益生枯草芽孢杆菌MA139增殖培养基的优化

中国农业大学学报２００６，１１（３）：　４１－４６Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ益生枯草芽抱杆菌ＭＡ１３９增殖培养基的优化郭小华　　陆文清邓萍黄德仕（中国农业大学农业部饲料工业中心，北京１０００９４）摘要为得到益生芽饱杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９产芽饱的最佳的培养基，ｉ％，（摇瓶发酵的方法，用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计从１１种原料中筛选出４种对芽饱产量有显著影响的因素，即玉米粉、大豆粉、蛋白膝和ＭｎＳＯ４　－　Ｈ２Ｏ，然后针对这４个主要因素，用最陡爬坡试验及中心组合设计优化产芽饱的最佳培养基。结果表明，当培养基的配方为：玉米粉３．１７　ｇ／Ｌ、大豆粉５．８０创Ｌ、蛋白膝３．６２　ｇ／　Ｌ，　ＭｎＳ仇　－１－１２０　１．０６　ｇ／　Ｌ，葡萄糖５　ｇ／Ｌ、尿素３　ｇ／　Ｌ，　ＭｇＳＯ４．７践Ｏ　１．５　ｇ／Ｌ和Ｋ氏Ｐ０４　３　ｇ／　Ｌ时，ＭＡ１３９发酵３６　ｈ细菌总数可以从８．３２　ｘ　１０８　ｃｆｕ／ｍＬ提高到３．１０　ｘ　１０９　ｃｆｕ／ｍＬ，芽抱率达到％％。试验表明通过统计优化培养条件可以有效提高Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９产芽饱的得率。关键词枯草芽抱杆菌；发酵；培养基优化；试验设计中图分类号Ｑ　９３－３３５；　Ｑ　９３９．１２４文章编号１００７－４３３３（２００６）０３－００４１－０６文献标识码ＡＭｅｄｌｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｐｏｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓＭＡ１３９　　　　　　　　　　　　　ａｓ　ａ　ｐｒｏｂｉｏｔｉｃＧｕｏ　Ｘｉａｏｈｕａ，　Ｌｕ　Ｗｅｎｇｉｎｇ，　Ｄｅｎｇ　Ｐｉｎｇ，　Ｈｕａｎｇ　Ｄｅｓｈｉ（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｆｅｅｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９４，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　　Ｕｓｉｎｇ　ｓｈａｋｉｎｇ－ｆｌａｓｋ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｔｈｅ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｐｏｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｉｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ＪＭＰ　５．０．　Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｇｒｅｄｉ－ｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐａｔｈ　ｓｔｅｅｐｅｓｔ　ａｓｃｅｎｔ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｔ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　（ＣＣＤ）．Ｔｈｅ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ　ｃｏｎ－ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ：　ｃｏｒｎ　ｍｅａｌ　３．１７　ｇ／Ｌ，　ｓｏｙｂｅａｎ　ｍｅａｌ　５．８０　ｇ／Ｌ，　ｐｅｐｔｏｎｅ　３．６２　ｇ／Ｌ，　ｇｌｕｃｏｓｅ　５　ｇ／Ｌ，　ｕｒｅａ　３　ｇ／Ｌ，　ＭｇＳ０４・７Ｈ２０　１．５　ｇ／Ｌ　ａｎｄ　ＫＨ２ＰＯ４　３　ｇ／Ｌ．　Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｕｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｆｒｏｍ　８．