第25卷第2期 2006年文章编号4月 华中农业大学学报 VoL 25 No.2 Apr.2006,128 ̄131 Journal of Huazhong Agricultural University 1000—2421(2OO6)O2一O128一O4 湿地松猝倒病病原鉴定及其生物学特性的观察 陈京元 ’ 霍宪起。’ 蔡三山 ’ 徐红梅 ’ 涂俊杰 ’ 侯明生。’ 嵇保中" (”南京林业大学森林资源与环境学院,南京210037; 湖北省林业科学研究院,武汉430079; 华中农业大学植物科学技术学院,武汉430070 ̄ 湖北省荆门市彭场林场,荆门434100) 摘要根据病原菌致病性、生物学特性及形态学研究结果,鉴定湿地松猝倒病的病原菌为丝核菌属的立枯 丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn.)。该菌的生长温度为10 ̄35℃,以25 ̄30℃最适宜;病菌生长的pH值范围 是4~11,以pH 7~8最适宜;以蔗糖或麦芽糖为碳源,硝酸钾或硝酸钠为氮源的培养基,有利于菌丝生长;光照 对菌丝生长有利。 关键词湿地松;猝倒病;立枯丝核菌;生物学特性 S 763.15;S 791.246 文献标识码A 中图法分类号湿地松(Pin ̄s elliottii Engelm)又名美国松, 常规方法进行组织分离纯化获得纯培养菌,再按柯 国外松,原产于美国东南部,于2O世纪3O年代引人 赫氏法则(Koch S Postulate)接种,测定其致病 我国,迄今已有7O多年的栽培历史。因为湿地松具 性l6],将分离菌种保存在4℃冰箱中备用。 有生长速度快、树干通直、产脂量高、用途广、抗逆性 1.2病原菌的鉴定方法 及适应性强等优良品质,现已成为中国南方的重要 取出分离菌种,用挑针挑取少许菌丝,采用水载 造林树种之一[1]。但是,在我国南方地区湿地松育 法镜检记载并描述其菌丝和菌核的形态作为鉴定菌 苗期间常常发生幼苗猝倒病,使得松苗大量腐烂、倒 种的依据【6]。 伏并枯死,严重影响了苗木的正常生长。2004年5 1.3生物学特性的观察 月,湖北省松滋市的湿地松苗圃苗木猝倒病发生很 1)温度对菌丝生长的影响。取出分离菌活化培 严重,发病率高达72 ,造成了极大的经济损失。 养3 d,在PDA平板培养基上移人直径5 mm的菌 国外有关研究资料表明,苗木猝倒病是由丝核菌 苔,分别置于5℃、1O℃、15℃、2O℃、25℃、3O℃、 (Rhizoctonia spp.)、腐霉菌(Pythium spp.)、镰孢 35℃、4O℃下培养,每个处理5次重复,48 h后用十 菌(Fusarium spp.)、链格孢菌(Alternaria spp.)、 字交叉法测量菌落直径,取其平均值。 葡萄孢菌(Botrytis sp.)、盘多毛孢菌(Pestalotia 2)pH对菌丝生长的影响。用0.1 mol/I sp.)等属的多种真菌引起,且不同苗木的猝倒病的 NaOH和0.1 mol/I HCI在pH计(PH 25A,上 病原菌不尽相同[2 ]。笔者对湿地松猝倒病的致病 海理达仪器厂)下调节PDA培养基酸碱度,pH值 性病原物之一的生物学特性进行了观察与研究。 设置4,5,6,7,8,9,10,11共8个处理。每个处理设 1材料与方法 1.1供试病原菌来源 5次重复。取直径5 mm的分离菌菌苔接种到不同 pH值的PDA平板上,在25℃条件下培养48 h,用 十字交叉法测量菌落直径,取其平均值。 3)菌丝对碳源的利用。以查彼克培养基(Cza~ 从湖北省荆门市彭场林场湿地松苗圃中采集土 um;Sucrose 3O g,NaNOs2 g,K2 HP04 样,将湿地松种子播种于装有该土壤的塑料容器中, pek S medi g,KC1 0.5 g,MgSO4・7H2 O 0.5 g, 并置于27℃左右的人工气候箱(PYX-25OQA,广 ・3H2O l g,Agar 2O g,H2O 1 000 mI ) 东科力仪器厂)培养致病,然后在PDA培养基上用 FeSO4・7H2O 0.01收稿日期:2005—10—27;修回日期:2006-01-05 *国家林业局“948”项目(2003—4—39)和湖北省教育厅2004年科研项目(2004D001)资助 陈京元,男,1959年生,在职博士研究生,副研究员.工作单位:湖北省林业科学研究院,武汉430079 维普资讯 http://www.cqvip.com
