花芸豆铁蛋白的分离纯化

２０１５年９月　中国粮油学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　Ｏｉｌｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｖ０１．３０．Ｎｏ．９　Ｓｅｐ．２０１５　第３Ｏ卷第９期　花芸豆铁蛋白的分离纯化　田童童　江　英　张　建　王由美　魏永辉　张月茹　杨金月　（石河子大学食品学院，石河子摘要８３２０００）　为了从花芸豆中获取纯化的植物铁蛋白，试验利用盐析及柱层析对花芸豆中的铁蛋白进行分离　纯化。研究表明，铁蛋白提取的最佳工艺条件为：提取温度５３．７９　ｑＣ，样液ｐＨ值为７．２３，氯化镁浓度５１１．１５　ｍｍｏｌ／Ｌ．柠檬酸三钠浓度为６８５．２４　ｍｍｏｌ／Ｌ。该条件下模型预测花芸豆中铁蛋白的含量为４．４０　ｍｇ／ｇ，实际试　验值为（４．２７±０．０９）ｍｇ／ｇ。经ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ阴离子交换柱和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ一５００分子筛柱纯化　得到的电泳纯铁蛋白的相对分子质量为５６０　０００，且只含有１种亚基，其相对分子质量为２７　０００。通过Ｗｅｓｔｅｒｎ　—Ｂｌｏｔ法对纯化所得的花芸豆蛋白质进行试验验证，结果确定该蛋白质为铁蛋白。　关键词花芸豆铁蛋白　分离　纯化　中图分类号：Ｑ５１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—０１７４（２０１５）０９—００３０—０６　网络出版时间：２０１５—０６一Ｏｌ　１７：３８　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／１１．２８６４．ＴＳ．２０１５０６０１．１７３８．００１．ｈｔｍｌ　铁蛋白具有调节铁代谢平衡和解除亚铁离子毒　性的双重功效。从细菌到植物再到人的铁蛋白，其　结构非常保守¨Ｉ２　Ｊ。铁蛋白是由２４个亚基组成的中　空球状分子，每２个亚基反向平行形成１组，再由这　尤其丰富¨　。花芸豆蛋白是一种优质蛋白质，其氨　基酸谱与ＦＡＯ建议的理想蛋白质必需氨基酸模式谱　比较，除甲硫氨酸外，其余均高出２２％～６３％，其中赖　氨酸高出３１％～４７％¨　。　因此，本试验以花芸豆为研究对象，在单因素试　验的基础上，利用响应面分析法优化铁蛋白的提取　工艺，且采用层析法对其进一步纯化，以期为植物铁　蛋白的开发利用提供参考。　ｌ２组亚基对构成１个近似正八面体，成４—３—２倍　轴对称。１个铁蛋白分子中可贮存４　５００个无机三　价铁化合物。脊椎动物铁蛋白分子中存在重链和轻　链２种类型亚基，每个亚基都由１个４　０ｌ螺旋簇和１　个短螺旋簇构成，其中重链型亚基包括１个亚铁氧　化红心，能够快速氧化亚铁离子　Ｊ。　植物铁蛋白被认为是２１世纪新型的补铁功能　因子　。在已经发现的植物中，只有豆科类植物是　将其近９０％的铁储藏于种子的铁蛋白中　。铁是生　１　材料与方法　１．１　材料、试剂与仪器　花芸豆：石河子市农贸市场；丙烯酰胺（Ａｃｒ）、甲　叉双丙烯酰胺（Ｂｉｓ）、考马斯亮蓝Ｒ一２５０、十二烷基　硫酸钠（ＳＤＳ）和四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）：美国Ｓｉｇｍａ　公司。　ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ一５００：美国ＧＥ—　物体生存所必需的矿物质元素　。据世界卫生组织　２００５年统计数据表明，全球大约有３５亿人缺铁。天　然的铁蛋白具有贮藏大量的铁和调节细胞内铁的动　态平衡的双重作用。它可以形成血红素、铁硫原子　簇，这使得其在呼吸作用、氮的固定等生理代谢过程　中起着举足轻重的作用Ｅ９　。　花芸豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌｉｎｎ．ｓｐ）属豆科菜豆　属一年生草本植物，其生物学名叫菜豆，其中铁含量　基金项目：新疆生产建设兵团科技支疆专项计划（２０１０ＺＪ１３），石　河子大学创新团队（２０１１ＺＲＫＸＴＤ一０８０３），石河子大　学青年骨干教师培训（３　１５２ＳＰＸＹ０１０２７）　收稿日期：２０１４—０９—１５　作者简介：田童童，男，１９９０年出生，硕士，食品生物化学　通讯作者：张建，男，１９７９年出生，副教授，食品生物化学　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏ—Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＡＢ公司；ＰＶＤＦ膜：美国ｍｉｌｌｉ－　ｐｏｒｅ公司；Ｍｉｎｉ—ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍ：美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司。　