３２　Ｘ　１０８　ｃｆｕ／ｍＬ　ｔｏ　３．１０　Ｘ　１０９　ｃｆｕ／ｍＬ　ａｆｔｅｒ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｐｏｒｅ　ｒａｔｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　９６％．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｐｏｒｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｃａｎｂｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎｓ抗生素添加剂在动物日粮中广泛使用，但其弊　　　　单因子试验以及结合均匀设计和正交设计的方端和危害日益体现出来川，而抗生素替代品的微生法［９－１０１。目前趋向采用统计软件构建高效试验设计态制剂在畜牧业已得到应用［［２ｌ。微生态制剂常用来进行微生物培养基的优化，通过对试验结果进行的细菌是乳酸菌，而芽抱杆菌作为动物肠道的外源数学模拟和优化，可以简化试验步骤，提高准确菌群，也有广泛应用，它能够改善动物胃肠道的微生性〔１１－１４１。本试验旨在以本试验室分离筛选得到的态平衡，促进动物生长，提高饲料利用率〔３－６］。优良一株枯草芽饱杆菌ＭＡ１３９为出发菌株，优化产芽的微生态制剂必须有足够的活菌数量［［７７。因此，为抱的最适培养基。了尽量提高产品芽饱的数量，需要对其产芽抱的培养基进行系统优化，以降低生产成本，提高芽抱得１材料与方法率［ａｌ０１．１菌株芽抱杆菌液体深层发酵培养基的优化一般采用　　　　枯草芽抱杆菌ＭＡ１３９，　　　　本实验室自行分离和保收稿日期：２００５－１０－２７作者简介：郭小华，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｇｕｏｘｈ）ｍａｆｉｃ．　ａｃ．　ｅｎ；陆文清，副教授，通讯作者，主要从事饲料微生物及酶学研究，Ｅ－　　　　　　　　　　ｍａｉｌ：　ｌｕｗｑ）ｍａｆｉｃ．中国农业大学学报２００６年第１１卷存。该菌株经中科院微生物所鉴定，其１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列在ＧｅｎＢａｎｋ的登录号为ＤＱ４１５８９３。该菌株具有饲用益生菌的应用潜力。效应值的大小确定变化步长，从而快速逼近产量最大值。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计的结果，来确定是否进行最陡爬坡试验。表１　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验设计中各参数的编码值及其质ｔ浓度　　　　　　Ｔａｂｌｅ　１　Ａｓｓｉｇｎｅｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌ　　　　　　　　ｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　　　　　　　　　　　ｇ／Ｌ１．２培养墓１）种子及斜面保存培养基（ＳＣ培养基）。成分　　　　为葡萄糖５　ｇ／Ｌ；蛋白脏５　ｇ／Ｌ；酵母粉１　ｇ／Ｌ；牛肉膏３　ｇ／Ｌ；　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０　０．５　ｇ／Ｌ；　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．　００５　ｇ／Ｌ；　ｐＨ　７．　０。固体培养基则在液体培养基中添加１．８％的琼脂作为凝固剂。２）发酵培养基。分别按照Ｐｌ　　　　ａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计、最陡爬坡试验设计和中心组合设计的方法来配制。１．３试剂和原料玉米、　　　　大豆为市售，粉碎后过２０目筛备用；试验中其他试剂均为分析纯。１．４培养条件１）种子培养条件。２５０　　　　　ｍＬ三角瓶装种子培养基５０　ｍＬ，接斜面活化后的种子一环，３７　ＶＣ，　２２５　ｒ／ｍｉｎ旋转振荡培养２０　ｈａ２）发酵培养条件。２５０　　　　　ｍＬ三角瓶装发酵培养基５０　ｍＬ，按照４％的接种量接种后在３７℃，２２５　ｒ／ｍｉｎ旋转振荡培养３６　ｈｏ１．５细菌总数和芽抱总数的测定平板稀释法计数活菌数。芽抱计数则将稀释液　　　　放入８０℃水浴中处理２０　ｍｉｎ后培养计数。