锌转运体3_TSQ及Zinqui_省略_对癫痫小鼠海马苔藓纤维出芽的研究_刘琰

解剖科学进展　Progress of Anatomical Sciences　2009,15(1):77~79

锌转运体3、TSQ及Zinquin三种荧光染色对癫痫小鼠海马苔

藓纤维出芽的研究

刘　琰1，高连波2，贾本智3，池志宏4*

（中国医科大学1.附属第一医院神经外科；2.附属第四医院神经外科；3.附属第四医院传染科; 4.细胞工程学研究室，

辽宁 沈阳 110001）

　　【摘要】　目的　研究锌转运体3、TSQ及Zinquin荧光染色在癫痫小鼠海马苔藓纤维出芽的染色情况。方法 小鼠腹腔注射匹罗卡品建立小鼠癫痫模型，应用锌转运体3、TSQ及Zinquin三种荧光染色技术对造模后15d，30d，60d的模型小鼠苔藓纤维出芽进行标记染色。结果　在造模后15d，三种荧光染色开始出现在小鼠海马的颗粒细胞层。造模后30d，三种荧光染色出现在海马内分子层。而在造模后60d，海马内分子层芽生的苔藓纤维的荧光染色进一步加强。结论　锌转运体3、TSQ及Zinquin三种荧光染色可以做为苔藓纤维出芽的标记方法。　　【关键词】　苔藓纤维出芽；锌转运体3；TSQ荧光；Zinquin荧光；匹罗卡品；小鼠

　　【中图分类号】　R338.2+6 【文献标识码】　A 【文章编号】　1006-2947（2009）01-0077-03

Study on Epileptic Mouse Mossy Fibers Sprouting with Zinc Transporter 3,

TSQ and Zinquin Fluorescence in Mice

LIU Yan, GAO Lian-bo, JIA Ben-zhi, CHI Zhi-hong*

（Laboratory of Cell Engineering, China Medical University, Liaoning Shengyang 110001 China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the distribution and localization of zinc transporter 3, TSQ and Zinquin fluorescence in epileptic mouse mossy fiber sprouting. Methods　Experimental mice were injected (i.p.) with a dose of 300 mg/kg of pilocarpine to induce seizure. Zinc transporter 3, TSQ and Zinquin fluorescence were used to detect the mossy fiber sprouting in epileptic hippocampus 15d, 30d and 60d after pilocarpine treatment. Results　Zinc transporter 3, TSQ and Zinquin fluorescence were found in the granular layer of hippocampus 15 days after pilocarpine treatment, but present in internal molecular layer(IML) 30 days after pilocarpine treatment, and furthermore the staining intensity increased progressively in IML 2 months after pilocarpine treatment. Conclusion　Zinc transporter 3, TSQ and Zinquin fluorescence can be served as new metheds to detect mossy fiber sprouting.

　　【Key words】　mossy fiber sprouting; zinc transporter 3; TSQ fluorescence; Zinquin fluorescence; pilocarpine; mouse

　　苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting，MFS）是癫痫长期发作后海马的一个重要病理特征，采用锌金属自显影技术可以显示苔藓纤维内的游离锌离子从而对MFS进行标记[1-3]。在神经系统内，锌转运体3（zinc transporter3，ZNT3）是一种表达在含锌神经元突起末端突触小泡膜上的一种锌转运体，其功能是将锌离子转运至突触小泡内[4]。我们曾报道

【收稿日期】2008-11-22

【基金项目】辽宁省教育厅高等学校科研项目计划(No. 20060948)*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）

ZNT3与游离锌离子共存于正常小鼠的海马苔藓纤维中[5]。TSQ荧光技术是一种检测锌离子的荧光技术，由Frederickson[6]等于1987年首次发现并应用。Zinquin荧光技术是另一种通过荧光染色对游离锌离子进行标记的染色方法，通过荧光反应基团特异性地与细胞内游离锌离子进行结合[7]。到目前为止尚未见用这三种锌离子荧光对MFS进行染色的报道，因此本实验尝试了使用这三种荧光染色对癫痫模型小鼠海马MFS进行系统的研究。

·78·1　材料与方法

解剖科学进展2009年第15卷第1期

1.1 实验动物和分组

　　健康3月龄的CD-1小鼠50只，雌雄各半，体重30g-40g（北京维通利华实验动物中心提供）。保持 12am/12pm明/暗周期。室温维持在 22～24℃，自由进食和饮水。动物随机分为2组：(1)生理盐水对照组（n=10）；(2)模型组（n=40）。模型动物采用癫痫持续状态后（status epilepticus, SE）后15d、30d、60d，每个时间点各10只动物。1.2 匹罗卡品癫痫模型的建立

　　模型组动物腹腔注射（ip）匹罗卡品溶液（300mg/kg）。对照组注射等量的生理盐水。于注射匹罗卡品前半小时预先腹腔注射（ip）阿托品 (1mg/kg)以阻滞外周胆碱能反应。小鼠在腹腔注射匹罗卡品后观察其行为学变化，实验动物痫性发作等级评价标准采用经Becker等修改后的Racine (1972年)分级标准[8]。

