铁皮石斛的组织培养

铁皮石斛的组织培养

作者：黄子聪

来源：《农家科技下旬刊》2014年第09期

摘 要：铁皮石斛是兰科石斛属多年生附生草本植物，为传统名贵中药。由于对生境要求十分苛刻，加之人为过分采收，现已濒临灭绝，已被列为“濒危珍稀植物”。对铁皮石斛的组织培养及人工栽培进行研究，实现保护野生铁皮石斛资源的同时满足人们的消费需求，具有重要的现实意义。

关键词：铁皮石斛；组培快繁 一、铁皮石斛组培培养 （一） 材料与方法 1.供试材料

供试材料：果荚：从浙江省购买回来的组培苗，栽种于温室大棚中，选择品质纯正的、生长健壮的铁皮石斛单株进行授粉，获得果荚。

茎段：从浙江省购买回来的组培苗，栽种于温室大棚中，选择品质纯正的、生长健壮的、二年生的、具有20厘米以上的铁皮石斛，自上而下剪下15厘米左右，带回实验室，备用。 2.方法 （1） 消毒方法

果荚的消毒方法：将生长了5个月的果荚用消毒的剪刀从植株上剪下，带到超净工作台下，用75%的酒精浸泡2分钟，然后用灭菌去离子水清洗两次，放在灭菌的空瓶中。播种前，将要切开的部位及花朵着生位置在酒精灯下稍微过火，然后再将基切开，播种。 （2）种子无菌播种

将灭菌的果荚在果荚蒂附近的位置上用灭菌的手术刀切开一个约1.5厘米的切口，然后直接将种子均匀地撒在培养基上。放在培养架上进行光照培养。 培养基配方：Z0：MS+NAA0.1mg/L+土豆汁100g/L （3）原球茎的增殖及分化

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将转绿的原球茎转接到增殖分化培养基上，每瓶接种6个点，每个点5个原球茎，5瓶一个重复，设3次重复。

茎段的消毒方法：选取茎段特征明显的铁皮石斛单株，用消毒的剪刀从节间靠下的位置将优选单株剪下，然后将叶片摘除，在自来水下将表面的灰尘洗去。接下来将茎段上的叶鞘撕掉，特别是底部与节相连接的位置要去干净，同时注意不要伤到休眠芽，再用洗洁精进行表面清洗，在自来水下将洗洁精清洗干净，带到超净工作台下，用75%酒精浸泡两分钟，期间不断地搅拌，再用灭菌去离子水清洗2两，切成每段3-5节，用0.1%升汞（加吐温20 2滴）浸泡9分钟，期间不断地搅拌，倒去升汞溶液，再用灭菌去离子水清洗6次，每次2分钟。 将灭菌的茎段切成每节一段，每段约1厘米长，然后依据休眠芽朝上接入诱导培养基中，每瓶4块。10瓶为一个重复，设3个重复。 培养基配方：

诱导率（%）=侧芽萌发数/接种茎段数×100% （4）培养条件

光照强度为2000 lux，光照时间每天12小时，温度为24℃±2℃ （5）统计分析

统计分析用Excel软件进行。 （二） 结果与分析 1.种子途径

（1）铁皮石斛种子萌发过程

将铁皮石斛灭菌的果荚切开一个1.5厘米的开口，直接播种在Z0培养基上，放在光照强度2000lux，温度24℃±2℃的条件下进行培养，一个星期后，淡黄色的种子开始慢慢转淡黄绿色，一个月左右生长成绿色的小点，两个月左右，绿色小点就膨大成圆球状，极少数长出小叶子。四个月后开始有分化出完整的小植株。

实验中，有两种成熟度的果荚，一种是5个月左右的果荚，一种是4个月左右的果荚，这两种成熟度的果荚在Z0培养基上的萌发情况明显的不同，5个月左右成熟度的果荚里面的种子全部萌发，而且4个月左右成熟度的果荚里面的种子完全不萌发。 （2）铁皮石斛种子的增殖及分化

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将萌发的种子接种到不同的培养基进行培养，其结果见表2.1，从表2.1可知，在未添加NAA的培养基上，铁皮石斛的种子增殖过程中芽的白化问题相当严重，白化率达到了37.38%，添加NAA及椰子汁可以有效地降低铁皮石斛种子的白化问题，在本试验中，铁皮石斛种子在Z2培养基上进行增殖培养过程中，其白化率最低，只有1.33%。

从表2.1中可以看出基本培养基中添加成分对铁皮石斛种子的增殖的影响，培养基中添加0.1mg/L NAA、30g/L土豆汁和70g/L香蕉汁对铁皮石斛种子的增殖作用非常明显，增殖率达到102.67%，而添加2ml/L极可善则对铁皮石斛种子的增殖起到负的作用，使其增殖率反降了约2.5%。从培养基Z1与Z2比较来看，香蕉汁对铁皮石斛种子的增殖作用要明显地大于椰子汁的作用。培养基中无NAA时，铁皮石斛种子的增殖率最低，只有59.11%。

研究基本培养基中添加成分对铁皮石斛种子的分化的影响，从表2.1中可以看出，添加极可善可以促进铁皮石斛种子的分化，在Z4培养基上，铁皮石斛种子的分化率达到最高，是130.44%。对比培养基Z1与Z2，可以看出香蕉汁对于促进铁皮石斛种子分化的作用要大于添加椰子汁。试验中，分化率最低的是Z2培养基，分化率为70.00%。 2.茎段途径

（1）茎段诱导侧芽的生长过程

将灭菌的铁皮石斛茎段切成每段1.5厘米长的带节的小段，接种到诱导培养基上，1星期左右，茎段的芽点上就开始突起，3个星期左右就可以长出小芽，40天左右，小芽可以长到1.5厘米长。

（2）侧芽的诱导

从表2.6中可以看出，除D4、D5配方外，其它配方均获得90%以上的侧芽诱导率，其中D7和D9的诱导率最高为97.5%，其次是D2和D3，其诱导率为96.67%，在实验中发现，添加有机附加物不仅没有取得更高的诱导率，且还影响到对污染的观察，添加Vc的作用好于添加GA3，而添加6-BA4 mg/L和2 mg/L的诱导率一样，综合各因素，选择D7培养基作用铁皮石斛茎段侧芽诱导的最佳培养基。

3.不同培养配方对铁皮石斛茎段侧芽诱导的影响 二、结语

组培快繁技术是铁皮石斛产业化技术的关键技术之一。本试验从铁皮石斛种子和优选单株茎段两类试验材料出发，研究了铁皮石斛的组织快繁特性，铁皮石斛5个月成熟度的种子播种在MS+NAA0.1mg/L+土豆汁100g/L培养基上，四个月左右就开始分化出完整的小植株；将原球茎转接到MS+NAA0.1mg/L+土豆汁30g/L+香蕉汁70g/L培养基上，增殖率达到102.67%，分化率达到117.11%，添加极可善这种物质可以增加分化率，但是降低增殖率；壮苗的试验表

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明，同时考虑工厂化生产的经济性，培养基MS+6-BA0.1 mg/L +NAA0.4 mg/L +香蕉汁70g/L+土豆汁30g/L是比较合适的壮苗配方。

铁皮石斛茎段诱导丛生芽途径，侧芽最佳的诱导培养基是MS+6-BA2 mg/L +NAA0.1 mg/L+ Vc 20 mg/L，其诱导率达到97.5%.