夏枯草中熊果酸含量的UPLC测定

夏枯草中熊果酸含量的UPLC测定

作者：谢文剑 曹艺 柏玉冰等

来源：《中国当代医药》2014年第28期

[摘要] 目的 建立夏枯草药材中熊果酸含量的超高效液相色谱法（UPLC）测定方法。 方法 采用UPLC进行测定，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.5%冰乙酸水为流动相进行等度洗脱，流速为0.3 ml/min，柱温30℃，检测波长210 nm。 结果 熊果酸在0.2461～0.4922 mg范围内呈良好的线性关系（r2=0.9999），平均回收率为99.29%，RSD=1.74%，熊果酸在夏枯草中的含量为0.28%～0.53%。 结论 该方法快速、高效、重现性好，可以为夏枯草药材的质量控制提供更有效的手段。 [关键词] 夏枯草；熊果酸；超高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（a）-0011-03 夏枯草为唇形科植物夏枯草（Prunella vulgaris L.）的干燥成熟果穗，味辛、苦，性寒，具有清肝泻火、明目、散结消肿之功效[1]。夏枯草的主要化学成分有三萜、黄酮、甾体、香豆素、蒽醌、苯丙素等[2]。其中的主要成分熊果酸具有镇静、抗溃疡、降低血糖、抗炎、抗菌等多种生物学效应[3-5]。近年来，又发现熊果酸具有抑制癌细胞增长、转移和诱导癌细胞凋亡等作用，极有可能成为一种新型抗癌药物[6-8]。另外，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，被广泛用作医药和化妆品原料[9]。

目前关于夏枯草药材的质量控制研究主要是以熊果酸、齐墩果酸和迷迭香酸等的HPLC含量测定和夏枯草药材的HPLC指纹图谱为主[10-14]，关于夏枯草超高效液相色谱法（UPLC）含量测定的研究还未有报道，且相比于传统的HPLC而言，UPLC具有柱效高、分离度好和分离快等优点，大大缩短了样品运行的时间，可以满足当下高通量分析的要求。因此，本实验采用UPLC建立夏枯草药材中熊果酸含量测定方法[15]，测定不同批次的夏枯草药材中熊果酸的含量，该方法灵敏度高，分离度好，重现性好，可以为夏枯草药材的质量控制提供更有效的手段。

1 实验材料 1.1 仪器

SK3300H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），T-214型电子分析天平（Denver公司），Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统、Empower工作站、四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters 公司）。 1.2 试剂

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甲醇（色谱纯，Sigma公司），冰乙酸（色谱纯，天津市化学试剂研究所），水为怡宝纯净水。对照品熊果酸为本课题组自制，纯度>98%。 1.3 材料

15份夏枯草样品均由广州白云山星群（药业）股份有限公司提供，经中药鉴定教研室龚力民老师鉴定为唇形科植物夏枯草。 2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.5%冰乙酸水（80∶20）为流动相系统进行等度洗脱，检测波长为210 nm，流速0.3 ml/min，柱温30℃，进样量1 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取熊果酸对照品10.70 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇10 ml定容至刻度，密塞，摇匀，即得（每毫升对照品溶液含熊果酸1.07 mg）。 2.3 供试品溶液的制备

称取夏枯草粉末约1.0 g，精密称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10 ml，密塞超声30 min，放冷至室温，用甲醇补足重量，摇匀，0.22 μl微孔滤膜滤过，即得。 2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液0.2、0.25、0.35、0.4、0.5 ml，分别置于1 ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。分别取对照品溶液1 μl注入UPLC色谱仪，按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值，以对照品峰面积积分值为纵坐标，对照品含量为横坐标绘制标准曲线。计算熊果酸的回归方程：Y=1.10×106X+6.93×104（r2=0.9997），线性范围0.2461～0.4922 mg。 2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验 取同一对照品溶液，重复进样6次，进样体积1 μl，按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值，计算峰面积的RSD=1.47%，表明本方法精密度良好，符合方法学考察要求。

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2.5.2 稳定性试验 取同一对照品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，进样体积1 μl，按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值，计算24 h内峰面积的RSD=1.62%，表明熊果酸在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批夏枯草样品6份，每份约1.0 g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备。取1 μl注入UPLC色谱仪，在上述色谱条件下测定熊果酸峰面积积分值，计算熊果酸峰面积的RSD=1.54%，表明熊果酸重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 取已知熊果酸含量的夏枯草粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入熊果酸对照品适量，按上述供试品溶液制备方法制备。分别取样品供试液1 μl注入UPLC色谱仪，测定熊果酸峰面积积分值，计算平均回收率为99.29%，RSD=1.74%，表明本方法加样回收率良好（表1）。 2.6 含量测定

取不同批次的夏枯草样品，每份约1.0 g，精密称定，按上述供试品溶液制备方法制备。分别取样品供试液1 μl注入UPLC色谱仪，测定熊果酸峰面积积分值，计算15份供试品溶液中熊果酸的含量（表2），对照品及样品色谱图见图1。 3 讨论

本实验考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂，基于熊果酸峰面积确定了甲醇为提取溶剂。分别考察了10、15、20、25、30 ml五个体积，结果表明，提取溶剂体积为15 ml时，提取夏枯草样品中熊果酸的效率最佳。比较超声与回流两种提取方法，超声提取的效率要高于回流提取的提取率，故选择超声提取。分别考察不同超声时间15、30、45、60 min，确定超声时间为45 min。

对夏枯草中化学成分研究表明，其所含的三萜酸类成分主要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体，结构极为相似，仅在C19和C20上有一个甲基位置的差异，给分离带来一定难度，且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系，紫外吸收波长较短。在210 nm处，熊果酸的吸收峰灵敏度较高，其他色谱峰的干扰较小，分离最为理想，故选择检测波长为210 nm，测定熊果酸的含量。

不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的差别较大，这可能是由于不同采集地点生长环境的不同，药材的生长年限、采收季节、原产地加工也均存在差异。因此，应注意有效成分含量的差别，严格规定夏枯草药材的生长期、采收期，以保证临床用药的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量测定方法快速、准确，与传统的HPLC测定方法相比，样品的运行时间大大缩短，峰形与分离度均较好。 [参考文献]

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（收稿日期：2014-07-11 本文编辑：林利利）