小麦籽粒麦谷蛋白大聚合体(gmp)粒度分布特征及其形成机理

（一）立项依据与研究内容 1、项目的立项依据

报告正文

小麦是我国主要的粮食作物。随着社会经济发展和人们生活水平的提高，优质面粉的需求量迅速增大，小麦生产目标也由单纯的量的需求转向量质并重。目前，我国部分优质小麦品种已在生产上大面积推广应用，但由于小麦品质形成机理与改良途径的研究明显滞后，与已有优质小麦品种配套的调优栽培技术的研发受到显著影响，同时也阻滞了优质小麦新品种的选育与优质小麦生产的发展。

蛋白质和淀粉是小麦籽粒最主要的组分，分别占籽粒重的9－18%和65－70%（Morrell等，1995），二者的含量和组成决定了小麦籽粒的品质和最终加工用途。因此，有关蛋白质和淀粉及其组分形成机理的研究一直是小麦品质生理生态领域的研究热点与核心，尤以蛋白质及其组分的研究更受重视。

麦谷蛋白在小麦加工品质中起着主导作用。Osborne（1924）最早根据蛋白质在不同溶剂中的溶解能力，将小麦籽粒蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麦谷蛋白等组分。麦谷蛋白和醇溶蛋白是小麦籽粒主要的储藏蛋白，各占胚乳总蛋白的40%以上，二者在淀粉粒周围形成连续的网络结构，构成了面筋蛋白的主体（Goesaert等，2005），是决定面团粘弹性最关键的组分。醇溶蛋白为单体蛋白，基本不含半胱氨酸残基（ω-醇溶蛋白）或仅有链内二硫键；麦谷蛋白亚基含有二硫键，能相互链接成稳定的聚合体（Tamas等，2002）。面团醒发过程中，麦谷蛋白聚合体通过连续网络结构的形式，提供了面团的筋力和粘弹性（Ewart，1972；Cornec等，1994；Khatkar等，1995；Belton，1999），是决定面筋在面团烘焙中功能性作用的最主要因素。如Shellenberger（1939）发现，小麦加工品质在储藏4年后烘焙品质达到最佳，认为这主要与储藏过程中醇溶蛋白提取率降低、麦谷蛋白提取率增加并进一步交联聚合有关。

麦谷蛋白大聚合体（GMP）的含量与粒度分布是决定面团品质最重要的因素。麦谷蛋白的分子量从8万至几百万Dalton不等，是自然界中最大的蛋白质（Wrigley，1996），由于实际分子很大，且大部分只溶于稀酸，而稀酸会破坏其一级结构，导致聚合体降解。因此，其实际分子量大小至今无法测出（Goesaert等，2005），只有部分研究采用激光粒度仪的方法，测出普通小麦籽粒麦谷蛋白聚合体的最大粒径约为150－180μm，平均粒径20－50μm左右（Spiertz等，2006）。

麦谷蛋白在面团加工品质中有着至关重要的作用，但根据聚合体理论（polymer theories），只有达到一定大小的麦谷蛋白聚合体（即大聚合体，glutenin macropolymers，GMP）才在面筋蛋白网络结构建成中发挥作用（MacRitchie，1992；Singh和MacRitchie，2001；Veraverbeke和Delcour，2002），而这种作用的大小取决于：（1）麦谷蛋白的组成；（2）麦谷蛋白聚合体的粒度分布或结构。以后者的形式决定着面团的烘焙性状（Goesaert等，2005），因为前者指高分子量麦谷亚基（HMW-GS）和低分子量麦谷亚基（LMW-GS）的种类与比例，其作用结果是影响了麦谷蛋白聚合体的结构或粒度分布（具体机理分析见下）。

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由此可见，GMP在决定小麦加工品质中起着重要作用，而其粒度分布或结构则是重要的表征。如能明确小麦籽粒GMP粒度分布特征、形成机理与调控机制，不仅可深入阐明小麦籽粒品质形成机理，还可为优质小麦新品种的选育与配套栽培技术提供理论与技术支持。但限于技术等因素，目前相关研究主要集中在食品加工领域中GMP粒度分布在面团烘焙中的作用与机理研究（Goesaert等，2005；DuPonta等，2007），有关小麦籽粒GMP粒度分布特征的报道很少，小麦籽粒GMP粒度形成动态的研究尚无人报道。随着现代色谱技术和基于激光衍射或散射理论的粒度分析技术的日臻成熟，深入开展小麦籽粒GMP粒度分布形成机理研究已成为可能（Spiertz等，2006；DuPonta等，2007）。我们最近采用先进的激光粒度分析仪，发现两个弱筋小麦品种在不同施氮水平下GMP粒度分布发生了显著差异，特别是随着大粒度GMP比例升高，小麦面团形成时间、稳定时间显著升高，弱化度下降（表1）。 Volume Frequency vs. DiameterYangmai 9 N300Ningmai 9 N0Yangmai 9 N03Volume Frequency Percent (%)Ningmai 9 N3002.521.510.500.40.71.01.52.23.35.07.511.216.725.037.456.083.8125.3187.5Particle Diameter (µm)图1 不同施氮水平对扬麦9号和宁麦9号籽粒GMP粒度分布的影响 表1 不同施氮水平对弱筋小麦品种扬麦9号和宁麦9号部分品质性状的影响 处理 吸水率 （%） 形成时间 （min）稳定时间 （min）弱化度 评价值 N0 51.5 1.3 2.0 95 33 扬麦9号 N300 52.3 1.7 3.3 70 42 N0 53.3 1.3 2.5 115 34 宁麦9号 N300 56.5 2.5 5.3 80 42 品种 HMW-GS是决定GMP含量与粒度分布最关键的组分。麦谷蛋白是由HMW-和