１．２　方法　１．２．１花芸豆粗蛋白的制备　称取１　ｋｇ花芸豆浸泡于４℃双蒸水中处理　２４　ｈ。去皮后倾倒于２倍体积的ＰＢＳ（０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４一Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ　７．０，１％ＰＶＰ）中，３０　ｍｉｎ后　匀浆２　ｍｉｎ，过滤。清液于５５℃下水浴１０　ｍｉｎ，冷　却至室温，于３　５００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ，上清液即为粗　第３０卷第９期　田童童等花芸豆铁蛋白的分离纯化　３１　提液　。　Ｃｈａｌｋｌｅｙ等＿１　８】、报道的方法进行试验。样品分子质量　１．２．２粗提液的盐析　的确定根据标准蛋白Ｍａｒｋｅｒ的相对迁移率计算　在粗提液中加入ＭｇＣ１　晶体使其终物质的量浓　获得。　度为５００　ｍｍｏｌ／Ｌ，静置２０　ｍｉｎ后加入柠檬酸三钠晶　１．２．７蛋白免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ）　体使其终物质的量浓度为７００　ｍｍｏｌ／Ｌ，然后于４℃　１．２．７．１　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳　下静置过夜。在１２　０００　ｒ／ｍｉｎ，４　ｏＣ下离心３０　ｍｉｎ，此　将纯化后的蛋白质参照１．２．６部分电泳。　时的花芸豆铁蛋白不再溶于上清液。加入２倍体积　１．２．７．２　电转移　上清液，离心１０　ｍｉｎ，弃上清，重复３～４次直至只有　将１．２．７．１获得的电泳胶裁剪成适当大小，从　褐色沉淀。将沉淀溶于２倍体积蒸馏水中，离心３０　上往下黑面、纤维板、滤纸、电泳胶、ＰＶＤＦ膜、滤纸、　ｍｉｎ，弃上清。重复２次用５倍体积蒸馏水溶解沉淀，　纤维板、白面依次放好，置于电泳槽中，于４℃条件　离心３０　ｍｉｎ，合并上清液。花芸豆铁蛋白盐析后的　下（１００　ｍＶ，３　ｈ）转膜。　溶液用ｐＨ　７．５的ＰＢＳ缓冲液进行透析，透析液经抽　１．２．７．３曝光显影　滤后进行弱阴离子交换柱层析。　将１．２．７．２得到的电泳条带切成合适大小，用　１．２．３柱层析　丽春红染色０．５～１　ｍｉｎ，依次用水、电转液、水和　１．２．３．１阴离子交换柱层析　ＴＢＳＴ冲洗干净；用含２．５／１００（ｍ／Ｖ）无抗乳粉的　用ＰＢＳ（ｐＨ　７．５）平衡ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ后，将样液上柱（１．６　ｅｍ×２５　ｅｍ），用４倍体积　ＴＢＳＴ室温下封闭２　ｈ；加入一抗后置于４℃冷藏柜中　过夜，然后用ＴＢＳＴ冲洗干净后；加入二抗后置于　ＰＢＳ洗脱，再用含０～０．８　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１的６００　ｍＬ　ＰＢＳ　４℃冷藏柜中过夜，仍然用ＴＢＳＴ冲洗干净，然后用　进行梯度洗脱，流速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ，每管５　ｍＬ，分管　纯水洗去ＴＢＳＴ；膜与底物放映５　ｍｉｎ后直接放与暗　收集。将具有铁蛋白活性的收集液超滤浓缩到５　匣黑暗操作；曝光３　ｍｉｎ、显影液中漂洗３　ｒａｉｎ、定影　ｍＬ，以待进一步纯化。　液中漂洗１～３　ｍｉｎ。　１．２．３．２凝胶过滤柱层析　用含有０．１５　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１的ＰＢＳ平衡Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ一５００，待上柱（１．６　ｃｍ×５０　ｃｍ）后，再用含有０．１５　２　结果与分析　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１的ＰＢＳ洗脱，流速为０．５　ｍＬ／ｍｉｎ，每管５　２．１　花芸豆铁蛋白提取条件的优化　ｍＬ，分管收集。　试验通过对可能影响花芸豆铁蛋白提取的４个　１．２．４　Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ试剂法测定Ｆｅ浓度　因素（浸提液ｐＨ值、氯化镁物质的量浓度、柠檬酸三　用微量移液器取２０　Ｌ待测溶液，加入２５０　ＩｘＬ　钠物质的量和提取温度）进行详细的单因素试验分　３０％ＴＣＡ，再加入超纯水使总体积达到１　ｍＬ。