１．６培养墓优化试验设计１）　　　　　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计。以葡萄糖（Ｘｉ）、可溶性淀粉（Ｘ２）、玉米粉（Ｘ３）、大在优化初期利用Ｐｌ　　　　ａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａ。设计法［‘，］，豆粉（Ｘ４）．　（Ｎ践）２ＳＯ４　（　Ｘ５　）、尿素（Ｘ６）、蛋白陈（Ｘ７）、ＭｇＳＯ４・７玩Ｏ（Ｘｇ）、Ｋ玩Ｐ氏（Ｘ９）、ＣａＣ１２（Ｘｊｏ），ＭｎＳ０４＇　Ｈ２０（Ｘ１１）等为试验因子，对这１１种原料进行全面考察，并将其编码为一１和＋１的高低二阶层，其所代表的质量浓度值见表ｔｏ选用ｎ＝１２的Ｐｌ　　　　ａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计，并加上３个中心点来筛选和探讨１１个试验因子对细菌总数和芽抱总数的影响，每一个试验结果报告为２个重复试验的平均值（表２）０　　　　２）最陡爬坡试验设计。响应面拟合方程只有在考察的紧接邻域里才充　　　　分近似真实结果，故只有在最先逼近最大目标产物产量区域后才能建立有效的响应面拟合方程〔’“］。以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素编码水平独立变量一１＋１葡萄糖（Ｘ，）１５可溶性淀粉（Ｘ２）１５玉米粉（Ｘｓ）１１一、）大豆粉（Ｘ４）内、ｎ】Ｕ（Ｎ风）２４（Ｘ５）‘Ｕ尿素（Ｘ６）Ｏ夕蛋白陈（Ｘ７）１｝１、户ＭｇＳＯ４．７Ｈ２０（Ｘ８　）Ｋ场Ｐ０４　（ｘ９）ＣａＣ１２　（ＸｌＯ　）ＭｎＳＯ４氏Ｏ（Ｘ１ｊ）０．０５３）中心组合设计。　　　　根据Ｐｌ　　　　ａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计筛选出的试验因子和最陡爬坡试验确定的逼近浓度，以ＪＭＰ５．　０软件设计中的ＤＯＥ程序进行中心组合试验，拟合数据得到一个描述因变量（细菌总数）与自变量（培养基组分）关系的二阶经验模型［“，１７］ｙ二ｂ　　　　　　ｏ＋Ｚ　ｂｚｘｔ＋Ｚ　ｂ，ｘｉｘ，，＋艺ｉＺ　ｂ　　　ｉＸ　２ｉｉ式中：ｙ为预测响应值，即细菌总数（Ｉｇ　［　Ｎｔｏｔ　（ｃｆｕ／ｍＬ）］；ｂ为回归系数；ｘ‘为自变量的编码水平。用ＪＭＰ５．０软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验和方差分析。２结果与讨论２．１影响芽抱杆菌增殖的重要因素按照Ｐｌ　　　　ａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验设计，在发酵３６　ｈ时取样测定发酵液当中的细菌总数（ｔｏｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒ，Ｎ　ｔｏｔ）和芽抱总数（ｓｐｏｒｅ　ｎｕｍｂｅｒ，　Ｎ．）．　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒ－ｍａｎ试验设计结果见表２并对其进行一阶模式回归分析（表３）。细菌总数和芽抱总数２种结果回归分析的检定系数分别为０．％和０．９４，说明回归分析能够确切的描述试验数据。根据分析结果，发现对第３期郭小华等：益生枯草芽抱杆菌ＭＡ１３９增殖培养基的优化４３表２　　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验设计结果（ｎ＝１２）Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ变量水平响应值编号Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＸｑＸＳＸ，Ｘ７　　　　　　Ｘ８　　　　　Ｘ９　　　　　　Ｘ１０Ｘ１１　　ｌｇ［Ｎｍ，／（ｃｆｕ／ｍＬ）］　ｌｇ［Ｎｓ／（ｃｆｕ／ｍＬ）］１一１ｔ一１１　　　　　　１　　　　　　１一１一１一１　　　　　１一１　　　　　　　　　Ｒ．６９　　　　　　　　　　　　　　　８．４８，‘一１一１－，工－１１１１－，Ｉ门Ｉ，Ｉ　一Ｊ．１．．１１Ｑ八Ｑ｝．　了　Ｊ【　了飞』．　、　二　　　））　　内ＪＣＵ门ｎ“ｎｎＵＣ八　０　　　　　　０Ｕ　ＵＵｎＵＣＵ０　０，只００于．Ｉ｝．户矛４１　　一１一ｊ．１１１１１一Ｊ．１Ｊ．１　一ＪＩ工Ｊ．　一１（８４Ｊ．．１　工　１　－Ｉ　工Ｒ４八｝．“一１　　　　１刁１一．．