耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究

鱼堕丝壁匡堂塑查垫！！生！旦蔓ｉ！鲞箜；塑丛』逊丛蔓！壁垒竺塑垫！！：ｙ唑！！：№；・１３１・・临床研究・耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究张保华１，付光林２，余桂香１，吴和姻１（１．安徽省黄山市人民医院检验科２４５０００；２．安徽省立医院检验科，合肥２３００００）【摘要】目的了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的耐药特点和分子流行病学情况。方法对临床分离的金黄色葡萄球菌应用ＶＩＴＥＫ一３２微生物分析仪及配套ＧＰＳｌｌ８药敏卡测定其对１２种抗菌药物的敏感性。头孢西丁纸片扩散法筛选ＭＲ—ＳＡ。对已筛选的１２株ＭＲＳＡ。应用随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技术进行基因型别分析。结果１２株ＭＲＳＡ对氨苄西林、苯唑西林、青霉素Ｇ和红霉素全部耐药；对氯洁霉素、庆大霉素、左氧氟沙星均出现８株耐药；对万古霉素、利奈唑烷、喹努普汀／达福普汀伞部敏感。ＲＡＰＤ将检测菌株分为３个型别（Ａ～Ｃ）其中ＲＡＰＤＡ型和Ｂ型是本院的主要流行菌株。结论多重耐药菌，本地Ⅸ存在两种不同型别的ＭＲＳＡ流行克隆。【关键词】葡萄球菌，金黄色；中图分类号：Ｒ３７８．１１；Ｒ１８１．３２甲氧西林抗药性；文献标识码：ＡＭＲＳＡ表现为流行病学，分子文章编号：１６７３—４１３０（２０１０）０２—０１３１一０２Ｓｔｕｄｙｏｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａａｒｅｌＩ￥ｚＨＡＮＧＢａｏ－ｈｕａ。ＦＵＧｕａｎｇ—ｌｉｎ，ＹＵＧｕｉ—ｘｉａｎｇ．ｅｔａｌ．（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕａｎｇｓｈａｎ，Ｈｕａｎｇｓｈａｎ２４５０００，Ｃｈｉｎａ．２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣ１ｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｅｆｅｉ２３００００，Ｃｈｉｎａ）ｐａｔｔｅｒｎ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉ—ｄｅｍｉｏｌｏｇｙｐｒｏｆｉｌｅｏｆｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｔｏａｕｒｅｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｏｃｏｌｌｅｃｔｄａｔａｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｅｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｕｒｅｕｓｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓｉｎｔｈｅＰｅｏｐｌｅ’ＳＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕａｎｇｓｈａｎｆｒｏｍＪｕｎｅ２００８Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００８．ＴｈｅｓｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｔｏｓｔｒａｉｎｓａｎ・－ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅＶｉｔｅｋ—‘３２ａｎａｌｙｓｅｒａｎｄｉｔｓｍａｔｃｈｉｎｇｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｃａｒｄｓｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｄｄｅｔｅｃｔｔｈｅｉｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏｗａｒｄｓ１２ｋｉｎｄｓｏｆＭＲＳＡｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙＣｅｆｏｘｉｔｉｎｄｉｓｋｄｉｆｆｕｓｉｏｎ．Ｆｏｒｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄ１２ＭＲＳＡ。ｔｈｅｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡｔＯ（ＲＡＰＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｉｒｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｔｏＡｌｌ１ＺＭＲＳＡｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，（）ｘａｃｉｌｌｉｎ。ｔｏＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＧａｎｄＥｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ８ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔＣｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ，Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｂｕｔｗｅｒｅａｌｌｓｅｎｓｉｔｉｖｅＶａｎ—ｃｏｍｙｃｉｎ，Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ，Ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ／Ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ．ＲＡＰＤｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｄｉｖｉｄｅｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｉｎｔｏｔｈｒｅｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓ（Ａ－Ｃ），ａｎｄＲＡＰＤＡ，ＲＡＰＤＢｗｅｒｅｔｈｅｏｔｉｃｓ，ａｎｄ２ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｍａｊｏｒｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｓｉｎｔｈｉｓｈｏｓｐｉｔａｌ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｏｆＭＲＳＡｉｎｔｈｉｓｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｍｕｌｔｉ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｗａｒｄｓａｎｔｉｂｉ—ＭＲＳＡｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｐｒｅｖａｌｅｎｔ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ；ｍｅｔｈｉｃｉＵｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｍｏｌｅｃｕｌａｒ最新研究表明。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的发生率高达４０％～５００Ａ。２００５年我国协和、瑞金等７家医院的上海生物工程技术服务有限公司合成。２．方法１）药敏试验：ＶＩＴＥＫ一３２微牛物分析系统及配ＭＲＳＡ检出率为５６．１％～９３．ｚ％，平均６９．５％［】】。分子流行病学证实，世界范嗣内广泛流行的ＭＲＳＡ主要由少数具有特定遗传背景的克隆株（国际流行株）引起的。现调查并研究ＭＲＳＡ菌株的耐药性及分子流行病学情况，报道如下。资料和方法套ＧＰＳｌｌ８药敏板测定ＭＲＳＡ对１２种抗菌药物的敏感性。２）ＭＲＳＡ检测：用头孢西丁（３０ｔｔｇ／片）对１２株金葡菌做药敏试验，头孢西丁均耐药确定为ＭＲＳＡ，金葡菌ＡＴＣＣ２５９２３为Ｍ．袋ＳＡ阳性对照。３）ＤＮＡ模板的制备：采用Ｉ。ｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ裂解并煮沸法制备模板：用一次性接种环挑取３５℃过夜纯培养的血琼脂平板上的细菌菌落若干放入含５０Ｕ／ｍＬＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ１．资料１）菌株来源：抽取黄山市人民医院２００８年６的１００扯ＬＴＥ缓冲液中（ｐＨ＝８．ｏ）的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，混匀。３５℃水浴３０ｒａｉｎ，１００℃煮沸１０ｒａｉｎ，１００００ｒ／ｒａｉｎ离心１０月至１２月临床标本分离的ＭＲＳＡ菌株，剔除同一患者的莺复菌株共１２株。药敏试验质控菌株为金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＭＳＳＡ）（由本室保存）。２）仪器与试剂：ＶＩＴＥＫ－３２微生物分析仪及配套比浊仪为法国ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ公司产品，ＧＰｌ鉴定卡和ＧＰＳｌｌ８药敏卡，ＧＰＳｌｌ８阳性药敏卡中的抗生ｒａｉｎ。吸取上清液即为细菌总ＤＮＡ溶液（一２０℃保存）。４）ＲＡＰＤ反应总体积为５０弘Ｉ。，１０×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇｚ＋ｆｒｅｅ）５肛Ｌ、ＭｇＣ１２（２５ｍｍｏｌ／Ｉ。）６弘Ｉ。、Ｔａｑ酶（５Ｕ／ｉ，）０．５肛Ｌ、ＤＮＴＰ４肛Ｌ、引物５肛Ｌ和模板４ｐＬ，加灭菌去离子水５０弘Ｉ。。扩增程素包括万古霉素、利奈唑烷、喹努普汀／达福普汀、四环素、复方新诺明、左氧氟沙星、庆大霉素、氨苄西林、氯洁霉索、红霉索、苯唑西林、青霉素Ｇ；头孢西丁纸片（３０弘ｇ／片）购自杭州天和序：９４℃预变性５ｒａｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ。４０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｒａｉｎ，３５个循环，最后７２℃延伸１０ｒａｉｎ。