中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶

中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶

的抑制作用研究

鲍雅丹 马 林*

中山大学化学与化工学院有机化学研究所，广州 51027

摘要 本研究对从中药提取的有效成分及合成的一系列类似物进行了抑制乙酰胆碱酯酶的活性测试.发现具有苯环或共轭结构的化合物对乙酰胆碱酯酶有显著的抑制作用，特别是吲哚喹啉化合物19c的抑制效果最好(IC50=4.8μM)，可以作为治疗阿尔茨海默氏病的先导药物。

关键词 乙酰胆碱酯酶 抑制剂 IC50 动力学

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease, AD)是常见的一种中枢神经系统退行性病变，发病率较高。主要临床表现为记忆、智力和识别功能的不同程度的减退或丧失,目前临床上用于改善AD患者认知障碍的药物主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂。在大规模、多中心、双盲和安慰剂的对照试验中,这类化合物对AD病人认知能力及生活质量均有统计学显著改善。

美国Warner lamber 公司开发的他克林(tacrine)[1]是一种乙酰胆碱酯酶的非竞争性抑制剂,1993年经FDA批准上市, 成为第一个用于治疗AD的ACh E剂类药物。此后又有数种ACh E抑制剂经FDA批准上市或进入临床试验, 如Velnactine、Amiridine等。但它们均有不同程度的毒副作用, 这些毒副作用严重影响了它们在临床上的应用, 这使得有必要开发疗效高毒副作用更小的ACh E抑制剂。

NH2NH2OHNH2NTacrineNHClAmiridineNVelnatine

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, ACh E, EC3 . 1 . 1 . 7. )的主要生理功能为通过快速水解神经传递介质乙酰胆碱（ACh），中止胆碱能突触中的脉冲传递，故 ACh E又称乙酰胆碱水解酶 (acetylcholine hydrolase)[2]。

CH3COOCH2CH2N+(CH3)3+ACh E CH3CO-ACh E + HOCH2CH2N+ (CH3)3

CH3COO-+H++ACh E

*

基金项目：中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02002）资助 第一作者：鲍雅丹（1980年出生），女，中山大学化学与化工学院材料化学专业99级 指导教师：马林 Email：cesmal@zsu.edu.cn

为了筛选出高效、低毒的ACh E抑制剂，我们参考各种ACh E抑制剂的结构类型，研究了从中药山芝麻和筋骨草分离出的有效成分及其类似物对ACh E的抑制作用。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

乙酰胆碱酯酶 (Acetylcholinesterase,ACh E, EC3 .1.1.7.)、硫代乙酰胆碱 (Acetylthiocholine)、5, 5 -二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 ) (DTNB)购于Sigma公司；其它试剂为分析纯试剂，未经进一步纯化。主要测试仪器：UV-2501PC 型紫外光谱仪、Orion Model 720A型pH计、Gunt w28 恒温水浴锅。

1.2方法

1.2.1 抑制剂的制备：全合成化合物19 (a-j) 由本实验室周金林博士提供；化合物1-18由郭新东博士提供从中药山芝麻和筋骨草中分离的有效成分，结构如下：

OHOOOCH3HOOAcOOHOHHOOHOOOCH2OHOHHOOHHOHOOHO

1 2 3

OHO

COOCHCH2OOCPhHO3COOHOCOOCHCH2OOCPh3

HOO

AcO

4 5 6

COOHCH2OHOOOHHO OHOH HO7 8 9

OO OOOMeOOOOOO

OHO

OO

OHO

10 11 12 13 14

OHOCOOHOCOOHOHOHOOH

15 16 17 18 1.2.2 化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性测定

取5支1.5 mL分别装有840 L 0.1 M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液的梨型管，依次加入0，5，10，20，35，50 L 1.0 mM的样品DMSO溶液，并用DMSO补齐至总体积为890 L。分别加入50L 4 mg/mL 5, 5-二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 )和10L乙酰胆碱酯酶溶液（0.1mg/ml），并在37℃保温15 min。立即加入50μL2 mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在λ= 412 nm处的A值(An)。参比用0.1 M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液。以未加样品所测得的Acontrol值作为100个活力单位：