１，１－曰．　－曰．１　ＪＪ　１　一Ｊ０Ｑ｝．　　Ｉ１－｝　．了．２９成　　ｌ产门．ｊ１．１Ｕ１　　　　　　１１．１，ｔ，１汤１　，　．　．１　Ｒ内　１　，１１ｊ，．　　１　ｌ．０八‘丹．４Ｊ‘，产一１　　　　１一１１一，．１－　，，　．．工　１，　　１－Ｏ　１　几　一　，上工　弓．１　１了Ｚ４．只　　几０户．２‘Ｊ｝１　　　　　　１一曰．．．Ｉ　－１　　　　一．１０ｎ　．工－Ｊ．１一　１１　，－Ｊ．工．　二　，Ｑ０工Ｕ６　１户．产户ｎ，　　　人，一１一１工Ｊｉ　一Ｊ．　ｌ１一Ｊ．－．．上－月．工只２凡只．．、〕．．１ＣＱ　工．．工　ｌ１１，１ｎＵ０　　　　　　０ｎＵｎＵ　ｎ　｝八　曰ＣＵ　ＣＵｎｊｌＵ“ｎ０Ｃ气ｎ）‘…Ｕ口，０ｌ…ｌ），Ｉ　　．１，．几１　　　　　　１盖－Ｉ几　－，．　，１８３ｎＲ２‘　‘－，卫　１一，１－，卫齐－唯１｝｝Ｕ，１今‘１　　一１－，工－１１　一　　１１，曰几－．．工１．工．二，１－１．ｌ０心Ｑ月了．工￣勺１ｌｌ｝曰．．Ｊ．　１凡ｊ一１一１１）．１　－旧－１１－Ｊ．１Ｊｌ１．．　　１一Ｊｌｌｌ工　ｊＱ０‘只０月　．　工　衬…Ｕ…峙　，１４０　　　　　　０００　ｎ　Ｕ００ＣＵ八ｊＩｎ　　Ｕ　　ｎｇ０ＺＱ０，）　　Ｕ　了１　　旧曰　１气１｝１　　一１．１　一．１１　Ｊ．　１１一）．１￣．．１－ｄ．一．工　　　１１　ＪＲ７Ｏ０　ｌ　ｉ　｝｝八７４　　　　　　　　　　　Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９发酵起主要作用有４种原料，即　　　　　　检验，比较中心点水平的平均响应值与试验点处的　　　　　　　　　　玉米粉、大豆粉、蛋白陈和ＭｎＳＯ４　　　＂　ＨＺＱ，并对１１种平均响应值间的差异显著性。试验结果显示，中心　　　　　　　　　原料成分归纳调整，作为下一步试验分析的依据。点水平与试验点间在ａ　　　　　　　　　＝０．０５水平上不显著（Ｐ值　　质量浓度调整说明见表４０分别是０．４６０和０．　　　　　　　　３８８），这就表明本试验设计中选　２．２最陡爬坡试验取的中心点水平还没有接近最大的响应区域内，因　　　　　　　　　选取对Ｂ．　　　　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９发酵４种主要原料。此还必须进一步寻找中心点值，也就是最陡爬坡　　　　　　　　　　　对Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验设计中得到的结果进行ｔ试验。　　　　　　　　　　　　　　　表３　　　　　　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验设计回归分析结果　　　　　　　　　Ｔａｂｌｅ　３　　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒ　　　　　　ｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎｃｆｕ／　Ｉ＿　　　　细菌总数Ｎｉｔ　　　　　　　芽抱总数Ｎｓ截距参数　　　　　参数估计　　ｔ参数估计　　　　　　　　　ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ８．８７６　　２０３　　　　　　　　．０４４０．０００　　　　８．８３１　　１６３．２９４０．０００　　　Ｘｔ　　一０．１４７一３　　　　　　　　　　．００１０．０５８＊一０．１２９　　　　　一２．１３６０．１２２　　　　Ｘ２　　０．００３　　　　　　　　　　　　　　０．０６８０．９５０一０．００９　　　　一０．１５２０．８８９　　　　Ｘ３　　一０．１５２　　　　　　　　　　一３．１０３０．０５３＊一０．１６３　　　　一２．６８８０．０７５．　　　　Ｘ４　　一０．１９０一３　　　　　　　　　　．８８８０．０３０＊＊一０．２２１　　　一３．６５２０．０３５＊＊ＸＳ　　一０．００５一０　　　　　　　　　　．１０２０．９２５一０．０２１一０．３４５０．７５３Ｘ６　　一０．０８２　　　　　　　　　　一１．６７１０．１９３一０．０９９一１．６４００．２００Ｘ，　　一０．１７３一３　　　　　　　　　　．５４７０．　０３８＊＊一０．１５９一２．６３３０．０７８＊Ｘ８　　０．０８８　　　　　　　　　　　　　　１．８０７０．１６８０．１０８　　１．７７８　　０．１７３Ｘ９　　０．０９７　　　　　　　　　　　　　　１．９７８０．１４２０．