产物在含ＥＢ的２％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察结果。５）统计分析：使用ＳＰＳＳ１０．０软件。６）一般资料调查：对可查到微生物试剂公司；ＰＣＲ扩增仪为德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司产品，电泳仪为北京六一仪器厂产品；凝胶成像系统为美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公司产品，ＴａｑＤＮＡ酶、ｄＮＴＰ、Ｍ９２＋及不含Ｍｇ”的ｂｕｆｆｅｒ、上样缓冲液及ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＩ，１００、ＤＩ．２０００，购于大连宝生物公的１２例ＭＲＳＡ感染患者的科室分布、病史、年龄分布、ＭＲＳＡ的标本来源等资料进行回顾性分析。结１．药敏结果果司；溶葡萄球菌酶购于上海生工公司。３）引物：ＲＡＰＤ所用引物ＥＲＩＣ２：５－ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ－３委托１２株ＭＲＳＡ对青霉素Ｇ、氨苄西林，苯唑万方数据・１３２・垦堕焦墅匡堂壅查垫！！生！旦蔓！！鲞箜；塑丛』坐丛鱼：曼查型型垫！！：ｙ唑塑：№；西林和红霉索表现为伞部耐药。对庆大霉素、氯洁霉素、左氧氟沙星、四环素均为８株表现为耐药。对万古霉素、利奈唑烷和喹努普汀／达福普汀表现为全部敏感，对复方新诺明仅１株出现耐药。２．ＲＡＰＤ同源性分析全部１２株ＭＲＳＡ均可进行ＲＡＰＤ基因图谱分型。用ＥＲＩＣ２引物对１２株ＭＲＳＡ扩增后，得到３～１０条主条带。相对分子质量在１５０～１５００ｂｐ之间，依据该引物扩增产物的电泳谱的差异．参考文献［３３将距离系数小于１５作为分类标准。将１２株ＭＲＳＡ区分为Ａ、Ｂ、Ｃ共３个ＥＲＩＣ型别。其中Ａ型６株。编号为１、２、４、８、１１、１２；Ｂ型５株，编号为３、５、６、７、９；Ｃ型１株，编号为１０（图１）。围１１２株ＭＲＳＡ的ＲＡＰＤ图谱注；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；Ａ型：１（标本号８０６１７１）、２（标本号８０８１９０）、４（标本号８０８２１７）、８（标本号８０８１４５）、１１（标本号８１０２４２）、１２（标本号８１１１３１）≠Ｂ型：３（标本号８０８２３２）、５（标本号８０７２６Ｉ）、６（标本号８０９１１３）．７（标本号８０９３５６）、９（标本号８１０２１３）；Ｃ型：１０（标本号８１０２３２）。讨论本组资料显示１２株ＭＲＳＡ伞都表现为多霞耐药菌（对３种以上不同化学结构的抗菌药物耐药）。仅对万古霉素、利奈唑烷、喹努普汀／达福普汀和复方新诺明４种抗菌药物的敏感性较好，万古霉素一直是临床治疗ＭＲＳＡ感染的首选药物，但近年来ＭＲＳＡ对糖肽类抗生素的敏感性在不断的降低【３Ｊ。本研究中未检出万古霉素耐药菌株。同时对利奈唑烷也未出现耐药的菌株，Ｓ．Ｋｏｈｎｏ等¨１的一项研究表明在治疗ＭＲＳＡ感染上，单一用药时利奈唑烷的效果等同于万古霉素，而且单用利奈唑烷时ＭＲＳＡ的根除率优于万古霉素，因此经验性用药不妨首选利奈唑烷。分子流行病学调查是分析耐药菌流行原因的重要手段之一。本组采用随机扩增多态（ＲＡＰＤ）法对１２株ＭＲＳＡ进行同源性分析。１２株ＭＲＳＡ都可以用ＥＲＩＣ２引物进行分型，共有３个ＭＲＳＡ流行克隆，３种ＭＲＳＡ中的Ａ型（６株）和Ｂ型（５株）占本组ＭＲＳＡ的９１．７％（１１／１２），说明本院在这一时期同时存在两种主要克隆的ＭＲＳＡ流行。韩立中等嘲报道上海地区３所医院中瑞金医院和上海市第六人民医院以ＲＡＰＤＣ型为主，华山医院则同时存在ＲＡＰＤＢ型和Ｃ型２个克隆．本研究结果与华山医院相似。分析其原因可能是因为本地区为知万方数据名旅游胜地，而本院则是本地区唯一一所大型综合性公利医院。随着国内外游客接待量的增加，本院接待外地游客的门诊和住院量也随之增加，这就可能造成不同克隆的ＭＲＳＡ经由游客散播到本地区。本组ＭＲＳＡ感染多发生于有开放性创伤、经历大手术、接受侵入性操作及滥用抗菌药物的患者，说明外源性途径是主要感染方式。分析ＭＲＳＡ外源性感染的途径在本院主要有两种，一是自身感染，即患者自身卜皮或黏膜携带的ＭＲＳＡ，在抵抗力低下，发生开放性创伤或是经历侵袭性操作时人体的正常屏障受到损害，．使细菌容易侵入造成感染。由于健康人群ＭＲＳＡ的定植率不超过２％，故这种方式发生的ＭＲＳＡ感染率较低，但通常较难控制。国外的一项研究表明。采用快速检测ＭＲＳＡ的方法筛选ＭＲＳＡ。同时对筛选出的ＭＲＳＡ阳性携带者进行严格的消毒隔离措施，仍不能有效降低ＭＲＳＡ的感染率ｆ６Ｊ。另一种途径是接触感染。由于健康医护人员比健康人群有更高的ＭＲＳＡ携带率。往往会通过诊疗操作感染患者，或者是患者与患者之间、患者与陪护人员之间交流接触引起，这种感染方式通常是造成医院爆发流行的主要原因。通过同源性分析结果与临床资料比较，发现本院两种主要克隆流行的ＭＲＳＡ分布在骨科和脑外科。同时烧伤科和呼吸内科也各发现１株。在不同的科室均发现ＲＡＰＤＡ型和Ｂ型菌株说明通过医生会诊或是陪护人员与患者接触传播的可能性极大，这有待进一步研究证实。通过本研究．初步掌握了本院住院患者ＭＲＳＡ的耐药状况和分子流行病学特征，为今后制定ＭＲＳＡ监测及防治提供了依据。参考文献：Ｉｌｌ朱德妹．２００５中国ＣＨＩＮＥＴ葡萄球菌属耐药性分析［Ｊ］．中国感染与化疗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