LMW-GS组成的，而GMP的积累与粒度分布与HMW-GS的组成和积累关系更为密切。其主要机理如下：

（1）HMW-GS是构成麦谷蛋白聚合体骨架的核心组分。根据Graveland等（1985）最早提出的分支结构模型，麦谷蛋白聚合体由高比例的HMW-GS、一定比例的B区和C区LMW-GS、以及二硫键组成；x型和y型HMW-GS的头尾由二硫键相接成聚合体的骨架，LMW-GS则在y型HMW-GS的4个可能位点形成分支终点。该模型已得到大量

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的生化和显微研究结果证实（Lindsay和Skerritt，1999）。Vasil和Anderson（1997）在此基础上提出麦谷蛋白聚合体的3种结构模式：一是由多个HMW-GS分子连接成长链，LMW-GS再与长链相接，形成更长的链或分支（图2-A）；二是由HMW-GS分子构成的短链，接一个末端醇溶蛋白形成较小的麦谷蛋白聚合体（图2-B）；三是全部由LMW-GS分子构成的麦谷蛋白短链（图2-C）。显然，只有第一种模式才能形成较大的麦谷蛋白（GMP）。Lindsay和Skerritt（1999）又根据GMP骨架和分支的麦谷蛋白亚基组成，将图2-A中的GMP模型又分成两大类四种分子结构：一是骨架由HMW-和LMW-GS共同构成的，分支为HMW-和LMW-GS（图3-A1）或仅为LMW-GS（图3-A2）；二是骨架仅由HMW-GS组成，分支为HMW-和LMW-GS（图3-A3）或仅为LMW-GS（图3-A4）。这充分表明HMW-GS是决定GMP粒度分布最关键的组分。

A

B HMW－GS

LMW－GS 链终止醇溶蛋白?C

图2 小麦籽粒麦谷蛋白聚合体结构模式图

A1

A2

HMW-GS

链延长LMW-GS 链终止LMW-GSA3

A4

图3 小麦籽粒GMP结构模式图（根据Lindsay等（1999）重新绘制） （2）麦谷蛋白各亚基间需通过半胱氨酸残基相互链接，HMW-GS含更多的半胱氨酸残基，可形成更大粒度的GMP。该结论已得到充分的试验证据支持，如Lindsay等（2000）选用3种模式亚基蛋白（含1个或多个半胱氨酸残基的类麦谷蛋白亚基、不含半胱氨酸残基的ω-醇溶蛋白），用异硫脲荧光素（FITG）标记后混至面粉中，并采用共聚焦激光扫描显微镜（confocal scanning laser microscopy，CSLM）和粒阻高效液相色谱

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（SE-HPLC）技术，研究了掺入不同亚基后面团麦谷蛋白聚合体的粒度分布及面团混合特性。结果表明，掺入含多个半胱氨酸残基的类麦谷蛋白亚基后，可形成更多的链间二硫键，面团GMP数量增加、粒度明显增大，面团混合特性明显增强；掺入只含1个半胱氨酸残基的类麦谷蛋白亚基后，则形成如图1-B的短链谷蛋白小聚合体，即起到终止链延长的作用；掺入ω-醇溶蛋白后，未形成聚合体，仅起到填充单体蛋白空间的作用。

Tamas等（2002）用大肠杆菌表达体系（E. coli），将大麦种子贮藏蛋白的编码基因克隆进行表达，经纯化后得到半胱氨酸残基含量、位置和中间重复区域均不相同的麦谷蛋白类似物（analogue glutenin proteins，ANGs）。通过向面粉添加不同的ANGs，发现无论C或N端含半胱氨酸时，面团GMP比例明显提高，面团抗阻断与延展性、面包烘焙性状明显提高。上述研究结果不仅为Vasil和Anderson（1997）提出的麦谷蛋白结构模型提供了最直接的证据，还进一步证实，麦谷蛋白亚基（HMW-和LMW-GS）半胱氨酸残基的数目，是影响GMP形成数量和粒度大小的重要因素。

HMW-GS含较多的半胱氨酸残基，仅部分LMW-GS含半胱氨酸残基。根据编码HMW-GS和LMW-GS的全长或部分基因测序结果，推测出二者的一级结构，发现：HMW-GS由非重复的N末端、C末端和高度重复的中间区域组成（Vasil和Anderson，1997；Lindsay和Skerritt，1999），较大的x型HMW-GS在N末端有3个半胱氨酸残基，较小的y型HMW-GS有5个半胱氨酸残基；所有的HMW-GS在C末端有1个半胱氨酸残基；部分HMW-GS在中间重复区还含有半胱氨酸残基（Lindsay等Skerritt，1999）。而LMW-GS与醇溶蛋白编码基因序列具同源性，B区（根据在SDS-PAGE图谱上的位置，LMW-GS可分为B、C、D三个区。）LMW-GS两端可含半胱氨酸残基，可能是链延长亚基；C区部分LMW-GS只含一个半胱氨酸残基，可能是链终止亚基。D区亚基的编码基因来自ω-醇溶蛋白编码基因的突变，不含半胱氨酸残基。

（3）直接研究证据表明，HMW-GS表达的数目是影响GMP粒度大小的重要因素。Don等（2006）采用一套缺失体群体，结合FITC标记和CSLM技术，研究了不同HMW-GS缺失与麦谷蛋白聚合体形成的关系。这套群体各家系遗传背景相同（Olympic×Gabo），但所选8个家系HMW-GS组合不同（未缺失体家系含1、17＋18和5＋10全部亚基，分别缺失上述1个（对）亚基的单缺失体家系3个，分别缺失上述2个（对）亚基的双缺失体家系3个，全缺失体家系1个）。结果表明，GMP粒度分布与HMW-GS表达数目直接相关：当全部HMW-GS缺失、仅含LMW-GS时，只形成微量不溶性麦谷蛋白，且无颗粒状GMP；当仅有1亚基时，可观察到部分粒径的GMP；两组以上的亚基（对）出现时，GMP颗粒清晰可见。更重要的是，各家系LMW-GS组成相同，而LMW-GS占GMP的相对比例取决于HMW-GS表达的数目。GMP的湿重与麦谷蛋白聚合体中HMW-GS密度呈正相关，面团最适混合时间和面包烘焙体积与麦谷蛋白聚合体粒径大小呈极显著正相关。