相对酶活力＝(An /Acontrol)×100

然后以酶的相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得各种化合物的IC50值（抑制酶活力50％时的抑制剂浓度）。

1.2.3 乙酰胆碱酯酶的抑制动力学测定

取5支1.5 mL分别装有840，855，865，880，885L 0.1 M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液的梨型管，加入一定量的样品溶液，并用DMSO补齐至总体积的5％。分别加入50L 4 mg/mL 5, 5 -二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 )和10 L乙酰胆碱酯酶溶液，并在37℃保温15 min。立即分别加入50，35，25，10，5 L2 mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在λ=412 nm处的时间扫描曲线。曲线的斜率即为反应的初速度[V]，然后以1/[V]对1/[S]作图，以不加抑制剂的为控制线。

2 结果与讨论

2.1 吲哚喹啉生物碱衍生物对ACh E的抑制活性

表1 吲哚喹啉衍生物对ACh E的抑制IC50值

HN(CH2)nXNR

Compound

X

n

R

pH=7

19a 19b 19c 19d 19e 19f 19g 19h

NH O NH O NH O NH O

2 2 3 3 2 2 2 2

N(CH3)2 N(CH3)2 N(CH3)2 N(CH3)2

NOIC50(M)

pH=8 42 89.5 41.5 68 29 22 30 76.5

38 73 4.8 57

23.7 20 21 53

NOOH OH

OXN

Compound

19i 19j

X NH O

n ---- ----

R ---- ----

IC50(M)

pH=7 46 58

pH=8 235 163

从他克林等化合物的结构可以看出，它是一种喹啉衍生物，具有三环结构，而我们所合成的吲哚喹啉衍生物在结构上与他可林有许多相似之处，为此我们研究了它们对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，结果见表1。

实验结果表明，吲哚喹啉类衍生物（19a-19j）对乙酰胆碱酯酶均有明显的抑制作用，化合物19c的抑制效果最好(IC50=4.8 M) 。五元环上X原子为NH的抑制效果比O好，原因是NH可增加环的共轭性，使四个环在一个平面上；而O使环面不在同一个平面上，增加了空间位阻，对酶的抑制作用降低。化合物19c比19a侧链上多了一个碳原子，抑制酶效果增强，说明碳链的长短对抑制活性起作用。另外，抑制剂侧链上有亲脂性的阳离子头能更好的被酶的作用位点吸附而较好地抑制酶的活性，化合物19b，19e的抑制活性都没有19c好可能是由于19b的羟基不易以正离子形式存在，而19e苯酚不是脂肪族侧链，且位阻较大，也没有阳离子头，较难产生抑制作用。此外，该系列化合物的pKa值都在8左右。pH＝7时化合物以盐的形式存在，环上的N带正电荷；pH=8时化合物没有成盐，不能很好抑制酶的活性。可以看到上表中所有化合物都在pH＝7的酸碱体系中有更好的抑制效果。

由以上讨论，我们可得出以下几个影响抑制剂抑制活性的因素： （1）分子中心存在一个吲哚喹啉的共轭环； （2）侧链上存在一个亲脂性阳离子头； （3）脂肪族侧链大于两个C原子； （4）合适的体系pH值。

