管中，接着按照标准　曲线测定方法巾实验步骤操作，测定吸光度，计算提取率，结　果如图７所示。　２．２．１微波时问对大　异黄酮提取率的影响　准确称取干燥的　渣粉末２。００　ｇ，用８０％乙醇溶液为浸　提剂浸提ｌｈ后，　微波功率为４００　Ｗ．８０％乙醇溶液４０　ｍＩ　，存微波温度为５０℃的条件下，改变微波时间为３、４、５、　６、７　ｍｉｎ分别提取火娃异黄酮，提取液冷却后过滤，离心，用　移液管小心吸取上清仅５　ｍＬ放人１０　ｍＬ具塞试管中，接着　按照标准曲线测定方法巾实验步骤操作，测定吸光度．计算　提取卒，结果如罔５所永．　．２．２．２微波温度对火　异黄酮提取率的影响　准确称取ｆ燥疆渣粉术２．００　ｇ，以８０％乙醇溶液为浸提　２＿２Ｉ４微波功率对大旺异黄酮提取率的影响　准确称取干燥的豆渣粉未２．００　ｇ，以８０％的乙醇水溶液　为浸提剂浸提１　ｈ后，在微波温度为５０℃，微波时问为２０　ｍｉｎ的条件下，分别在微波功率为２００、３００、４００、５００、６００　Ｗ　的条件下提取大疆异黄酮，提取液冷却后过滤，离心，用移液　管小心吸取上清夜５　ｍＬ放入ｌ０　ｍＬ具塞试管中，接着按照　标准曲线测定方法中实验步骤操作．测定吸光度．计算提取　刹浸提ｌｈ后，微波功牢为４００　Ｗ。在超声时间２０ｍｉｎ的条件　下，改变微波温度分）ｊＩＪ　３０、４０、５０、６０、７０℃提取大豆异黄　酮，提取液冷却后过滤，离心，用移液管小心吸取上清夜　５ｍＬ放入１０ｍＬ具寒试管中，接着按照标准曲线测定方法中　实验步骤操作，测定吸光度，计算提取率，结果如图６所示。　饲料广角・４３　科技视野Ｉ　ＨＯＲＩＺＯＮ　ＯＦ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＡＮＤ　ＴＥＣｔｌＮＯＩ　ＯＧＹ　牢，结果如罔８所示　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　爵群瞰　Ｏ　０　０　Ｏ　５　ｒａｉｎ，微波温度５０℃，微波功率为４００　Ｗ。　表３正交试验因素水平设计表　水平１　Ｉ　∞　∞　约　乙醇渊Ａ％７５　温　４０　＾　功　３００　Ｉ　时　４　■■■■■■■　●　●　●　１　６Ｏ　Ｏ　８０　９０　１Ｏ０　＆度（％）　图７　乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响　０．３９　０．３７　■■■■■■■■■■■■■■■ｌ●■■■■■■■■■ｔ■■■＿　■■■■ｌ●＿●　Ｉ：●■＿　Ｏ．３５　０　３３　啊０．３１　０．２９　●■＿　■■■■■一■…●■＿　０．２７　Ｏ．２５　１００　２００　３０ｏ　４００　５００　６００　了００　功率（ｗ）　ｌｔ；■‘　ｔｌ　■■誓■ｌＩｇ■＿　＿ｌ觅　＿　■＿‘■■　图８微波功率对大豆异黄酮提取率的影响　由图７可知：随着乙醇浓度的增大．大豆异黄酮的提取　极差０．０５５　０．３９６　０．５８５　０．０３４　率逐渐增加。而随着浓度的增加脂溶性的物质溶解率也同　２．２．６验证性实验　为了进一步考察上选工艺的稳定性，按２．２．５正交试验　所选取的最佳条件即：乙醇浓度为８０％，微波时间５　ｍｉｎ．微　波温度５０℃，微波功率为４００　Ｗ，进行＝－ｉ次平行实验，并测　得吸光度．计算出大豆异黄酮的提取率．结果得大豆异黄酮　的平均提取率为０．３７６２％。　３结论　时增加，因此，大豆异黄酮的提取率就降低了。所以乙醇浓　度控制在８０％为宜　．　ｒｆ１图８可知，在实验条件下，微波辐射功率在低于４００　Ｗ　时，大豆异黄酮的提取率随微波辐射功率的增大而提高：但　当微波辐射功率高于４００　Ｗ时，大豆异黄酮的提取效率会　随着微波功率的增大而降低。可能是因微波功率过大使得　震动过于强烈导致大豆异黄酮分子遭到破坏所致。因此选　择适宜的辐射功率为４００　Ｗ　２Ｉ２．５正交试验结果及分析　利用超声辅助提取豆渣中的大豆异黄酮．通过正交试验　得到最佳ｒ艺条件为：料液比为ｌ：２０，乙醇浓度为８０％。超　声时间为２０　ｍｉｎ，超声温度为５０℃．结果得大豆异黄酮的平　均提取率为０＿３９４２％。利用微波辅助提取豆渣中的大豆异黄　酮，通过正交试验得到最佳工艺条件为：乙醇浓度为８０％，　根据单　素实验，为了进一步确定微波提取　渣中大　异黄酮的最佳丁艺条件，以乙醇浓度、超声温度、微波功率和　超　时间为考察因素，选用ｋ（３　）正交表进行４｝夭Ｉ素３水平　交试验，因素水平见下表３，正交试验结果见表４。　微波时间５　ｍｉｎ，微波温度５０℃，微波功率为４００　Ｗ．结果得　大豆异黄酮的平均提取率为０．３７６２％。所以从豆渣中提取大　豆异黄酮的提取工艺中超声辅助提取法优于微波辅助提取　法。■　由表５町得：影响微波提取大豆异黄酮的因素主次顺序　是Ｃ＞Ｂ＞Ａ＞Ｄ，及微波功率影响最大，其次是微波温度和乙醇　浓度，微波时间影响最小。因此，大豆异黄酮微波提取的最　伸ｌ　艺条件是Ａ：Ｂ２ｃ：Ｄ　，即乙醇浓度为８０％，微波时间　参考文献：　…李玉斌，师然伟．新型动物保健因子一大豆异黄酮在蛋鸡和奶牛生产中的应用【Ｊ】．饲料广角，２００８，（１５）：３２—３４　【２】李丹．大豆异黄酮的提取、分离及相关动力学和热力学的基础研究【Ｄ】郑州：郑州大学，２００９　［３】左玉帮．从豆粕中提取大豆异黄酮的研究ＩＤ】天津：天津大学，２００８．　【４　Ｊ李万林金银花中微波辅助提取绿原酸工艺条件研究　江西饲料，２０１３，（０３）：３—６　【５】李万林，钟姣姣正交优化微波辅助提取艾叶中总黄酮工艺条件研究【Ｊ】．广东饲料，２０１４，２３（０１）：２８—３１．