（4）GMP的积累还显著受HMW-GS表达量的影响。根据上面的研究结果，HMW-GS缺失表达时，还同时显著降低了HMW-GS的表达量，这也是GMP含量下降和平均粒度降低的重要原因（Don等，2006）。我们的研究结果也表明，籽粒灌浆过程中，HMW-GS各亚基含量与GMP含量呈显著的正相关关系（表2），而从各亚基对GMP

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的贡献（回归方程的斜率）来看，单个亚基的贡献明显小于亚基对（两条亚基）的贡献，而以总亚基含量的贡献更大，即提高总HMW-GS的表达量，更容易提高GMP含量（Yue等，2007）。在GMP含量提高的同时，GMP平均粒度和最大粒径也显著提高（图1）。

表2 不同施氮水平下宁麦9号籽粒灌浆过程中HMW-GS与GMP含量的关系

亚基（对） 方程 相关系数 1 y = 0.5921 x - 0.5876 0.8270** 2 y = 0.9629 x - 0.9381 0.8945** 7 y = 0.8624 x - 0.6023 0.8844** 8 y = 0.3851 x - 0.3008 0.7533** 12 y = 1.0542 x - 0.8128 0.8361** 2+12 y = 2.0171 x - 1.7509 0.8764** 7+8 y = 1.2475 x - 0.9030 0.8463** Total y = 3.8567 x - 3.2416 0.8820**

注：y为GMP含量，x为HMW-GS含量。

由此可见，GMP积累与粒度分布是决定小麦烘焙品质非常重要的因素，而HMW-GS的合成则对GMP的积累与粒度分布起着至关重要的作用。但遗憾的是，以往的研究多注重HMW-GS优质亚基组合的改良，而有关GMP积累与粒度分布形成机理、GMP粒度分布与HMW-GS积累关系等的研究非常薄弱，不利于指导优质小麦新品种的选育与配套技术的研发。

根据他人研究成果和本课题组前期研究结果，小麦籽粒GMP粒度分布特征及其形成机理和调控机制的研究需重点考虑下述因素：

（1）GMP粒度分布存在基因型差异，并受相关编码基因表达的调控。不同基因型间小麦籽粒GMP粒度分布特征存在差异（Tronsmo等，2002；Don等，2003；Spiertz等，2006），但不同小麦基因型间特别是不同品质类型小麦籽粒GMP粒度分布特征及其形成动态的差异尚无人研究。GMP积累与粒度分布主要受HMW-GS积累的影响，而HMW-GS合成显著受其编码基因表达的调控（Ahmad，2000），因此，GMP的积累与粒度分布必然也受相关基因表达的调控。Rakszegi等（2005）通过转基因技术，将一个澳大利亚春小麦品系L88-6中5亚基的编码基因拷贝数增加10－15倍，将该转基因系（B73-6-1）在匈牙利、英国和澳大利亚3个地点连续3年种植，发现转基因系产量性状不受影响，而籽粒5亚基含量较亲本提高了约4倍，5亚基/10亚基比、HMW/LMW-GS比、谷/醇比也显著提高，由此导致蛋白网络结构变化，面团稳定性与筋力变强，但延展性变弱。可惜的是，作者未能分析由此引起的GMP含量和粒度分布的变化。目前大多数编码HMW-GS的基因被克隆，其序列已清楚（D'Ovidio等，1996；Radovanovic和Cloutier，2003），还发现其编码基因的表达具时间和组织特异性（田（名字未知）等，1998），但GMP积累和粒度分布与HMW-GS编码基因表达模式的关系无人研究。

（2）GMP的积累与粒度分布与其主要组分HMW-GS的积累模式有关。现有的研究认为，小麦籽粒HMW-GS最早在花后15天左右开始形成，但不同亚基起始形成时间不同。如Glu-D1、Glu-B1编码的亚基形成起始时间最早，约在开花后第13天出现，Glu-A1编码的1亚基形成较晚，Glu-D1、Glu-B1编码的亚基积累量因此也最高（王燕等，2004）。

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我们的研究结果也表明，高蛋白小麦品种徐州26籽粒HMW-GS在花后14天起始积累，低蛋白品种宁麦9号在花后21天才开始积累，徐州26各主要亚基含量也相应地显著高于宁麦9号，而上述亚基含量的变化与GMP积累规律一致（Yue等，2007）。HMW-GS快速积累阶段的积累过程也影响最终HMW-GS积累量，HMW-GS在花后20左右开始迅速积累，花后28~31天积累量达最高（王燕等，2004），此时HMW-GS的快速大量积累有利于提高亚基含量和最终品质的改善（杜金哲等，2003）。我们研究发现氮素水平可显著促进小麦籽粒HMW-GS和GMP起始与快速积累阶段的合成速率，并延长快速积累持续期（Yue等，2007）。而HMW-GS和GMP起始时间、积累速率期、快速积累持续期等与GMP粒度分布特征形成的关系尚无人报道。

（3）GMP积累与粒度分布受籽粒氮代谢关键酶与内源激素等的调控。作为小麦籽粒主要的贮藏蛋白，HMW-GS的合成过程同时受籽粒氮代谢关键酶及内源激素的综合调节，GMP的合成与粒度分布形成也必然受上述过程的调节。因此，明确小麦籽粒氮代谢关键酶活性、内源激素水平和比例等对GMP合成与粒度分布的关系，必将进一步阐明小麦籽粒GMP粒度分布的形成机理与调控途径。

（4）GMP积累和粒度分布更受环境与栽培措施的调控。环境与栽培措施对小麦籽粒HMW-GS积累的效应已有部分报道（DuPont等，2006a；2006b；2007；Yue等，2007），Altenbach等（2002）发现高温可显著调控HMW-GS编码基因的表达，但这些编码基因的表达与最终GMP粒度分布之间的关系尚无报道。我们最近发现增施氮肥提高了籽粒GMP平均粒径与最大粒径GMP的比例（图1），但不同环境与栽培措施对GMP粒度分布特征形成动态的调控及其机制研究未见报道。