１０６　　１．７５０　　０．１７８Ｘｌ　　ｏ一０．００５　　　　　　　　　　一０．１０２０．９２５一０．０３４一０．５６５０．６１２Ｘ󰀀　　０．１５７　　３　　　　　　　　　　　　．２０５０．０４９＊＊０．１５８　　２．６０５　　０．０８０＊Ｐ＝０．０８２，ＲＳ，＝０．９６Ｐ二０．１２５，　Ｒ氏＝０．９４注：，为Ｐ＜０．１，。为Ｐ＜０．０５０４４中国农业大学学报２００６年第１１卷表４　　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａ试验设计各因子结果的质量浓度分析Ｔａｂｌｅ　４　　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ　ｕｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ试验因子质量浓度／（ｇ／Ｌ）调整前调整后说明葡萄糖（Ｘ，）可溶性淀粉（Ｘ２）玉米粉（Ｘ３）大豆粉（Ｘａ　）（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＸＳ）５一１５对细菌总数和芽饱总数为负相关，对细菌总数影响达到显著水平，而对芽抱总数的影响不显著，为了减少试验因子，维持在低水平删除１一５１一１０５一１５　　　　５一１５　　１０一３０　　２一６　　　　３一９　　　　５一１５　　０．５一１．５１一３　　　　２一６　　　　０．０５一０．５无显著影响，可信度大于２０％　［ｉｓ＇，删除此因子负显著，降低筛选浓度负极显著，降低筛选浓度无显著影响，可信度大于２０％，删除此因子不显著，负相关，可信度小于２０％，为减少试验因子，维持在低水平负显著，降低筛选浓度删除３　　１一５１．５　　尿素（Ｘ６）蛋白陈（Ｘ７）ＭｇＳＯ４　．　７姚Ｏ（Ｘ８）ＫＨＺＰＯ４（Ｘｇ）ＣａＣｌ２（ＸＩＯ）ＭｎＳＯ，　＂　Ｈ２０（Ｘ　ｌ　１）不显著，可信度小于２０％，为减少试验因子，维持在高水平３　　　　　　不显著，正相关，尸值相对较小，维持在高水平删除　　不显著，可信度大于２０％，删除此因子０．５一１。５显著，正相关，提高筛选浓度以回归系数最大的大豆粉（Ｘ４）为基准，以每次　　　　减少浓度１％为基本步长（△）。处理５中的细菌总数和芽饱总数达到了最高，这一结果表明，处理５的中心点进行优化，选择中心试验点为３，星号臂长ｙ＝１．５４７。各自变量水平见表６，试验设计及结果见表７０玉米粉（Ｘ３）、大豆粉（Ｘ４）、蛋白陈（Ｘ７），　ＭｎＳＯ４践０（Ｘ１１）这４种物质浓度已在最优点附近，可以此浓度为中心点采用中心组合设计来对培养基作进一步的优化（表５）。而且在Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计及最陡爬坡试验中，细菌总数与芽抱总数的分析结果一致，故在以下的中心组合设计仅以发酵液的细菌总数作为考察目标。分析结果表明（表８），模型极显著（Ｐ＜０．　　　　０１），并且有很好的确定系数，Ｒ民＝　０．９３。这表明Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９细菌总数９３％的可靠性可由模型来预测。并可以通过回归分析结果得出试验模型：Ｙ＝　　　　　９．４３４一０．００３Ｘ３一０．０２５Ｘ４＋０．０２８Ｘ７一０．０１３Ｘ１１一０．００６　Ｘ３　Ｘ４一０．０２Ｘ３　Ｘ７一０．００９Ｘ４Ｘ７一０．０１２　Ｘ３Ｘ１１一０．０２６　Ｘ４Ｘ１１一０．０３　Ｘ７Ｘ１１一０．０６８　Ｘ３Ｘ３一０．０１３　Ｘ４Ｘ４一０．０４３　Ｘ７Ｘ７一０．０２５Ｘ１１Ｘｕ２．３中心组合设计　　　　以最陡爬坡试验中处理５的玉米粉（Ｘ３）、大豆粉（Ｘ４）、蛋白陈（Ｘ７），ＭｎＳＯ４＂Ｈｚ０（Ｘ１１）的浓度为自变量前的数值为回归模型对应项的Ｐ值。　　　　表５最陡爬坡试验设计及其结果Ｔａｂｌｅ　５　　Ｐａｔｈ　ｓｔｅｅｐｅｓｔ　ａｓｃｅｎｔ培养基成分／／（ｇ／Ｌ）处理序号玉米粉结ＭｎＳＯ４．线Ｏ果大豆粉（Ｘ４）蛋白陈（Ｘ，）（Ｘ３）（Ｘ󰀀）　　ｎＵＣＵ０…１ｇ［　Ｎｔｏｔ／　（ｃｆｕ／ｍＬ）］１ｇ［　Ｎｓ／　（ｃｆｕ／ｍＬ）］１　　　　　　　　　　　　　５．００　　　　　　　　　　　　　１０．００　　　　　　　　　　　　　５．００　，乙内Ｊ４ｌｌ）６７８ｎ，０．５０　　　　　　　　　　　　　　　９．３３　　　　　　　　　　　　　　　　　９．２８．　　　　　　‘、勺ｑ】）乙４ｎＲ．．　　　　　　０八ｎ户曰Ｕ８八八曰Ｕ．．　　　　　　４－、，）｝４０Ｒ｝．．　　　　　　