　　在造模后15d、30d、60d后，实验动物麻醉后经心脏灌注4%多聚甲醛，取出大脑，后固定3h, 30%蔗

糖溶液浸泡12h, 样品置于恒冷切片机中，制备10µm厚切片备用。1.3 ZNT3免疫荧光染色

　　将切片放置到湿盒中，滴加3%的H2O2 10分钟，然后用PB清洗。滴加5%BSA封闭液，室温孵育1小时。将ZNT3多克隆抗体（1:100）滴加到切片上，放入到4°C冰箱孵育过夜。次日用PB冲洗切片，加入荧光二抗室温避光孵育2小时。用0.05M的Tris-HCl冲洗三次后，荧光显微镜观察。1.4 TSQ荧光染色

　　取SE后15d、30d、60d的实验动物及对照组动物。过量麻药处死，迅速取出大脑，放入液氮中，10min后，将样品置于冰冻切片机中，冰冻切片20µm。避光条件下，切片浸入4.5µM TSQ溶液中孵育60-90秒，然后用0.9%生理盐水冲洗60秒。荧光显微镜观察，360nm紫外光激发。1.5 Zinquin荧光染色

　　取SE后15d、30d、60d动物及其对照组动物。过量麻药处死，迅速取出大脑，放入液氮中，10min后，将样品放入冰冻切片机中，冰冻切片20µm，空

Fig 1. Stainings of ZNT3, TSQ and Zinquin fluorescence in epileptic mouse dentate gyrus 15 d, 30d, 60d after SE.

2009年第15卷第1期刘　琰等　锌转运体3、TSQ及Zinquin三种荧光染色对癫痫小鼠海马苔藓纤维出芽的研究·79·

但其也有其自身的局限性，由于AMG染色方法使用特殊的灌流和固定手段，因此进行AMG染色的实验材料很难再做其他的实验指标。使用荧光染色来标记MFS则没有上述缺点，且更易于进行与其他标记物进行双标染色。在某些特殊情况下，譬如使用了锌离子螯合剂，ZNT3荧光染色进行苔藓纤维标记就更有优势。ZNT3免疫荧光染色、TSQ荧光及Zinquin荧光技术可以对MFS进行标记，且其染色在癫痫后各个时间点的染色结果与传统AMG染色方式基本一致。

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气中晾干。冷丙酮固定10min, Zinquin荧光溶液（1：50）孵育2h（避光), 0.1M PBS冲洗3次各10 min（避光)。荧光显微镜观察, 360nm紫外光激发。2　 结果

　　对照组实验动物的苔藓纤维（图1a1，a2，a3）明显呈现ZNT3、TSQ以及Zinquin荧光染色，但其颗粒细胞层（granular cell layer）及内分子层（inner molecular layer，IML）未见任何阳性反应（箭头所示）。SE后15d小鼠海马（图1b1，b2，b3）苔藓纤维染色与对照组类似，但其IML及颗粒细胞层已经可见三种荧光的阳性反应，但未在IML堆积成条带（箭头所示）。SE后30d小鼠海马（图1c1，c2，c3）IML内三种荧光染色继续加强，有堆积成条带的趋势（箭头所示）。SE后60d小鼠海马（图1d1，d2，d3）IML三种荧光反应最为强烈，且已经堆积成较致密的荧光条带，示出芽的苔藓纤维（箭头所示）。3　讨论

　　目前，检测锌离子的手段很多。其中检测细胞内外游离锌离子的形态学手段主要有两种，即金属自显影术(autometallography, AMG)和锌荧光探针技术。众所周知，海马苔藓纤维是神经系统中含锌最多的通路之一，采用AMG染色技术对苔藓纤维内的游离锌离子进行标记从而对苔藓纤维进行染色。1980年，Nadler等[9]采用Timm's染色法首次发现红藻氨酸（Kainic acid，KA）致病大鼠齿状回内分子层出现MFS。此后许多研究者均证实[10, 11]，在人类颞叶癫痫和不同实验性癫痫模型中均可观察到MFS。对出芽MF形态学和生理学特性的研究将有助于理解MFS的功能意义。几乎所有相关研究的MFS染色均采用了AMG技术。AMG技术很好地表现MFS的细节，是被广大学者认可的MFS标记技术。ZNT3是一种新发现的锌离子转运体，其在神经系统的分布与游离锌离子是一致的。而TSQ及Zinquin两种荧光染色同样是标记组织内游离锌离子的染色技术。因此，理论上这三种方法也可能成为MFS的标记方法。本实验发现，三种方法均可以很好的标记MFS，而且在癫痫发作后的各个时间点其染色与传统AMG染色结果基本一致。

传统AMG染色方法在MFS标记方面具有很大的优势：非常好的染色效果，相对简单的操作过程等。