（4）不同的研究材料有助于从不同角度阐明小麦籽粒GMP粒度分布形成机理与调控机制。选用GMP粒度分布差异较大的不同品质类型小麦品种，可在探讨GMP粒度分布特征及其形成机理的同时，明确不同粒度GMP积累过程与籽粒品质形成的关系，进一步解释不同品质类型小麦籽粒品质形成机制。但由于不同品质类型的小麦品种遗传背景差异很大，而GMP积累与粒度分布明显受遗传因素的影响。因此，如选用遗传背景相近的小麦材料如重组自交系（RILs）、近等基因系（NILs）和缺失体材料（Don等，2006）开展相关研究，不仅能深入阐析GMP粒度分布形成的生理生化与分子机理，还可在排除遗传背景的干扰下，进一步阐明生态因子与栽培措施对小麦籽粒GMP粒度分布形成的调控机制。

（5）花后高温与水分逆境是影响我国小麦籽粒品质形成重要的生态逆境。据统计，仅江苏、安徽和豫南等区域小麦抽穗－成熟期间出现日最高气温超过32℃的年份占45－55%；日最高气温达到38℃高温的年份，开花至灌浆初期占5%左右，灌浆中期占12%，灌浆末期占25%。抽穗－成熟日均温大于30℃的天数为11.9天，占此时期总天数的40.3％（王晨阳等，2004）。而随着全球变暖，高温、干旱等极端气候对小麦生产的影响必将日益严重。我国小麦灌浆期乃至整个小麦生育期北旱南涝的灾害频繁出现，且灌浆期干旱或渍水胁迫持续时间呈不断拉长的趋势（刘玲等，2003）。另据气象统计资料，在降雨量相对较高的江苏省，苏北地区小麦抽穗至成熟期发生干旱的几率为64.5％，发生严重干旱的几率为43％；而苏南地区小麦则常伴随渍害的发生，每10年中就有7年因

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湿害导致小麦严重减产、品质劣变（蔡士宾等，1994; 封超年等，2000）。但迄今为止，花后高温与水分逆境对小麦籽粒GMP粒度分布的调控效应与机制的报道甚少。 综上所述，麦谷蛋白大聚合体（GMP）是反映小麦烘焙品质的重要组分，并以GMP粒度分布和积累为重要特征。GMP的积累动态已有部分研究，但其粒度分布特征及其形成规律与调节机制报道甚少。高分子量（HMW-GS）和低分量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）是GMP最主要的组分，以HMW-GS的亚基构成与合成对GMP的积累与粒度分布贡献更大。GMP的形成与粒度分布形成与HMW-GS的积累模式等关系很密切，并取决于编码基因表达起始时间与表达强度；同时，氮代谢关键酶和内源激素可能与GMP积累与粒度分布也有显著的相关关系。灌浆期生态逆境（高温与水分胁迫等）与栽培措施可通过对上述因素的调节，实现GMP积累与粒度分布的调控。

基于上述分析，本项目拟选用籽粒GMP粒度分布差异较大的不同品质类型小麦品种；同时从遗传背景基本相同的重组自交系群体（RILs）中，筛选出GMP粒度分布特征显著不同的家系。以上述品种和家系为材料，重点研究小麦籽粒GMP积累与粒度分布形成的动态特征、生理生化与分子生物学机理、以及主要花后生态逆境与栽培措施的调控效应及机制。以深化小麦籽粒品质形成机理研究，为通过栽培技术手段提升我国现有优质小麦品种籽粒品质提供依据，也为优质小麦新品种的选育提供理论基础。

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[36] 封超年，郭文善，施劲松，彭永欣，朱新开. 2000. 小麦花后高温对籽粒胚乳细胞发育及粒重的影响. 作物学报. 26

（4）: 399-405.

[37] 蔡士宾，曹旸，方先文，朱伟，熊恩惠，严建民. 1994. 小麦灌浆期水渍和高温对植株早衰和籽粒增重的影响. 作

物学报. 20（4）: 457-464.

[38] 刘玲，沙奕卓，白月明. 2003. 中国主要农业气象灾害区域分布与减灾对策. 自然灾害学报. 12 (2): 92-97.

2、项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键问题

研究内容：

麦谷蛋白大聚合体（GMP）的粒度分布和积累是影响小麦烘焙品质的重要因素，但目前有关GMP粒度分布动态特征及其形成规律与调节机制的报道甚少。作为GMP最主要的成分，HMW-GS的积累决定着GMP粒度分布特征（平均粒径、最大粒径、各粒径所占比例、大/小粒径GMP比等）及GMP积累过程，因而，GMP粒度分布和积累受HMW-GS编码基因的表达、籽粒氮代谢关键酶活性和内源激素水平与平衡等的内在调节。灌浆期高温与水分胁迫等生态逆境与栽培措施可通过调节上述因素，调控GMP的积累与粒度分布。

因此，本项目拟以籽粒GMP粒度分布特征差异较大的不同品质类型小麦品种、遗传背景基本相同的重组自交系群体（RILs）家系为材料，重点进行如下内容的研究： ① 小麦籽粒麦谷蛋白大聚合体（GMP）粒度分布特征及其形成的动态规律。以籽粒GMP含量和粒度分布有明显差异的不同品质类型小麦品种与遗传背景相同的RILs家系为材料，探讨GMP粒度分布的基本特征（平均粒径、最大粒径、各粒径所占比例、大/小粒径GMP比等）与表征参数，进一步分析籽粒GMP含量及其粒度分布与小麦籽粒品质形成的关系。 ② 小麦籽粒GMP积累及其粒度分布特征形成与高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）合成的关系。以籽粒GMP含量和粒度分布有明显差异的不同品质类型小麦代表性品种和遗传背景相同的RILs家系为材料，研究小麦籽粒GMP和HMW-GS积累动态，明确小麦籽粒GMP积累特征（积累速率、积累持续期、积累量等）与GMP粒级分布特征（平均粒径、最大粒径、各粒径所占比例、大/小粒径GMP比等）形成与HMW-GS合成的动态关系。 ③ 小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的生理生化调节机理。在籽粒GMP积累的各关键时期，研究籽粒氮代谢关键酶（GS、GPT等）活性及内源激素含量与平衡的

