人脐带间充质干细胞的研究进展及应用

人脐带间充质干细胞的研究进展及应用

作者：王玲利

来源：《中国科技博览》2018年第02期

[摘 要]人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）具有低免疫原性，自我更新、增殖和多向分化的潜能；hUCMSCs具有来源广泛、可塑性强、对供者无不利影响、无伦理限制问题等优势，使其成为组织工程、造血干细胞移植、细胞治疗和基因治疗中极具潜力的种子细胞，在研究及临床应用方面也有十分广阔的前景。

[关键词]人脐带；间充质干细胞；移植治疗

中图分类号：S785 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）02-0324-02

间充质干细胞（MSCs）根据其来源主要分为，骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪间充质干细胞（ADMSCs）和脐带间充质干细胞（UCMSCs）。脐带间充质干细胞（UCMSCs）的特性类似于骨髓间充质干细胞（BMSCs），因其增殖和分化潜能比BMSCs更高，获取过程为非侵袭性，来源丰富、取材方便而成为科研和临床工作中干细胞的一个较好来源。本文就近几年国内外关于hUCMSCs的研究现状和应用进行了综述。 1 hUCMSCs的来源

人脐带由三部分构成：羊膜被覆上皮、脐血管和位于两者之间被称为华氏胶的胚胎黏液结缔组织。Mitchell[1]首次从华氏胶中提取出一种成纤维样细胞，并证实了该类细胞具有多向分化的潜能。Romanov 等首先证明了脐带组织中含有干细胞。随后多位研究者从脐带华氏胶中分离到这种成纤维样细胞，证实其具有自我更新、增殖和多向分化的潜能，并命名为人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）。 2 hUCMSCs的分离培养 2.1 hUCMSCs的分离

目前hUCMSCs 的分离方法主要有组织块贴壁法和酶消化法两种。其中，在分离培养的早期，酶消化法获得的细胞数量更多，但含有其他类型的细胞，需要标记分离纯化；组织块贴壁法操作比较简单，且传代后的细胞形态及增殖活性更加稳定，污染机会更小，培养体系中几乎没有造血细胞、内皮细胞或平滑肌细胞等。 2.2 hUCMSCs的培养

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常用的hUCMSCs培养基为α-MEM或者低糖DMEM中加10%的胎牛血清、生长因子、抗生素和营养物质等，在5%CO2、37℃及饱和湿度的培养箱中培养，2～3d需要更换一次培养液，原代培养大约2周，当贴壁细胞80～90%融合时，就可按1：3进行传代培养，2～3d后就可得到较为纯净且均匀一致的细胞系。研究显示，酸性培养基Mesencult更有利于脐带血细胞的生长，并能形成克隆；经低强度脉冲式超声波处理的脐带及传代细胞，在同等条件下能获得对照组3倍数量的细胞，并且细胞的扩增能力明显增强，但持续的低强度超声波反而会降低细胞的增殖能力[2]。 3 hUCMSCs的生物学特性 3.1 hUCMSCs的细胞形态

分离得到hUCMSCs后，培养24h，可在倒置显微镜下观察到贴壁形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或者旋涡状生长，在低密度时较扁平，密度增加趋于融合时细胞就变得细长，也可观察到多角形的细胞。扫描电镜下观察到细胞呈长条状纤维样，表面不光滑，细胞有小结节状物，无明显突起，细胞间无网状连接。 3.2 hUCMSCs的生长、增殖特点

细胞的原代培养一般需要10～14d，待细胞融合达80%后进行传代培养，接种后2～4d增长趋势最为明显。对细胞周期分析发现，第2～6代的hUCMSCs为正常的二倍体细胞，80%的细胞处于G0～G1期，处于活跃增殖期的细胞较少。早期细胞生长呈增长的趋势，潜伏期一般不超过36h，之后进入对数增长期，一般持续到第6～8d，之后进入平台期，呈现典型的“S”型增长方式。

3.3 hUCMSCs的免疫表型及免疫标记

目前研究发现，hUCMSCs没有特异的表面抗原，但可形成表面蛋白作为抗原标记，4～8代的hUCMSCs表面标记较为稳定。通常hUCMSCs高表达间充质干细胞标记和黏附分子标记，低表达移植相关的表面标记MHC-I类分子标记等，弱表达CD106，不表达造血干细胞标记、内皮细胞标记、单核巨噬细胞表面标记CD14及与淋巴功能相关的抗原lαCD11a，也不表达MHC-Ⅱ类分子标记及CD80、DC86等HLA抗原识别有关的共刺激因子。大量研究表明hUCMSCs是更原始的间充质干细胞群，可能具有更强的可塑性和极低的免疫原性，类似于稀少的成人多能祖细胞。 3.4 hUCMSCs的免疫原性

hUCMSCs具有极低的免疫原性和诱导免疫耐受能力。研究发现，hUCMSCs低表达HLA-ABC，不表达HLA-DR，也不表达共激分子CD80和CD86，而细胞表面共激分子是T细胞活

