放射免疫分析技术

放射免疫分析技术

摘要 RIA 是一种微量分析法, 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它兼有放射性同位素的灵敏性和抗原、抗体反应的特异性两大特点。该法还具有准确性高和精密度好, 便于标准化以及操作简便、经济等优点。由于RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，RIA在应用方面具有一定的生命力。但是，又因为它最致命的弱点就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。不过第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。

关键字 RIA IRIA 基本原理 第五代RIA技术

1959 年，美国科学家Berson 和Yalow 将放射性同位素测量的高灵敏度与抗原抗体的高特异性巧妙地结合起来，创立了放射免疫分析( radioimmuoassay，RIA) 技术。RIA 经过半个多世纪的发展，可以分析成百上千种物质，包括激素、维生素、肿瘤相关抗原、抗体、药物、病毒等。使那些曾认为无法检测的微量而又具有重要生物活性的物质得以精确定量，为医学、生命科学的发展做出划时代的贡献。因此， 1977 年Yalow荣获诺贝尔生理学或医学奖。随后，各国学者发展了酶免疫分析( EIA) 、荧光( FIA) 、时间分辨荧光( TRFIA) 和化学发光( CLIA) 等非同位素标记免疫分析技术。

1. RIA基本原理

放射免疫分析法的本质是一种分子相同的被侧物质和同位素标记物质, 同另一种浓度有限的特异性结合试剂进行的竞争性结合。当同位素标记化合物和特异性结合试剂的量保持一定时, 加入的被侧物或标准物的量与标记物的量之和多于特异性结合试剂有效结合的数目时, 被测物或标准物与标记物一特异性结合试剂复合物之间就呈现一种函数关系。即被测物的量越多, 则标记物的被稀释程度也就越大, 使标记物一特异性结合试剂复合物的量逐渐减少, 放射性强度侧定就越低。根据这种原理来对生物体内的微量物质进行定量测定。

以标记化合物为P* . , 非标记化合物为P , 特异性结合试剂为Q, 其反应式构成了放射免疫分析法的理论基础( 图1 )。

为了进一步阐明放射免疫分析法的原理, 我们再用图2名加以说明。图2 为我们提供简单的量的概念,图名中黑圆点代表标记抗原, 空白圆点代表非标记抗原, 双凹型符号代表抗体, A、B、C、D 分别代表四种不同浓度的非标记抗原。基于标记抗原和非标记抗原的理化性质相同, 与抗体具有相同的结合力, 所以随着非标记抗原含量的增加, 标记抗原和抗体相结合的能力所受到的竞争抑制就越大, 因而B /F或B / B + F的比值相应愈小, 呈相反的关系。

图2放射免疫分析原理示意图

因为标记抗原对抗体的结合被未标记抗原的竞争结合所抑制, 于是产生一条抑制曲线( 图3 )。它反映了标记伉原的结合度、或游离度、或结合度与游离度之比和未标记抗原的函数关系, 这种关系可以有规律的表现在放射免疫测定的剂量反应曲线上。这条曲线就是对样品进行定量的基础。

简单来说，放射免疫分析的原理 : 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它又分为两种方法。

1.1竞争性RIA, 又称传统RIA

主要特点: 标记的是抗原。其原理: 未知抗原Ag+， 标记抗原Ag* +， 已知定量抗体Ab， 标记抗原与抗体复合物Ag *Ab+， 未知抗原与抗体复合物Ag Ab+， 游离标记抗原Ag* ( 去除) ( 未知抗原多, 标记抗原与定量抗体结合的复合物就少, 表现为负相关) 。

临床上甲胎蛋白( AFP) , 癌胚抗原( CEA) , β2- 微球蛋白( β2-MG ) , 铁蛋白( Fer ) , 人绒毛膜促性腺激素β 亚单位( H CG-β) 等的检测都是竞争性RIA 法原理。竞争性RIA 法,

根据加样顺序与温育次数的区别, 反应方式分三种:

平衡法,将非标记抗原( 被测物与标准品) 、抗体、标记抗原依次加入反应管, 混匀后一次性温育至反应达到动态平衡, 再加分离剂分离B( 复合物) 与F( 游离物) 如: AFP, β2-MG, Fer;

顺序加样法, 先将非标记抗原( 被测物与标准品) , 与抗体在反应管内作第一次温育, 待反应达到动态平衡后。加入标记抗原, 再作第二次温育后, 分离B 与F 如: CEA;

急诊检测法: 为临床急需检测结果而提出的反应方式, 不等RIA 反应达到动态平衡就终止反应; 分离剂的选择有, PEG( 聚乙二醇) , 第二抗体等。

现在一般采用的是: 第二抗体与PEG 合用的方法, 称为双抗体- PEG 法。

PEG 原理: PEG 浓度达到7%- 9%时能使抗原- 抗体复合物沉淀。优点: 经济, 简便, 通用。缺点: 重复性差, 非特异性结合率高。

第二抗体: 第一抗体是可与被测抗原进行特异结合的抗体, 来自家兔或豚鼠。用第一抗体为抗原, 作用到羊, 马身上,产生的抗第一抗体的抗体称第二抗体。第二抗体与第一抗体在适当条件下发生特异性结合, 生成分子量很大的免疫复合物( AgAb1 × Ab2 ) , 能自然沉淀。优点: 分离效果好，非特异性结合率低。缺点: 增加经费投入，需要第二次温育, 延长了时间。