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变化，分析其与籽粒GMP粒度分布特征形成的关系，探求小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的生理生化基础。

④ 小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的分子调节机理。研究小麦籽粒GMP编码基因（主要为HMW-GS编码基因）表达的动态模式，以及其与籽粒不同粒级GMP积累及粒度分布形成动态的关系，以进一步探讨小麦籽粒GMP合成与粒度分布特征形成的分子机制。 ⑤ 灌浆期高温与水分胁迫等生态逆境与栽培措施对小麦籽粒GMP积累与粒度分布的

调控效应及机制。重点研究主要花后生态逆境因子（温度、水分逆境等）与关键栽培措施（氮肥运筹）对小麦籽粒不同粒级GMP积累与粒度分布特征、以及籽粒品质形成的调控效应，探讨其生理生化与分子机制。

研究目标：

① 解释小麦籽粒GMP粒度分布的基本特征、形成动态规律及其与品质形成的关系。 ② 阐明小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的生理生化与分子调节机理。

③ 探明栽培措施与灌浆期主要生态逆境对小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的调控效应与机制。

拟解决的关键问题：

① 小麦籽粒GMP粒度分布特征的解释。

② 小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的动力学过程与关键时期。

③ 小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的生理生化与分子生物学机理、调控途径与机制。

3、拟采取的研究方案及可行性分析

（1）研究方法

① 采用激光粒度分析技术、粒阻高效液相色谱（SE-HPLC）技术、异硫脲荧光素（FITG）标记结合共聚焦扫描显微镜（confocal scanning laser microscopy, CSLM）技术，研究小麦籽粒GMP粒度分布特征及其形成动态。

② 应用本课题组开发的小麦籽粒高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）定量技术，分析小麦籽粒HMW-GS积累的动态特征，探讨GMP合成和粒度分布特征形成与HMW-GS积累的关系。 ③ 选用GMP粒度分布特征差异显著的不同品质类型小麦品种为材料，研究不同品质

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类型小麦品种籽粒GMP积累与粒度分布特征的差异及其生理基础，进一步解释不同品质类型小麦籽粒品质差异的内在机理。

④ 从遗传背景基本相同的2套重组自交系群体（RILs）中，筛选出GMP粒度分布特征显著不同的家系为材料，在基本消除遗传背景干扰的条件下，研究GMP积累与粒度分布特征形成的动态规律及其机理，并进一步阐析环境因子与栽培措施对小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的调控效应与调控机制。

⑤ 采用大田、池栽与盆栽试验相结合的方法，结合人工气候室控温环境，研究小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的动态规律，以及花后主要生态逆境（高温与水分逆境）与关键栽培措施（氮素运筹）对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应。 ⑥ 应用酶学、生理生化分析技术、半定量RT－PCR与Northern杂交技术，研究小麦籽粒GMP合成与粒度分布特征形成的酶学与分子生物学机理，以及花后主要生态逆境与栽培措施调控小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的生理生化与分子机制。

（2）技术路线

采用激光粒度分析技术，筛选出GMP粒度分布特征有显著差异的不同品质类型小麦品种和重组自交系群体（RILs）家系。在田间条件下，运用粒阻高效液相色谱（SE-HPLC）技术，结合异硫脲荧光素（FITG）标记和共聚焦扫描显微镜（confocal scanning laser microscopy, CSLM）技术，研究小麦籽粒GMP粒度分布特征及其形成动态。同步采用本课题组开发的高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）定量技术，研究小麦籽粒HMW-GS积累的动态特征，探讨GMP积累和粒度分布特征形成与HMW-GS合成动态的关系。在大田、池栽、盆栽和人工气候室条件下，研究花后栽培措施与主要生态逆境对GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应与机制。应用酶学、生理生化分析技术、半定量RT－PCR与Northern杂交技术，研究小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的生理生化与分子生物学机理。（见下图）

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不同品质类型小麦品种 重组自交系群体（RILs）GMP激光粒度分析技术 小麦籽粒GMP粒度分布特征描述与表征参数花后高温与水分逆境处理氮素用基追量、比、追氮时间等处理 GMP粒度分布差异显著的不同品质类型小麦代表性品种 SE-HPLC、FITG标记/CSLM技术GMP定量分析技术GMP粒度分布特征明显 不同的代表性RILs家系 HMW-GS 定量分析技术籽粒HMW- GS含量 ELISA 分析技术 籽粒内源激素含量与比例半定量RT-PCR与Northern杂交技术HMW-GS编码基因表达模式 籽粒GMP粒度分布动态 籽粒GMP含量 酶学技术籽粒氮代谢关键酶活性GMP积累和粒度分布特征形成与HMW-GS合成的关系 酶学调节机理 激素调节机理 分子调节机理 小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的生理生化与分子生物学机理 花后生态逆境与栽培措施对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的效应与机制 图4 技术路线示意图