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化剂增殖过程中必需的信号系统。在小鼠试验中发现，UCMSCs不刺激小鼠淋巴细胞增殖，还可以显著抑制小鼠淋巴细胞的反应。以上研究说明hUCMSCs不仅具有较低的免疫原性，还能抑制免疫活性细胞的增殖。 3.5 hUCMSCs的分化潜能

hUCMSCs具有强大的多向组织分化能力，可向外胚层、中胚层及内胚层细胞分化。大量研究证实，hUCMSCs在体内可分化为神经细胞、骨骼细胞、内皮细胞、心肌细胞、光敏感感受神经细胞、多巴胺能神经元细胞等；在体外可分化为脂肪细胞、成骨细胞、骨骼肌细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、神经胶质细胞、肝细胞、多巴胺能神经细胞、神经细胞、平滑肌细胞、胰岛样细胞及生殖细胞等[3]。

研究发现，hUCMSCs经成骨诱导后，碱性磷酸酶（ALP）活性增高（未诱导的脐带贴壁细胞中无ALP），并表达骨涎蛋白（ON），证实了hUCMSCs具有成骨潜能。诱导hUCMSCs向多巴胺神经元转化的研究表明，络氨酸羟化酶（TH）阳性标志率为12.7%，而培养基中有多巴胺释放。将来自脐动脉、脐静脉及全部脐带的细胞进行体外培养，三种来源的细胞均有肌成纤维细胞的活性。Baksh发现hUCMSCs向脂肪细胞诱导时可产生丰富的脂肪小滴，Wang研究表明hUCMSCs可诱导分化为神经细胞。 4 hUCMSCs的移植应用

近年来，hUCMSCs在细胞替代治疗和再生医学、组织工程学等应用领域成为研究热点，在体外诱导hUCMSCs分化及动物体内移植等方面取得了令人瞩目的成绩，为临床应用的可行性、安全性提供了可靠的理论支撑和实践基础。 4.1 hUCMSCs在组织工程中的应用

有研究者利用hUCMSCs在血管生物反应器内成功构建出了人工血管，而通过透射镜及组织学等检测发现该人工血管的形态和机械强度均与人的肺动脉相接近。Kadber等将hUCMSCs接种于PGA/P4HB生物聚合体上能产生大量的种子细胞，且细胞的增殖速度明显增加。 4.2 hUCMSCs移植治疗神经疾病

中枢神经系统损伤会导致严重的功能障碍，但目前尚无神经系统损伤后修复和再生的有效措施，外源性细胞替代治疗是神经修复重建的有效治疗策略之一。

将hUCMSCs移植入光感受器退变老鼠的视网膜下，hUCMSCs分泌的神经营养因子对视觉的修复有很大的作用，尤其是脑源性神经营养因子（BDNF），能有效地修复视觉功能[4]。hUCMSCs也有向大脑缺血区域迁移的能力，在损伤区域向胶质细胞、血管内皮细胞和神经细

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胞分化，促进损伤部位血管及神经的再生。有研究认为是源于hUCMSCs的神经保护以及它分泌的各种营养因子在机体损伤修复中起到重要作用，也有学者认为在hUCMSCs衍生的巨噬细胞和小胶质细胞的相互调节下，干细胞整合素的表达增强才是hUCMSCs移植后缺血大脑神经损伤修复的关键因素。但目前关于hUCMSCs改善大脑缺血症状的机制还没有统一结论，有待进一步的研究。

另外，hUCMSCs在治疗脊髓损伤中也有显著的效果，移植到宿主损伤脊髓后可促进脊髓神经功能的恢复。Yang发现，UCMSCs有助于完全性横贯性脊髓损伤大鼠运动功能的改善；未经体外诱导的hUCMSCs可在脊髓损伤的大鼠体内向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化，减少胶质瘢痕，促进脊髓损伤大鼠的神经功能的恢复[5]。可见，hUCMSCs为治疗脑缺血、脊髓损伤等神经系统相关的疾病提供了广阔的应用前景。 4.3 hUCMSCs移植治疗心血管疾病