第2期 陈京元等:湿地松猝倒病病原鉴定及其生物学特性的观察 129 为基础培养基【6],分别以相同含碳量的葡萄糖、蔗 发病率之高可能与立枯丝核菌产生大量毒素有 糖、可溶性淀粉、木糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖 关 】。后期在倒伏的松苗上可见无色丝状物。在发 配成含不同碳源的培养基,接直径5 mm分离菌菌 病松苗上可以重新分离到该病菌,重新分离的病菌 块后,于25℃条件下培养48 h后测量菌落直径,每 的培养性状、菌丝形态与所接种病菌相同。而对照 处理重复5次。观察菌丝对不同碳源的利用。 7 d的发病率仅1O ,在发病部位分离不到病原菌, 4)菌丝对氮源的利用。以查彼克培养基(Cza— 故判断为物理性倒伏【8 。 pek S medium;同上)为基础培养基,分别以相同含 2.2病原菌的鉴定 氮量的脲素、谷氨酸、氯化铵、硝酸钙、硝酸钾、硝酸 从发病松苗上分离得到的病菌,系统观察病菌 钠、硝酸铵、蛋白胨配成含不同氮源的培养基,接直 的有关特性和显微形态特征。病菌在PDA培养基 径5 mm分离菌菌块后,于25℃条件下培养48 h后 上生长速度较快,经5O多个小时菌丝布满培养皿 测量菌落直径,每处理重复5次。观察菌丝对不同 (直径90 mm),菌丝体棉絮状、蛛丝状,初无色、白 氮源的利用。 色,后渐变成不同程度褐色,褐色菌核以菌丝与基质 5)光照对菌丝生长的影响。在PDA平板上, 相连。 接人直径5 mm的分离菌菌块,用日光灯(18 W,距 幼嫩菌核位于内部成球形,不规则形,老熟菌核 离30 cm)作为光源,设连续光照、12 h光暗交替和 在培养皿中均位于外围,形状不规则,较紧密贴在培 连续黑暗3个处理,每个处理5次重复,于25℃下 养基上,表面粗糙,栗褐色或黑褐色,(O.5~6.4) 培养48 h后用十字交叉法测菌落直径,取平均值。 mmX(O.5~24)mm,菌丝初无色,多油点,后渐变 2结果与分析 为褐色,分枝与母枝呈锐角,分枝处稍有缢缩,离分 枝不远处有1个隔膜,直径约8~14 m。老菌丝褐 2.1病原菌的致病性 色,分枝与母枝呈直角,缢缩极为明显,部分菌丝膨 采集湿地松苗圃原作土壤,室内播种促生猝倒 大成酒坛状。 病的发生,并从发病松苗上分离得到致病菌,通过室 菌核由菌丝体纠结而成 内外颜色一致,表面细 内人工接种湿地松,结果表明人工接种松苗表现出 胞稍小,但与内部细胞无明显不同,菌核细胞形状不 的症状与自然条件下发病症状相同。接种2 d后松 规则,(7.25 ̄56.5) m×(4.43 ̄21.75) m,菌核 苗开始发病,在松苗茎基部出现褐色斑点,迅速扩大 上长有担子。不产生无性孢子(图1)。根据病原菌 呈水渍状腐烂,随后松苗倒伏,4 d后发病率达到 的培养性状和形态特征,可鉴定该病原菌为立枯丝 78 ,7 d后发病率达到92 。发病速度如此之快, 核菌(Rhizoctonia solani Kt ̄hn.)[n,12]。 图1 立枯丝核菌的形态特征 Fig.1 Morphological characteristics of Rhizoctonia soloni KOhn. 左:老熟的菌丝I ift:old hyphae右;幼嫩的菌丝Right:young and tender hyphae 维普资讯 http://www.cqvip.com
13O 华中农业大学学报 第25卷 2.3生物学特性的测定结果 与麦芽糖之间差异不显著,但蔗糖与除麦芽糖之外 1)温度对菌丝生长的影响。测定结果表明,菌 的各种碳源之间的差异均为显著。可见蔗糖和麦芽 且以蔗糖为最佳。 丝在10 ̄35℃均可生长,最适合生长的温度30℃, 糖最适宜于病菌生长,病原菌对氮源的利用研究结果表明,病原菌对 培养48 h菌落直径可达到53.4 mm。在同样的培 养时间内,10℃、15℃、20℃、25℃、35℃时的菌落 硝酸钾和硝酸钠的利用明显优于供试的其它氮源, 直径分别为2.8 mm、10.4 mm、38.5 mm、 其中在以硝酸钾为氮源的培养基上菌落扩展最快, h菌落直径达54.6 mm,其次为氯化铵、蛋 49.7 mm、29.4 mm。