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（3）研究方案

① 小麦籽粒GMP粒度分布特征描述与GMP粒度分布特征不同的代表性基因型筛选。将本课题组在国内搜集的不同品质类型小麦品种、本课题组已有的2套重组自交系群体（RILs，这两套群体的HMW-GS组合不同）在大田种植。成熟期取样，采用激光粒度分析技术，测定小麦籽粒GMP粒度分布，运用数理统计手段，对GMP粒度分布特征进行描述，确定其表征参数。在明确小麦籽粒GMP粒度分布特征的基础上，筛选出：（i）GMP粒度分布特征差异显著的不同品质类型小麦品种2个；（ii）遗传背景基本相同、GMP粒度分布特征差异显著的RILs家系2个（每套群体各2个）。上述材料已于2006年收获，并基本明确了小麦籽粒GMP粒度分布特征评价方法，目前正在进行进一步的检验；已完成筛选内容（i），筛选内容（ii）将于近期完成。 ② 小麦籽粒GMP积累与粒度分布形成动态特征及与籽粒品质形成的关系。将①中筛选出的小麦材料在大田种植，于开花后1周左右（小麦籽粒GMP起始形成时间较迟）开始分期取小麦籽粒样品，采用SE-HPLC技术、异硫脲荧光素（FITG）标记和共聚焦扫描显微镜（CSLM）技术，分析上述小麦基因型籽粒GMP积累与粒度分成特征形成动态规律，包括GMP积累起始时间、快速积累起始时间与持续期、积累高峰期、快速积累速率与平均积累速率，以及GMP平均粒径、最大粒径、分布模式等动态特征参数，明确不同品质类型小麦品种和遗传背景相同而GMP粒度分布不同的RILs家系籽粒GMP积累与粒度分布形成动态的差异。同时采用本课题组已建立的

HMW-GS定量技术，分析HMW-GS积累动态，以明确GMP粒度分布与HMW-GS积累的关系。结合小麦籽粒主要品质性状分析，研究GMP积累和粒度分布特征形成动态与籽粒品质形成的关系。

③ 小麦籽粒GMP合成与粒度分布特征形成的生理生化机理研究。将①中筛选的小麦材料于大田种植，根据②中确定的GMP积累与粒度分布形成的关键时期，测定籽粒氮代谢关键酶（GS、GPT等）活性与内源激素含量动态，并分析上述过程与GMP积累和粒度分布特征形成的关系，以明确小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的生理生化机理。

④ 小麦籽粒GMP合成与粒度分布特征形成的分子机理研究。将①中筛选的材料于大田种植，根据②中确定的HMW-GS积累关键时期，于花后分期取小麦籽粒鲜样品，根据已知HMW-GS的序列，利用已知引物（或重新设计引物），采用半定量RT-PCR技术与Northern杂交（狭线杂交）技术，分析籽粒不同发育阶段各HMW-GS编码基因的表达与HMW-GS合成、GMP积累与粒度分布动态的关系，明确小麦籽粒GMP合成与粒度分布特征形成的分子机理。

⑤ 主要花后生态逆境的调控效应与调控机制。采用①中筛选出的小麦材料，进行盆栽和池栽试验。盆栽试验于花后搬至人工气候室中，设置不同温度处理（昼夜温度分别为25℃/20℃、30℃/25℃、35℃/30℃，处理10天）；池栽试验设置花后不同水分逆境处理（干旱和渍水）。根据②中确定的GMP积累与粒度分布形成关键时期，研究花后高温与水分逆境对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应及其

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生理生化与分子机制。

⑥ 关键栽培措施的调控效应与调控机制。将①中筛选出的小麦材料，于大田种植，设置不同的施氮量处理（0、75、150、225和300 kg N ha-1）、基追比处理（150和225 kg N ha-1两个施氮量，分别设7:3、6:4和5:5基追比）和追肥时期处理（150和225 kg N ha-1两个施氮量，分别设追返青肥、起身肥和拨节肥3个追氮时期）。根据②中确定的GMP积累与粒度分布形成关键时期，研究不同氮素运筹措施对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应及其生理生化与分子机制。 （4）关键技术：

本项目将主要使用如下技术：（引用文献见立项依据及课题组发表相关论文目录） GMP粒度分析技术。本研究中GMP的粒度分析，主要采用如下技术：GMP粒度分布特征差异与代表性基因型筛选研究，用成熟期的大量样品进行测定，主要采用本实验室已建立的激光粒度分析技术。面粉经脱脂处理后，用1.5%的SDS溶液进行多次离心提取，用美国Micromeritics公司生产的Saturn DigiSizer高效激光粒度分析仪进行分析；GMP粒度变化动态分析，因样品量较少，主要采用SE-HPLC结合FITG标记/CSLM技术进行，SE-HPLC主要用于粒度分布的测定，FITG标记/CSLM技术主要用于GMP颗粒形态的观察及粒度测定结果的校正。

HMW-GS准确定量技术。根据本实验室建立的方法（Yue等，2007）。 GS和GPT活性的测定。根据本实验室以前使用的方法（范雪梅等，2005）。 内源激素含量的测定。采用ELISA法，由本校激素研究室提供试剂与方法，在本课题组完成（Xie等，2003）。 半定量RT-PCR。①RNA制备。小麦籽粒样品在液氮中研磨至粉末后放入装有适量Trizol提取液的试管中，用力摇匀，室温下放置5min后，2-8℃下12,000g离心15min上清液转移至新离心管，加入0.5倍体积的氯仿，用力摇动15s，室温下放置2-3min，2-8℃下12,000g离心10 min，重复氯仿抽提。最后的上清液加入2倍体积的预冷乙醇，-20℃下沉淀0.5 h。12,000g离心15min，倒掉乙醇，加入用DEPC水配制的75%乙醇，震动洗涤RNA沉淀，7,500g以上离心5 min。真空干燥后溶于适量的RNase-free水。稀释后A260nm测定RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。②mRNA的分离与纯化。采用Qiagen公司的mRNA分离试剂盒，详细操作按试剂盒说明进行。分离得到的mRNA样品用1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇沉淀，75%乙醇洗涤、干燥后溶解于RNase-free水。我们的研究结果表明，该试剂盒非常适于小麦籽粒mRNA的制备。③RT-PCR。采用已报道的各亚基引物序列（Ahmad，2000；D’Ovidio等，1996；Radovanovic和Cloutier，2003）设计引物，RT-PCR根据Altenbach等（2002）提供的方法进行。必要时，扩增产物进行克隆测序，以确保其为目的基因。