2.2 中药有效成分（化合物1-18）对ACh E的活性抑制

由表2可以看出，五环三萜类化合物4、5、6和7具有较好的活性，与这些化合物的大分子结构有关，其中化合物5的抑制活性最好(IC50=13.2 M)，可能由于它的大分子结构容易和酶的活性部位结合。其次是化合物10整个分子形成了大共轭结构，具有很好的活性(IC50=23.8 M)。合成的醌类化合物和中间体对ACh E的抑制活性都比较差，或者是没有活性，或者是由于化合物分子太小，不能与乙酰胆碱酯酶发生结合，因而不能有效抑制酶的活性；而同样是萘醌结构的化合物具有较好的活性，可能是化合物12中含一个二氢呋喃环，使分子形成三环的平面结构，扩大了分子的面积能与乙酰胆碱酯酶内的多个位点作用，而有较好的活性；甾醇8和甾醇糖甙9没有共轭结构，对ACh E没有抑制作用。

表2 中药有效成分对ACh E抑制的IC50值

Compound

1 2 3 4 5 6 12 10 11

No表示没活性

IC50(M) 169.6 160.4 No 63.5 13.2 55.6 28.3 23.8 49.6

Compound

7 8 9 13 17 14 15 16 18

IC50(M) 77.8 No No 170.8 162.7 140.8 No No No

2.3 乙酰胆碱酯酶的抑制动力学研究

为了研究这些化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制动力学行为，我们选取了化合物19c、19f、19g、

19i、5、10、17和13进行实验。根据不同浓度的抑制剂和底物存在下所测得的数据绘制的Lineweaver-Burk曲线见图1。

1200010000900080001/V(1/Abs) 01/V(1/Abs)6000600040003000200000510152025-202468101214161820221/S(1/M) compound 19c[I]=0 M [I]=8.6M[I]=17.2 M1/S(1/M) compound 19g[I]=0 M [I]=21.7M[I]=32.5 M

140012001000800600400200 250020001/V (1/abs)15001000500-2002468101/V (1/abs)02468101/S (1/M) compound 10 [I]=0 M [I]=5.8 M [I]=15.4 M1/S (1/M) compound 5 [I]=0 M [I]=11.8 M [I]=15.4 M

图1 化合物与乙酰胆碱酯酶反应的Lineweaver-Burk图

数据表明化合物19g、19i、10对乙酰胆碱酯酶的抑制为混和型抑制剂；化合物19c、19f、

13、17为非竞争性抑制剂，与酶的调控部位结合；大分子化合物5为竞争性抑制剂进入酶的活性中心发生抑制作用。

以上的结果表明化合物19c的抑制效果最好（IC50=4.8M），可以作为先导化合物；而化合物5（IC50=13.2M）与目前临床用的抑制剂他克林（IC50=13.0M）具有类似的抑制效果；由于齐敦果酸型的五环三萜类化合物具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖以及治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒肝炎的作用[12]，我们可以将它作为具有多种功能的药物来开发。其次是具有苯环和共轭的萘醌类化合物12（IC50=28.3M）和10（IC50=23.8M）及吲哚喹啉衍生物，它们也有较好的抑制活性，可以将它们作为先导化合物，在分子中引入带正电荷基团如氨/胺基，增强分子与ACh E的作用，提高它们的抑制效果。

致谢 本研究是在马林教授，郭新东和周金林两位博士的悉心指导和帮助下完成的，他们对科学严谨的态度和孜孜不倦的精神使我受益菲浅，在此对他们表示衷心的感谢。同时还要感谢化工学院创新基金对本研究提供的资助。

参 考 文 献

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Studies on Inhibition for ACh E by Active Compounds

and Analogs in Chinese Traditional Medicine

Bao Yadan Ma Lin*

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Zhongshan University, Guangzhou 510275)

Abstract Chinese Traditional Medicine is increasingly a focus of attention as a potential source of new drugs. In our research , some compounds (separated and synthesized) were used to examine their anti-cholinesterase activity . The presence of aromatic ring and conjugate structure was found to have good cholinesterase inhibitory activity when tested for the inhibition of electric eel acetylcholinesteras. Among them , compound 19c showed the most potent inhibitory activity (IC50=4.8μM).

Keywords

acetylcholinesterase

,

inhibitor

,

IC50

,

dynamics