40℃时菌落原菌丝块在生长 培养48过程中,直径不扩展。低于5℃和高于40℃则完全 白胨、硝酸钙和硝酸铵,在以脲素为氮源的培养基上 不生长。 生长最慢(表2)。根据方差分析,硝酸钾和硝酸钠 2)pH值对菌丝生长的影响。测定结果表明, 之间差异不显著,氯化铵、蛋白胨、硝酸钙和硝酸铵 菌丝在pH 4~l1的PDA培养基上均能正常生长, 之间差异不显著,但无论是在P一0.01还是在 以pH 7~8时生长量最高,培养48 h菌落直径均在 P=0.05的显著性检验条件下,硝酸钾都是最适合 50 mm以上;其中以pH 8最适,培养48 h菌落直径 的氮源,脲素是最不适合的。 达50.5 mm,说明该菌在偏碱性条件下生长的更 表2不同氮源对菌丝生长的影响 好。在同样的培养时间内,pH值为4、5、6、7、9、10、 Table 2 Effects ofdifenmt nitrogen sDmn瞒on mycelial 们ruh ofJ己sohml 11时的菌落直径分别为32.6 mm、46.2 mm、 48.2 mm、50 mm、44.3 mm、34.4 mm、30.8 mm。 氮源 菌落直径/mm 生长速率 Nitrogen source Average diameter(mm/d) 酸性或碱性过强都不利于菌丝生长。 of colony Growth rate 3)病原菌对碳、氮源的利用。供试病菌对8种 碳源的利用试验结果表明,该菌在以蔗糖为碳源的 培养基上生长最快,培养48 h后菌落直径可达 56.3 mrrl;其次为麦芽糖,菌落直径达54.7 ro_rrl;然 后是甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、半乳糖。在 以木糖为碳源时生长速度最慢(表1)。根据方差分 析,P=0.05时,蔗糖、麦芽糖、甘露醇之间差异不显 著,淀粉、乳糖之间差异不显著,葡萄糖、半乳糖、木 4)光照对菌丝生长的影响。病原菌在PDA平 糖之间差异不显著,但蔗糖、麦芽糖与淀粉、乳糖、葡 板连续光照条件下菌丝生长最快,48 h菌落直径为 萄糖、半乳糖、木糖之间差异显著;P=0.01时,蔗糖 69.5 mm;其次为12 h光暗交替,48 h菌落直径 表1不同碳源对菌丝生长的影响¨ 68.3 mm;连续黑暗条件下生长最慢,48 h菌落直径 1 e 1 Eff&ts Ofdin咖t carbon蛐衄’O oil 64.8 mm。但各处理间差异不显著。 r ̄eelial growth 0f兄solani 3讨论 综合对湿地松猝倒病的致病性测定和形态学特 性研究结果,依据相关资料[11,12],鉴定立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)是引起湿地松猝倒病的主要病 原菌之一。 本试验结果表明,立枯丝核菌在5~40℃时都 能生长,但在40℃时只是在原菌块上生长,直径不 扩展,低于5℃或高于40℃菌落不生长。立枯丝核 1)/ix写字母为0.05显著水平,大写字母为0.01显著水平 菌在pH 4~11范围内均能生长,最适生长范围为 Diferent small letters mean significant at P=O.05 level, pH 7~8,本研究结果与前人报道的立枯丝核菌最 different capital letters mean at P=O.01 level 适宜在pH 5.8---8.1之间生长的研究结论有所差 (下表同the S ̄TIe asinthefollowingtable) 异[8 ̄10]。 维普资讯 http://www.cqvip.com