Northern杂交。配合半定量RT-PCR使用，根据DIG-Easy-Hibridization kit II提供

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的Northern狭线杂交方法进行。①探针DNA的制备。引物同上，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、检测浓度；必要时将扩增产物进行克隆测序，以确保其为目的基因。取1µg模板cDNA，在反应离心管中用双蒸水定溶至16µl，煮沸10min完全变性，冰上迅速冷却；混匀DIG-High prime，取4µl加入到上管中，混匀，稍离心使溶液置管底；37℃温育1h以上，加入2µl 0.2M EDTA（PH8.0）终止反应；检测探针标记效果。②总RNA的提取见上。③RNA转印和固定。负压50~250mba转印总RNA至尼龙膜或硝酸纤维素膜上；80℃真空烘烤2h小时固定。④杂交。将适量DIG-Easy Hyb 预热至杂交温度，预杂交30min后，加入变性DIG-labeled DNA probe（煮沸5min，冰上骤冷），将探针加至适量预热的DIG-Easy Hyb，倾去预杂交液，加入杂交液，孵育4h。⑤显色。根据试剂盒要求进行。

（5）可行性论证：

① 研究思路清晰新颖。麦谷蛋白大聚合体（GMP）是小麦籽粒最重要的贮存蛋白，其粒度分布和含量是影响小麦烘焙品质的重要因素。GMP主要由HMW-GS和LMW-GS组成，并以HMW-GS的合成对GMP的积累与粒度分布有着决定性作用。GMP的形成与粒度分布还受籽粒氮代谢关键酶活性等的内在调节；灌浆期高温与水分胁迫等生态逆境与栽培措施可通过调节上述因素，调控GMP的积累与粒度分布。本项目选用代表性基因型，探讨小麦籽粒GMP积累与粒度分布形成的动态规律及其酶学与分子生物学机理，以及籽粒内源激素对GMP积累与粒度分布特征形成的调节效应，通过花后生态逆境与栽培措施处理，探讨其对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应与调控机制。预期成果将进一步深化小麦籽粒品质形成机理与调控途径研究，并有助于在现有优质小麦品种的基础上，指导栽培措施的运用，改善我国现有小麦品种品质性状。

② 研究材料独特。本研究拟选用两种类型的研究材料。选用GMP粒度分布特征有显著差异的不同品质类型小麦品种为材料，可在明确不同品质类型小麦品种籽粒GMP积累与粒度分布特征差异及其生理机理的基础上，进一步探明GMP积累和粒度分布特征与不同品质类型小麦籽粒品质形成的内在关系。遗传背景基本相同而GMP粒度分布特征显著不同的重组自交系群体（RILs，这两套群体的HMW-GS组合不同，因而还可用于深入研究HMW-GS亚基组合和积累与GMP粒度分析的关系）家系，可在排除遗传因素的干扰下，深入研究花后生态逆境与栽培措施对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应与调控机制。 ③ 研究手段可靠、方案可行。运用先进的激光粒度分析技术、粒阻高效液相色谱（SE-HPLC）技术、异硫脲荧光素（FITG）标记结合共聚焦扫描显微镜（CSLM）技术，可在不同层面上（大量和微量样品）分析小麦籽粒GMP粒度分布特征，明确其形成动态规律；结合本课题组开发的小麦籽粒高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）准确定量技术，可进一步明确GMP积累与粒度分布特征形成动态与

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HMW-GS积累动态的关系。采用ELISA分析技术，耦合酶学研究方法及半定量RT－PCR和Northern杂交技术，可明确籽粒氮代谢关键酶活性、内源激素以及HMW-GS编码基因的表达模式等在小麦籽粒GMP合成及其粒度分布特征形成中的调节作用，进而深化小麦籽粒品质形成机理。通过花后主要生态逆境因子与栽培措施对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征形成的调控效应与调控机制的研究，可进一步提出小麦籽粒GMP积累与粒度分布形成的调控途径与调控措施。

④ 前期研究基础扎实。本课题组多年来一直从事小麦产量与品质生理生态研究，在小麦籽粒品质形成机理与调控方面取得了较快的进展，尤其在小麦籽粒蛋白质及其组分合成的生理生化机理与调控途径等方面，已有较深入的研究，建立了本项目研究必需的GMP粒度分析技术（包括激光粒度分析技术、SE-HPLC技术、FITG标记/CSLM技术）和HMW-GS定量技术，拥有本研究必需的2套RILs群体，已完成了本研究所需的代表性品种的筛选，近期内将完成RILs代表性家系的筛选。并初步研究了氮素水平对小麦籽粒GMP积累与粒度分布特征的调控效应。 ⑤ 研究队伍精干。课题组成员研究基础扎实，具很强的业务能力与协作精神，已充分掌握本领域研究前沿，并掌握本研究所需的研究技术与方法，包括激光粒度分析技术、SE-HPLC技术、FITG标记/CSLM技术等GMP粒度分析手段、HMW-GS准确定量技术、半定量RT-PCR和Northern杂交技术等。 ⑥ 试验与研究条件优良。依托农业部作物生长调控重点开放实验室和农业部小麦区域技术创新中心，在国家重点学科、农业部重点学科和江苏省“重中之重”重点学科建设的支持下，建成了设施一流的作物学科研基地和配备精良的生理生化实验室，具备本项目研究所需的所有硬件设施。特别是已具备本研究必需的先进的Saturn DigiSizer高效激光粒度分析仪、Waters-515型HPLC、PCR仪、温网室和智能全控大型人工气候室等。本校公共研究平台可提供本研究需要的Olympus FV 1000型共聚焦激光扫描显微镜。

4、本项目的特色与创新之处

① 学术思想新颖。近年来，食品加工领域的研究者非常重视麦谷蛋白大聚合体（GMP）在面团醒发与食品最终加工中的作用，提出GMP的粒度分布与结构是影响小麦加工品质最为重要的因素之一。但GMP的粒度分布尚未引起育种和栽培工作者的足够重视，对于GMP粒度分布特征、形成规律、生理生化和分子机理、调控机制等均不清楚，不利于小麦优质新品种的选育与配套栽培技术的研制。本研究拟首先明确小麦籽粒GMP粒度分布特征与形成动态规律，并重点研究GMP合成与粒度分布特征形成的生理生化与分子机理及调控途径，寻求通过栽培措施的运用调控GMP粒度分布的形成，进而实现在现有优质小麦品种的基础上，改良小麦籽粒品质。 ② 研究重点突出。谷物化学领域的研究者和本课题组前期研究结果均发现GMP的关键组分HMW-GS的积累，是影响或调控GMP粒度分布最重要的因素。本研究即以