／Ｏ１１７，ｎ，ｎ，Ｑ｝ｎ，ｇＣ，９９．　　　　　　内，Ｊ少ＪＩ八ｊ内、４）４３９门、）ｎ，ｎ，Ｑ｝ｎ，９０了ｎ，Ｒ３ｎ．　　　　　　．ＵＵ）．｝．曰２．１２９凡０６４…７ｎｎＵ…门４Ｊ‘Ｕ…８内飞〕……３２０２７６伟勺内、‘〕‘…６八０曰１ｎ１八“Ｕ〕‘０ｑｎＵ…内、２０）２７６２凡、气）‘…０）．１‘．１‘１１吸１ｎ月，峙０￣、口４０内、４）……嘴厂１０２，矛…１Ｃ１Ｕ７）．工ｎｌＵｌＪｌ．１￣０气了），８０八１通４‘１斗１内Ｏｎ、Ｕ〕２八ＯＵ曰Ｒ８１１１４４１内ｊ８Ｃ‘ＵＵ１０　　　　　　　　　　　　　１．００　　　　　　　　　　　　　　１．００　　　　　　　　　　　　　１．００　１．５０　　　　　　　　　　　　　　　８．９１　　　　　　　　　　　　　　　　　８．８４第３期郭小华等：益生枯草芽抱杆菌ＭＡ１３９增殖培养基的优化４５表６中心组合设计各因子及其编码值　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔａｂｌｅ　６　　Ａｓｓｉｇｎｅｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎｇ／　Ｌ编码水平独立变量一１．５４７一１１．５４７玉米粉（Ｘ３），１了２．勺ｎＺｎ：　０、』　　｝Ｕ３．Ｕ　）４．２０４．，』少、曰　　大豆粉（Ｘ４）月峪４气５．八Ｕ０６．ｎＵＣｌ７．￣、『｝７．００｝、）蛋白陈（Ｘ７）乙Ｕ』、〕２．今０｝３．２０４．２０４．７５ＭｎＳＯ４　＂　Ｈ，Ｏ（Ｘ　ｉ　１）０．ｌｌ￣口、户０．｝６Ｃ，０．９４１．１９１．３２　　　　根据ｉｍｐ模型的分析结果以及二次回归方程对照，并对培养条件进行优化，结果表明，优化后的可以得出，此模型具有最大响应值，极值分析结果见培养基提高了各阶段细菌总数的数量，在３６　ｈ时，表９。根据结果换算成４个主因素的实际浓度值，优化后培养基可以使细菌总数从８．３２　ｘ　１０８　ｃｆｕ／ｍＬ即玉米粉３．１７　ｇ／Ｌ，大豆粉５．８０　ｇ／Ｌ，蛋白陈３．６２提高到３．１０　ｘ　１０９　ｃｆｕ／ｍＬ，并且在３６　ｈ时，芽抱率ｇ／Ｌ，　ＭｎＳＯ４　＂　Ｈ２Ｏ　１．０６　ｇ／Ｌ。采用优化出的培养可以达到９６％．基，芽抱杆菌最终细菌浓度预测值为２．８４　ｘ　１０９　ｃｆｕ／ｍＬｏ３结论　　　　为了检验模型预测的准确性，采用优化的培养　　　　通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计、最陡爬坡试验及中基重复试验３次，发酵液当中平均细菌数为２．９１　ｘ心组合设计的方法确定了Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９发酵１０９　ｃｆｕ／ｍＬ，这表明实验值和实际值之间具有良好培养的最适培养基。优化后Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＡ１３９的的拟合性，优化模型可靠。细菌浓度为３．１０　ｘ　１０９　ｃｆｕ／ｍＬ，芽ｉｔ率达到％％，２．４优化结果验证从而有效的提高了单位产芽抱的数量。采用优化后的培养基与起始的种子培养基进行　　　　表７中心组合设计及其结果Ｔａｂｌｅ　７Ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ编变量水平编　　　　　　　　　　　　号Ｘ３　　　　　　Ｘ，　　　　　　Ｘ，　　　　　Ｘｉ１ｌｇ［Ｎｓ／（ｃｆｕ／Ｌ）　］号—变量水平Ｘ３　　　　　　　　　Ｘ，　　　　　　　Ｘ，　　　　　Ｘ１，ｌｇ［ＮＳ／（ｃｆｕ／Ｌ）］一１】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　｝，、一１　　　　　　　１　　　　　　　　１一，９．３９，｝一１一１一１９．３乙Ｕ．１６一１１　　一１１１９．２月２八ｊ１．　　５４７０　　０　　９．今‘Ｑｎ１１了一１一１一　，Ｉ９．２月ｑ　Ｊｑ一１５４７０　　０　　９．２，刃１１ＯＯ１　　一１　一　Ｊ．工９．八、Ｊ．）工　ｌｌ￣０　　１．５４７　　９．八ｊ污峙‘１０　　一１．５４７　１Ｃ，　ｎＵ９．丹ｊＣ　｝‘Ｕ一１１　　１　　９．Ｚ八、２００　　一１．５４７　　　０Ｃ）Ｕ９．４‘Ｕ７１　　一１９．内、Ｏ，‘１１一１一１一１，）工９．２Ｃ，ＱＯ一１一１一１一１９．２Ｃｌ伪‘２ｎＵ０　　　　　　　　　１．５４７ｎＩｔ９．内ｊ『了Ｃ，０　　０　　９４Ｚ２内ｊｎＵ０　　　　　　　　　０ＣＵ９．４４，　１　ｎ　Ｕ０　　０　　９．４八Ｏ２４一１１　　一１一１９．