再于　析，结果表明，在浸提液的ｐＨ值７．０，氯化镁物质　１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１　ｍｉｎ。取７００　ＩｘＬ上清液于新离　的量浓度５００　ｍｍｏＬ／Ｌ，柠檬酸三钠物质的量浓度　心管中，依次向其中加入１００　Ｌ饱和乙酸铵，６２．５　７００　ｍｍｏｌ／Ｌ及加热温度５５℃的条件下花芸豆铁蛋　ＩｘＬ　０．１２　ｍｏＬ／Ｌ抗坏血酸，６２．５　ＩｘＬ　０．２５　ｍｏｌ／Ｌ　Ｆｅｒ—　白含量为（３．８９±０．０７）ｍｇ／ｇ。　ｒｏｚｉｎｅ，最后加入超纯水使总体积达到１　ｍＬ。４　ｈ后，　在单因素结果的基础上，为了得到花芸豆铁蛋　在５６２　ｎｍ下比色，得到吸光值Ａ　，即可用于表示　白提取的最优工艺参数，利用响应面分析法对铁蛋　白的提取做了进一步的优化。响应面分析因素水平　铁含量（　ｇ／ｄＬ）　。　编码如表１所示，试验结果如表２所示，方差分析结　１．２．５　Ｎａｔｉｖｅ—ＰＡＧＥ检测蛋白质分子纯度　用样品缓冲液以１：２（　）的比例稀释样品，样　果如表３所示。　表１　盐析法提取铁蛋白响应面分析因素水平编码表　品缓冲溶液中含有２５％甘油，１２．５％ｐＨ　６．８，０．５　ｍｏＬ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，１％澡酚蓝，充分混合后参照Ｌａｅ－　ｍｍｌｉ方法进行Ｎａｔｉｖｅ—ＰＡＧＥ＿】　。电泳结束后用考　马斯亮蓝Ｇ一２５０染色法进行染色　。　１．２．６　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测蛋白质亚基纯度　聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）参照　３２　表２中心组合设计试验结果　中国粮油学报　。２０１５年第９期　时为差异极显著　引。表３中显示模型的Ｐ＜　表３方差分析结果　当Ｐ＜０．０５时，影响因素对响应值影响为差异　显著，当Ｐ＜０．００１时为差异高度显著，Ｐ＜０．０００　ｌ　０．０００　１，说明试验模型具有高度的显著性，失拟项的　Ｐ＝０．４３８　４＞０．０５，不显著，表明响应面设计的模型　与实际试验拟合良好，模型的相关系数Ｒ　＝　９３．８６％，更加说明该模型的可信度较高。由表３可　知，　的Ｐ＝０．００８　３＜０．０５，表明ｐＨ值起着显著性　的影响；　】的Ｐ＝０．０２５　１＜０．０５，与　２相比不是很　显著，说明温度的影响次于ｐＨ值。各个因素经过回　归拟合后，经解得到的铁蛋白提取量的回归方程为：　Ｙ＝４．３６—０．１８Ｘｌ＋０．２２　十０．１２Ｘ３—０．０８墨一　０．３Ｘ】　一０．１Ｘ】蜀＋０＿０８ＸＩ　一０．１　墨＋０．０２６Ｘ３　一　０．１３　五＋０．ｏ２６ｘ￣蜀一０．５６Ｘ１　一０．６６　一０．５３Ｘ３　一　０．４３Ｘ４　通过软件求解方程，得出最优工艺条件为温度　５３．７９℃、ｐＨ为７．２３、氯化镁物质的量浓度为　５１１．１５　ｍｍｏｌ／Ｌ、柠檬酸三钠物质的量浓度６８５．２４　ｍｍｏｌ／Ｌ，此时铁蛋白达到４．４０　ｍｇ／ｇ。为检验模型的　可靠性，课题组做了验证试验，结果显示铁蛋白提取　率为（４．２７±０．０９）ｍｇ／ｇ，与理论预测值基本吻合。　响应面分析方法的图形是特定的响应面（１，）与　对应的因素置、　、　、墨构成的１个三维空间在二　维平面上的等高图，每个响应面对其中２个因素进　行分析，另外２个因素固定在零水平。从中可以直　观地反映各因素对响应值的影响，从试验所得的响　应面分析图上可以找到它们在提取过程中的相互作　用，花芸豆铁蛋白提取回归优化响应曲面如图１所　示。　，　由图１可知，温度、ｐＨ值、氯化镁浓度和柠檬酸　三钠浓度４个因素之间相互作用对花芸豆铁蛋白含　量均呈现出显著的二次效应。结合方差分析表３中　二次项的Ｐ值均小于０．０１，表明各个因素之间的交　互作用极显著。从图１ａ中可知温度与ｐＨ值对铁　蛋白含量的影响曲面较陡，说明温度与ｐＨ值的交　互影响显著，ｐＨ和柠檬酸三钠的交互影响仅次于　温度与ｐＨ，如图１ｅ所示。由图１ｂ和图１ｄ及方差　分析表３可知，温度与氯化镁及ｐＨ值与氯化镁之　间的交互作用程度是相同的。由图１ｃ和图１ｆ可　知，温度与柠檬酸三钠浓度及氯化镁和柠檬酸三钠　浓度之间的交互影响作用最小。综上所述，影响花　芸豆铁蛋白提取的各个因素之间既有相互促进的　效果，又有相互制约的作用，说明在分离提取花芸　豆铁蛋白时，要细致全面的考虑各因素之间的影响　作用，要做到利用促进作用避免抑制作用，进而达　到最佳的提取效果。　