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HMW-GS的积累与GMP粒度分布特征形成的关系为突破口，重点阐明GMP粒度分布特征形成的生理生化与分子机理、环境因子与栽培措施的调控效应，以进一步深化小麦籽粒品质形成机理研究，并为小麦品质调优栽培技术的研制提供依据。 ③ 研究材料独特。GMP粒度分布差异显著的不同品质类型小麦品种，可在分析品种间GMP粒度分布差异形成机理的基础上，进一步明确GMP积累和粒度分布与不同品质类型小麦籽粒品质形成的关系。遗传背景基本一致、GMP粒度分布特征明显不同的重组自交系（RILs）家系，可在排除遗传因素的干扰下，深入研究小麦籽粒GMP积累和粒度分布特征形成的调控途径与机制。

④ 研究手段先进可靠。运用先进的激光粒度分析技术、SE-HPLC、FITG标记/CSLM技术，可在不同层面上（大量和微量样品）准确分析小麦籽粒GMP粒度大小，不仅满足本研究中不同品质类型小麦代表性品种和RILs家系筛选的需要，还能满足不同生态逆境与栽培措施下小麦籽粒GMP粒度分布动态分析的要求，结合本课题组自行开发的HMW-GS准确定量技术，可进一步分析GMP粒度分布与HMW-GS合成的动态关系。采用酶学、ELISA、以及半定量RT-PCR与Northern杂交等研究手段，可深入研究小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的酶学与内源激素调节机制理及分子调节机制，探讨GMP粒度分布特征形成的调控途径。 ⑤ 理论联系实际。以现有优质小麦品种为基础，结合RILs家系材料，研究小麦籽粒GMP粒度分布特征、形成动态、调节机理与调控途径，预期结果不仅将丰富和深化小麦品质生理与调优理论，还将有助于通过栽培措施等调控手段，实现在我国现有小麦品种品质现状的基础上，提升小麦籽粒品质。同时，还可为明确小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的遗传特性及优质小麦新品种选育提供部分依据。

5、年度研究计划及预期研究结果

（1）研究工作的总体安排及进度：

项目将于2008年1月至2010年12月间完成。

2008年1月－2008年12月。完成代表性基因型的筛选（主要为代表性RILs家系筛选），完成小麦籽粒GMP积累与粒度分布动态特征的研究，并开始GMP积累与粒度分布特征形成的生理生化机理与氮素运筹对小麦籽粒GMP粒度分布特征的调控效应研究。撰写论文1－2篇。

2009年1月－2009年12月。进行GMP积累和粒度分布特征形成的生理生化与分子机理研究，重复氮素运筹对小麦籽粒GMP粒度分布特征形成动态的调控效应研究，并开始灌浆期高温与水分逆境对小麦籽粒GMP积累和粒度分布特征的调控效应与调控机制研究。撰写论文2篇。

2010年1月－2010年12月。完成小麦籽粒GMP积累和粒度分布特征的生理生化

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与分子机理研究，以及灌浆期高温、水分逆境与氮素运筹对小麦籽粒GMP积累和粒度分布特征的调控效应与调控机制研究。撰写论文3－4篇，进行项目结题。

（2）预期结果：

（1） 明确小麦籽粒GMP粒度分布特征及其形成的动态规律。

（2） 阐明小麦籽粒GMP粒度分布特征形成的生理生化与分子机理。

（3） 阐明灌浆期高温与水分逆境及氮肥运筹对小麦籽粒GMP粒度分布特征形成

的调控效应与调控机制。

（4） 在国内外核心期刊发表学术论文6篇以上，其中SCI论文2篇以上。 （5） 培养研究生3名以上。 （6） 提交研究报告。

（二）研究基础与工作条件

1.工作基础

（1） 申请者长期从事小麦品质调优栽培理论与技术研究，在小麦籽粒蛋白质和淀粉合

成的生理生化机理、生理与生态调控途径等方面有较好的研究积累。特别是完成了小麦籽粒蛋白质和淀粉合成的基因型差异研究，明确了源库关系、灌浆底物C/N供应等生理调控手段对小麦籽粒蛋白质和淀粉合成的效应与生理生化机理。在国内外核心期刊发表学术论文7篇，含SCI收录论文1篇，参加了专著《小麦品质生理生态及调优技术》的写作。

（2） 申请者所在课题组一直从事小麦品质形成的生理生态与品质调优栽培技术领域

的研究，在不同专用类型小麦籽粒品质性状的基因型与环境效应评价及品质生态区划、不同专用类型小麦籽粒品质形成的生理生化基础、小麦籽粒蛋白质和淀粉形成的协调途径和调控技术等方面取得了显著进展。完成了《小麦籽粒品质形成机理与调优栽培技术的研究与应用》成果1项，该成果获2005年江苏省科技进步一等奖，2006年获国家科技进步二等奖。 （3） 申请者所在课题组拥有本研究所需的研究材料，包括多年来从全国收集的不同品

质类型小麦品种（系）和种质资源400余份、可用于本研究的重组自交系群体2套（2套群体HMW-GS构成各不相同）。

（4） 建立了本研究所需的研究方法。包括激光粒度分析技术、SE-HPLC、FITG标记

/CSLM技术，ELISA激素分析技术、半定量RT-PCR与Northern杂交技术、HMW-GS准确定量技术等。 2.工作条件

本课题组目前所在的南京农业大学作物栽培学学科为国家“211”重点建设学科，江苏省“重中之重”学科，建有农业部“作物生长调控重点开放实验室”、“江苏省农业信息农业高技术研究重点实验室”。已建成了设施一流的科研基地和配备精良的实验室，