心肌细胞缺乏再生能力，在局部缺血损伤时心肌细胞的死亡会导致心力衰竭，采用健康人的不同干细胞替代治疗并增强心脏功能成为细胞工程治疗的研究热点。研究证实，hUCMSCs在经过5-氮胞苷诱导后可分化为心肌细胞，表达钙黏蛋白和心肌钙蛋白Ⅰ，在形态学上可以观察到诱导分化后的hUCMSCs能产生自律搏动，说明hUCMSCs可分化成心肌细胞，可以作为心肌细胞的来源。

高连如等[6]把hUCMSCs移植于由冠心病引起的慢性心脏功能衰竭者，移植2周后发现，患者心功能左室射血分数提高了13%，患者夜间能够平卧入眠，并无阵发性呼吸困难的现象。将来源于hUCMSCs和脐血的内皮细胞移植到人工心瓣膜支架上，利用生物效应器模拟体内心瓣膜的工作环境，再通过生物与机械刺激作用，可获得具有活力的人造心瓣膜，且该瓣膜表现出成熟的分层组织结构及含有功能的内皮细胞与细胞外基质产物，可见，hUCMSCs可在组织工程中作为人工心瓣膜的来源。 4.4 hUCMSCs与糖尿病和肿瘤病

将hUCMSCs移植到患糖尿病的大鼠体内，60d后能在大鼠胰岛腺中检测出人胰岛素基因，说明hUCMSCs具有向胰岛样细胞分化的潜能。在体外将hUCMSCs诱导成胰岛小岛样细胞团，该细胞可表达胰岛以及胰岛β细胞的相关基因，将其移植入糖尿病老鼠模型，可以大大降低血糖水平，有效改善老鼠体重减轻的症状，并没有移植排斥反应发生，表明hUCMSCs能分化为成熟的胰岛β样细胞，在Ⅱ型糖尿病中可作为胰岛β细胞替代治疗的理想来源。 研究发现，hUCMSCs可向人乳腺癌细胞（MDA231）迁移，肿瘤细胞分泌的化学增活素SDF-1、VEGF等能刺激hUCMSCs向肿瘤细胞迁移，由此可知，hUCMSCs可作为肿瘤药物载体做靶向治疗。研究还表明，hUCMSCs通过下调细胞凋亡相关的信号转导通路AKt和MAPK，以刺激内在凋亡通路，从而减轻肿瘤细胞的负荷。

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4.5 hUCMSCs与生殖系统疾病和肝脏疾病

hUCMSCs在精原细胞的培养条件下进行诱导培养可使其由成纤维细胞形变为圆形，并有少数圆形的细胞分化呈蝌蚪状，而且能表达精原细胞的特征性标记CD117和CD49f，证实了hUCMSCs具有向精原细胞分化的潜能，这就有可能为男性不育患者提供了干细胞来源和新的治疗途径。

研究显示，利用肝细胞生长因子诱导hUCMSCs向肝细胞分化，分化的细胞表达肝细胞表面标记物CK18、CK19、ALB和AFP，糖原PAS染色呈现阳性，说明了诱导后的细胞具有干细胞的性质。目前研究表明，hUCMSCs在体外、体内均可诱导成肝样细胞，为临床上治疗急性肝衰竭、慢性终末期肝病提供了新思路。 4.6 hUCMSCs与免疫系统疾病

MSCs对免疫系统的调节主要涉及T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。MSCs通过抑制细胞的分裂来抑制T淋巴细胞的增殖。研究表明MSCs通过减少间充质相关抗原CD1a、CD86、HLA-DR 的表达来抑制单核细胞向DC的分化，从而调节免疫功能。MSCs作为一种新兴的干细胞，具有重要的免疫调节功能，为异基因造血干细胞移植和自身免疫性疾病的治疗开辟新道路。 5 前景及展望

研究表明，hUCMSCs将成为自体与同种异基因移植的理想细胞来源。由于hUCMSCs的生物学特性、多向分化潜能、不表达或低表达免疫排斥相关的标记等特点，使其在临床再生医学方面的研究应用取得了较好的结果，同时也被看作细胞治疗的理想靶细胞。

但是，目前关于hUCMSCs在治疗应用方面的研究仅限于临床试验，对hUCMSCs在临床上的应用还需要大量的试验及临床研究，才能从理论和技术上证实它对各种疾病的治疗潜能。此外，进一步阐明hUCMSCs的生物学特点，冷冻/溶解技术以控制其生长和诱导定向分化，对hUCMSCs长期传代后有无恶变倾向，恶变的检测控制以及在扩增分化方面达成共识，这些对于hUCMSCs移植治疗的应用十分重要。 参考文献

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[6] 高连如，张宁坤，陈宇，等.脐带华通胶来源的间充质干细胞在心力衰竭细胞移植治疗中的应用[P].中国组织工程研究与临床康复，101690731A，2010-04-07.