所以就产生了两者合用的双抗体- PEG 法, 它结合了上述两种方法的优点。

1.2非竞争性RIA, 又称免疫放射分析( IRMA)

1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术(immunoradiometric assay，IRMA)。

主要特点: 标记的是抗体。按反应原理分为两种: 单位点IRMA, 其原理: 抗原只有一个抗原决定簇, 所测的抗原为小分子抗原, * Ab+ AgAg* Ab + * Ab+ ImAd-Ag ImAd-Ag*Ab+ Ag* Ab ( 去除) ( 负相关) : ( ImAd-Ag) 固相抗原免疫吸附剂, 一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原; 双位点IRMA: 抗原有两个抗原决定簇, 所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰ImAd-Ab+ Ag ImAd-Ab-Ag+ * AbImAd-Ab-Ag- * Ab+ * Ab( 过剩的, 游离的) : ( ImAd-Ab) 固相抗体免疫吸附剂, 一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体双位点IRM A,又称双抗体夹心法, 从加样测定顺序上看, 有三种方法: 固相抗体先与未知抗原结合, 再与标记抗体结合( 正向两步法) 。然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体- 抗原- 标记抗体复合物的放射性计数; 未知抗原先与标记抗体结合, 再与固相抗体结合( 反向两步法) 。然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体-抗原- 标记抗体复合物的放射性计数; 未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应( 一步法, 又称同时加样法) 。然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体- 抗原- 标记抗体复合物的放射性计数。

这三种方法都生成夹心状的抗体- 抗原- 抗体复合物, 故又称双抗体夹心法。

糖类抗原CA50 , CA125 就用的是其中的第三种方法( 一步法) , 血清中的未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应, 生成夹心状的抗体- 抗原- 抗体复合物, 然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体- 抗原- 标记抗体复合物的放射性计数。

2.放射免疫技术发展

虽然RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，但是它最致命的弱点

就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。

早在1983年，Witherpoon就在《免疫分析--将来核医学的地位会存在吗》就谈到了关于放射免疫技术的未来的发展方向，很有可能是被其他先进的自动化技术所取代。事实证明，现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。

但是，RIA和其它放射示踪技术仍处在不断更新换代发展阶段。特别是第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。

据李振甲等人的总结，RIA技术从开创至今，按照技术的进步大可划分为五代。

第一代(1959～1964年)RIA技术及竞争结合蛋白分析法(CPBA)开创。

第二代(1965～1970年)众多学者对RIA技术进行了大量实验研究，将RIA和CPBA技术推进到了临床实用水平。1968年建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法(IRMA)。

第三代(1971～1980年)RIA技术广泛的用于小分子化合物的检测。

第四代(1981～1995年)小鼠抗绵羊红细胞的单克隆抗体(McAb)的出现为RIA提供了新型特异性抗体，使得放射免疫技术灵敏度、特异性提高。

第五代RIA技术,是目前正在研发并使用的，它是以磁性微粒子与RIA或IRMA相结合为特点的。磁性微粒子直径小、表面连有活性基团等特性，使其在包被均一性、反应活性等方

面都要优于经典的分析方法。

3放射免疫技术的最新进展

第五代RIA技术出现后，相应的出现了许多不同的的方法。

3.1 双标记液相IRMA技术

它是五代RIA技术中最具推广意义的。主要特征是将两株高特异性单克隆抗体(McAb)分别标记125I和异硫氰酸荧光素(FITC)共同作为标记试剂，待测样品在液相中生成双标记夹心免疫复合物，以抗FITC磁性微粒子固相作为分离剂。

实验结果表明：(1)双标记液相IRMA比普通的IRMA节省了时间。(2)对于中小化合物，双标记液相IRMA法的灵敏度明显高于酶免疫法和化学发光法。(3)检测量程宽，特异性强，适宜大量样本检测。

3.2 磁性微粒子二抗分离法和磁性微粒子固相一抗法

其原理都是以磁性微粒子代替了原来的PR分离剂，免疫反应和分离时间都有不同程度的缩短。两种方法分析结果存在一定的系统误差，由于两种方法本身的差异以及检测时不可避免的环境因素影响，但此误差并不影响实际样品的检测及临床诊断。

4.放射免疫技术的应用

4.1 激素类检测：(1)在垂体性腺激素：卵泡刺激素(FSH)，黄体生成激素(LH)，睾丸酮(T)，雌二醇(E2)，孕酮(P)，催乳素(PRL)，人生长激素(HGH)，人绒毛膜促性腺激素(HCG)，人胎盘催乳素(HPL)等。(2)甲状腺腺激素。

4.2 肿瘤类检测：甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，糖蛋白抗原(CA19-9)，糖蛋白抗原(CA-125，CA15-3)，β2微球蛋白(β2-MG), 铁蛋白放射免疫分析(SF)，前列腺特意抗原(PSA)。

4.3 放射受体分析：受体是存在于细胞表面、胞浆或细胞核内的生物活性物质，其功能是和细胞外的信息分子(配体)特异性结合，将信息转变为生物效应。放射受体分析(radioreceptor assay，RRA)或受体的放射配体结合分析(radioligand binding assay，RBA)是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反应，它是目前对受体分子进行定量和定位分析研究的灵敏、可靠的一项技术。临床上最常见的就是TRAb放射受体分析，血清中TRAb对甲亢与甲减的病因诊断有重要的意义。此外，在生物设计、药物作用机理、生物效应及疾病的病因探讨、诊断和治疗等方面的应用已有较大发展。

参考文献

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