，‘ＣＵ　　　曰．　１‘１　１一１１　　９．２Ｃ，２尸Ｊ１．５４７　　　　　０　　　　　　　　　　９．内Ｊ４　　　‘．　１２　１　　１　　９．２ｎＵ２了０ｎＵ０　　　　　　　　　０一１．５４７　　　　９．４｝１　　　．．　１内　、一１一１１　　９．３４２７曰．１一１　　　　　　　１一１　　　　　　　　　　　　９．飞６）　￣　　曰．　１４　１　　一１１　　９．２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４６中国农业大学学报２００６年第１１卷表８中心组合设计（ＣＣＤ）回归分析结果ａＴｂｌｅ８ＲｅｇｒｅｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｃｅｎｔａｒｌｃｍｏＰ０ｓｌｔｅｄｅｓｉｇｎ回归系数参数估计标准差回归系数参数估计标准差ＩｎｔｅｒｃｅＰｔ９．４３４０．０１５３６Ｏｎ８１００．０ｎＵｎＩｎｔｅｒｃｅＰｔ９．４３４０．０１５３６Ｒ）８１００．０００Ｘ３　　－　ｎ．００３０．００７３９１０．７八Ｕ，Ｘ３Ｘｌｌｎ‘Ｕｎ，２｝１０．００７－，１３６￣、　｝一ＣＵ－　　）０．１２８Ｘ；　　－ｎＵ．０２５０．００７一凡」８６００．０八Ｕ勺Ｘ４Ｘｌｌ一０‘０２６０．００７－心０４９１１０．００４Ｘ７　　０．０２８０．００７４．ＺＲ２０．八“ｎＵ，工一ｎ）Ｘ７ＸｌｌＵ０３００．００７－４６０１了０．００２Ｘｌ　　ｌ一０．０１３０．００７－，工Ｑ６１０．０，了ＪｑＸ３Ｘ３　　－ｎ０｝６Ｒ衬．１）０．００９一【了７６，‘０．ｎｎＵｎＵＸ３Ｘ４　　一０．００６０．００７－ｎ０八ｌｆ１０．４八Ｕ］（Ｘ４Ｘ４　　－ｎ０Ｊ】１｝．１凡ｊ０．ｎ００一１１５２勺‘０．Ｊ了．工ｌｌ４以Ｘ３Ｘ７　　一０．０２００．００７一Ｚ６，１气Ｏ．１，‘内Ｘ７Ｘ，　　一ｏ０４内ＪｌＵ００｝，￣０．了－月峪８９，工Ｏ．ｎ目ｎＵＣＵＸ４Ｘ，　　一０．００９０．００７一工．－１１２ｌ、Ｊ０．ｎＵｎ０川１２５７０．２３３ＸｌｌＸｌｌｎＵＵ‘一，山０８、）Ｏ．０ｊ．１了０Ｐ＜０．０００１，Ｒ氏＝０．９３，Ｒ匆ｕａｒｅＡｄｊ＝０．８５表，响应面极值分析ＴａｂｌｅｇＣｒｉｔｉｃａｌｖａｌｕｅｏｎｔｈｅｒｅＳＰ０ｎｓｅｓｕ讨ａｃｅ临界值—估计值细菌总数ＮＪＸ３　　　　　　Ｘ４Ｘｌｉ（　　ｃｆ／ｕｍＬ）稳定点模型Ｘ７一０．０３　　　　　　一１．２０．４２０．１２９．４５４２．８４ｘ１０９最大值󰀀一目一粇目一󰀀－－目󰀀．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．参考文献２９　　　　　　ｒ【０１〕李野，张小平，张克强，等。蜡质芽抱杆菌ＤＬＳＬ一２发．，，Ｌ１．．ＪＧｕｓｔａｆｓｏｎＲＨ，ＢＯｗｅｎＲＥ．Ａｎｔｉｂｉｔｏｉｃｕｓｅｉｎａｎｉｍａｌａ－ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＪＡｐｐ１Ｍｉｃｏｒｂｉｌｏ，１９９７，８３（５）：５３１一５４１酵条件探讨及培养基优化【　　　　　　］Ｊ．微生物学通报，２００５Ｆ．２，．Ｌ．ＪＦｕｌｌｅｒＲ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｓｃｉｎｍａｎａｎｄａｎｉｍａｓｌ［Ｊ］．ＪＡＰｐｌＢａｃ－（２）：４５一４９　　　　　　ｔｅｒｉｌｏ，１９８９，６６（５）：３６５一３７８［１１〕肠ｉｊｋａａｓＬｐ，ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＥｃ，ＴｒａｍｐｅｒＪ，ｅｔａｌ．Ｍｅｄｉ－ｌ．．门，ＡｄａｍｉＡ，ＣａｖａｚｚｎｏｉＶ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌ　　　　　　ｕｍ叩ｔｉｍ讼ａｔｉｎｏｆｒｏｓｐｏｒｅｐｒ司ｕｃｔｉｏｎｏｆＣｂｎｉｔｏｈ岁ｉｕｍＬ」．．ＪｇｒｕｏｐｓｉｎｔｈｅｆａｅｃｓｅｏｆｐｉｇｌｅｔｓｆｅｄｗｉｔｈＢａｃｉｌｌｕｓｃ０ａｇｕｌａｎｓｍｉ　　　　　　ｎｉｔａｎｓｕｓｉｎｇｓｔａｔｉｔｓｉｃａｌｌ梦ｂａｓｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌａｄｅｓｉｇｎｓｓａｐｒｏｂｉｏｔｉｃ［Ｊ］．ＪＢａｓｉＣＭｉｃｒｏｂｉｌｏ，１９９９，３９：３一９　　　　　　［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｅｏ馆，１９９９，６４（１）：９２一１００［４］川ｅｘｏｐｏｕｌｓｏＣ，ＧｅｏｒｇｏｕｌａｋｉｓＩＥ，ＴｚｉａｖｒａＡ，ｅｔａｌ．