第2期 陈京元等:湿地松猝倒病病原鉴定及其生物学特性的观察 131 A^,L Identification and pathogenicity of Rhizoctonia 立枯丝核菌对多种单糖(葡萄糖、甘露醇、半乳 [3]MAZZOI糖、木糖)、二糖(乳糖、蔗糖、麦芽糖)、多糖(可溶性 淀粉)均能利用,但以蔗糖长势最好,对木糖的利用 最差。在氮源利用方面,硝态氮(硝酸钾、硝酸钠)和 spp.isolated from apple lOOtS and orchard oisls[J].Phytopa— thology,1997,87(6):582—587. [4]袁嗣令主编.中国乔、灌木病害[M].北京:科学出版社,1997:9— 11. 氨态氮(氯化铵、硝酸铵)都较有利于生长,对氨基酸 [5]苑健羽编著.落叶松真菌病害[M].北京:科学出版社,1990: 态氮(谷氨酸)的利用较差,对脲素利用最差。立枯 99—102. 丝核菌在光照条件下比在黑暗条件下生长的稍好, [63方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998. 但差异不明显。 [7]徐敬友,张东华,张红,等.立枯丝核菌毒素的产生及与致病力的 关系口].扬州大学学报,2004,25(2):61—64. [8]湖南省林学会主编.森林病虫害防治[M].长沙:湖南科学技术 参考文献 出版社,1981. [9]周仲铭主编.林木病理学[M].北京:中国林业出版社,1993. [1-1鲍甫成,江泽慧.中国主要人工林树种木材性质[M].北京:中国 [10]中国林学会主编.苗木病虫害[M].北京:中国林业出版社, 林业出版社,1998. 1983. [2]BREDE A n Registration of‘BlueChip’kentucky bluegrass El1]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1985. EJ].Crop Science,2003,43:2310. [12]陆家云.植物病原真菌学[M].北京:中国农业出版社,2001. Identiifcation and Characterization of the Pathogen Causing Damping-off on Sccdlings of Slash Pine CHEN Jing-yuan '。’HUO Xian-qi。’CAI San-shan。’XU Hong-mei ’ TU Junl_jie4’HOU Ming-sheng3’ JI Bao-zhong” ("College of Forest Resources and Environment,Na ing Forestry University, Na ing 210037,China; Hubei Forestry Academy。Wuhan 430079,China; ∞College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,China; Hubei Pengchang Forest Farm,Jingmen 434100,China) Abstract Based on the culture characteristics,the morphology,the pathogenicity and the biological characteristics,pathogen causing damping-off of slash pine(Pinus elliottii)was identified as Rhizoctonia s0lan Kfihn..The suitable temperature and pH for mycelial growth of the pathogen were 10 ̄35℃and pH 4~11,with the optimum at 25 ̄--30℃and pH 7~8.For mycelial growth,the optimum carbon and nitrogen source was sucrose and potassium mitrate.Light has no significant effect on the mycelial growth of the pathogen. Key words slash pine;damping-off;Rhizoctonia solani;biological characteristic (责任编辑:陈红叶)
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