第３Ｏ卷第９期　田童童等花芸豆铁蛋白的分离纯化　３５　［６］云少君，赵广华．植物铁代谢及植物铁蛋白结构与功能　［１３］卿晓红，熊绿芸．芸豆不同品种的营养成分分析［Ｊ］．贵　研究进展［Ｊ］．生命科学，２０１２，２４：８０９—８１６　州农学院学报，１９９６，１５（２）：５９—６１　［７］Ａｍｂｅ　Ｓ，Ａｍｂｅ　Ｆ，Ｎｏｚｕｋｉ　Ｔ．Ｍｏｓｓｂａｕｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆｉｒｏｎ　ｉｎ　ｓｏｙ—　［１４］Ｌａｕｌｈｅｒｅ　Ｊ　Ｐ，Ｌａｂｏｕｒｅ　Ａ　Ｍ，Ｂｒｉａｔ　Ｊ　Ｆ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅａｎ　ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｔｏ　ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｉｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　１９８７，３５（３）：２９２—２９６　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，２６４（６）：３６２９—３６３５　［８］Ｚｈａｏ　Ｇ　Ｈ．Ｐｈｙｔｏｆｅｒｒｉｔｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｈｅａｌｔｈ　［１５］Ｃａ￣ｅｒ　Ｐ．Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｉｒｏｎ　ａｔ　ａｎｄ　ｎｕｔｉｒｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ：Ｇｅｎｅｒａｌ　ｔｈｅ　ｓｕｂｍｉｃｒｏｇｒａｍ　ｌｅｖｅｌ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｅｗ　ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ）［Ｊ］．　Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，２０１０，１８００（８）：８１５—８２３　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ，１９７１，４０（２）：４５０—４５８　［９］Ｇｒａｄｙ　Ｊ　Ｋ，Ｃｈｅｎ　Ｙ，Ｃｈａｓｔｅｅｎ　Ｎ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　［１６］Ｃｈａｌｋｌｅｙ　Ｒ　Ｊ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　Ａ　Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧｌｃＮＡｃｙｌａ－　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｒｏｎ　ｉｎ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ［Ｊ］．　ｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ａｌｐｈａ——ｃｒｙｓｔｌａｌｉｎ　ｕｓｉｎｇ　Ｑ——ＴＯＦ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，２６４（３４）：２０２２４—　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　２０２２９　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ，２００１，１２（１０）：１１０６—１１１３　［１０］Ｔｈｅｉｌ　Ｅ　Ｃ．Ｉｒｏｎ，Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ａｎｄ　Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　［１７］朱厚础．蛋白质纯化与鉴定指南［Ｍ］．北京：科学出版　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００４，２４：３２７—３４３　社，１９９９，２４９—２５９　ｆ１１］Ｄａｖｉｌａ—Ｈｉｃｋｓ　Ｐ，Ｔｈｅｉｌ　Ｅ　Ｃ，Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ　Ｂ．