Ｆｉｅｌｄ〔１２］褚以文．微生物培养基优化方法及其ＯＰＴＩ优化软件ｅａｖ１ｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｉａｃｃｙｏｆａｐｒｏｂｉｔｏｉｃｃｎｏｔａｉｎｉｎｇＢａｃｉ１ｌｕｓ【　　　　　　］Ｊ．国外医药：抗生素分册，１９９（９２）：５８一６ｌｉｃｈｅｎｉｏｆｍｒｉｓａｎｄＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓＰ０ｒｅｓ，ｏｎｔｈｅｈｅａｌｔｈ仁１３］欧宏宇，贾士儒．ＳＡＳ软件在微生物培养条件优化中ｓｔａｔｕｓａｎｄｐｅｏｆｒｒｍａｎｃｅｏｆｓｗｏｓａｎｄｔｈｅｉｒｌｉｔｔｅｓｒ［Ｊ］．Ｊ的应用【　　　　　　］Ｊ．天津轻工业学院学报，２００１（１）：１４一１７Ａ」１１ｍＰｈ外ｉｏｌＡｌｌｉｍＮｕｔｒ，２００４，８８：３８１一３９２【４１］胡永红，沈树宝，欧阳平凯响应面分析法用于微生［５］ＫｒｉｔａｓＳＫ，ＭｏｒｉｒｏｓｎＲＢ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓａｓａ物培养基浓度的优化【　　　　　　Ｊ〕．工业微生物，２００２（１）：９－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｆｒｏａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｉｎａｌａ馆ｅｐｉｇｎｕｒｅｓｒｙ［Ｊ］．Ｖｅｔ１２　　　　　　　　Ｒｅｃ，２００５，１５６：４４７一４８［１５］ＸｕＣＰ，ＫｉｍＳＷ，Ｈｗａ眼ＨＪ，ｅｔａｌ．ＡＰｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ［６］ＺａｎｉＪＬ，ｄａＣｒｚｕＦＷ，ｄｏｓｓａｎｔｓｏＡＦ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｆｃｔｏｆｓ　　　　　　ｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｂａｓｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉ，ｓｆｒｏｔｈｅｏｐｔｉｍｉａｚ－ＰｒｏｂｉｏｔｉｃＣｅｎＢｉｏｔｏｎｔｅｈｃｎｏｔｏｒｌｏｆｄｉａｒｒｈｏａｅａｎｄｆｅｅｄｅｆ－ｔ　　　　　　ｉｎｏｏｆｅｘ－ｏｐｏｌ邓ａｃｃｈａｒｉｄｅＰｒ记ｕｃｔｉｏｎｂｙ肠护诬加沦户ｓｍ艺１艺－ｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｐｉ邵［Ｊｌ，ＪＡｐｐｌＭｉｃｂｏｒｉｌｏ，１９９５，５４：６５一７１ａｔ　　　　　　ｉｒｓＮＧ３［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ＡＰｐｌＢｉｃｏｈｅｍ，２００２，３６：，．．７门ｏｔｉｃｓ［Ｊｌ．５０。ＡｐｐＩＢａｃｔｅｒｉｏ１Ｓ卿ｐｓｅｒ，１２７一１３１　　　　　　　　．ＬＪＦｕｌｌｅｒＲ．Ｐｒｏｂｉ１９８６，１５：１５一７５［１６］ＭｏｎｔｇｏｍｅｙｒＤＣ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄａｎａｌｉｓｙｓｏｆｅｐｘｅｒｉｍｅｎｔｓｒ，．０（３ｎｄ）仁　　　　　　Ｍ］．Ｎｅｗｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１Ｌ０．Ｊ何明清．动物微生态进展【Ｍ〕．北京：中国农业大学出版社，２０００［１７］ＭａｏｎｈａｒＢ，口ｖａｋａｒｓ．ＡＰｐｌｉｃａｔｎｏｌｓｏｆｓｕｆｒａｃｅｐｌｔｏｓａｎｄＦ，　　　　　　ｓｔａｔｉｓｔｉａｃｌｄｅｓｉｇｎｓｔｏｓｅｌｅｃｔｅｄｌｉｐａｓｅｃａｔａ１ｙｓｅｄｅｓｔｅｉｒｆｉｃａ－．０ｅＬ户￣吴最昊，范伟平．Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｏｆｒｍｉｓＮＧ５２１一１发酵培养基优化的研究【Ｊ〕．南京工业大学学报，２００５（２）：２５－ｔ　　　　　　ｉｎｏｒｅａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｓｅｓＢｉｃｏｈｅｍ，２００４，３９：８４７－８５３