Ｉｒｏｎ　ｉｎ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　［１　８］Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ　Ｋ．Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓ－　ｏｒ　ｉｎ　ｓａｌｔｓ（Ｆｅ￣ｏｕｓ　Ｓｕｌｆａｔｅ）ｉｓ　ｅｑｕａｌｌｙ　ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ　ｉｎ　ｎｏｎ—　ｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，　ａｎｅｍｉｃ　ｗｏｍｅｎｌ　Ｊ　１．Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｕｔｒｉ—　２７７（５２５９）：６８０—６８５　ｔｉｏｎ，２００４，８０（４）：９３６—９４０　［１９］丁仲鹃，毕玉芬，戴云，等．中心组合试验设计响应面分　［１２］何照范．粮油籽粒品质及其分析［Ｍ］．北京：中国农业出　析法优化蜂胶总多酚提取工艺［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４　版社，１９８５　（２）：１７—２１．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｔｉａｎ　Ｔｏｎｇｔｏｎｇ　Ｊｉａｎｇ　Ｙｉｎｇ　Ｚｈａｎｇ　Ｊｉａｎ　Ｗａｎｇ　Ｙｏｕｍｅｉ　Ｗｅｉ　Ｙｏｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ　Ｙｕｅｒｕ　Ｙａｎｇ　Ｊｉｎｙｕｅ　（Ｆｏｏｄ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２０００）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｈｙｔｏｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒ￣，ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕ－　ｒｉｌｆｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓａｌｔｉｎｇ　ｏｕｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｙｉｅｌｄ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ（４．２７±０．０９）　ｍｇ／ｇ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｔｈａｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　５３．７９℃，ｓａｍｐｌｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｐＨ　７．２３，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｇＣ１２　５　１　１．１５　ｍｍｏｌ／Ｌ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　６８５．２４　ｍｍｏｌ／Ｌ．Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｌｅｖｅｌ，ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　５６０　０００，ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｏｎｌｙ　ｏｎｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　２７　０００．　Ｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓｌｙ，ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｅｌｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒ￣，ｆｅｒｒｉｔｉｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