分光光度法测定保健食品中总黄酮

研究报告

分光光度法测定保健食品中总黄酮

孔鲁裔

（国家农业标准化监测与研究中心黑龙江）

摘要　　　　研究各种操作条件对分光光度法测定保健食品中总黄酮的影响，　得到了较有价值的结论。关键词　　　总黄酮；保健食品；分光光度法

１　前言

总黄酮是很多保健食品中的重要功效成份，能促进胰岛素的亲和力，在降压、降脂、降血糖方面有显著效果，同时还具有增强毛细血管通透性等作用。因此，测定其含量对于保健食品的品质和功效具有重要的意义。但目前国内还没有保健食品中总黄酮测定方法的国家标准。国内外对保健食品中总黄酮的测定，考虑到方法的简便、快捷以及平行性，多采用在碱性介质中加铝盐显色的分光光度法。但是，总黄酮这种天然植物的组分非常复杂，分光光度法在实测过程中会产生各种干扰，影响结果的准确性，本方法有针对性地对此开展了研究，进行了创新并取得了较好的结果，建立了一个高效、准确的测定方法。

目前总黄酮的分析方法国外报道的有溶剂抽提法、聚酰胺薄层分析法等。但是，柱法操作复杂、时间长，难以避免实测过程中会产生各种干扰。因此比较而言，本方法立足于用常规的化学及物理检测方法，采用了超声波提取、聚酰胺吸附法经过改进系统，试验得到了快速、简易、良好的效果，在实际测定、应用中，具有更大的意义。

ｄ）１　ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取４．００　ｇ氢氧化钠，加水至１００ｍｌ，溶解混匀。

ｅ）１０％硝酸铝溶液：称取１０．００　　ｇ硝酸铝，加

水至１００ｍｌ，溶解混匀。

ｆ）３０　％乙醇溶液：吸取３０．０ｍｌ无水乙醇，加水至１００ｍｌ，溶解混匀。

ｇ）芦丁标准对照品：９９．５％

ｈ）芦丁标准溶液：精确称取经１０５℃干燥至恒重并按其纯度折算为１００　％质量的芦丁标准对照品０．０１５０　ｇ，加无水甲醇溶解并定容至１００ｍｌ，此溶液浓度为１５０　μｇ／ｍｌ，０℃～４℃密封保存，保存期为两个月。

２．１．２　　仪器设备

ａ）　天平：感量０．１　ｇ和０．０００１　ｇ。ｂ）分光光度计。ｃ）超声波发生器。ｄ）恒温水浴锅。

ｅ）涡旋混合器。

ｆ）抽滤装置：真空泵、抽滤瓶、布氏漏斗、定量滤纸。

ｇ）层析柱：２０　ｃｍ以上内径为１　ｃｍ的玻璃管。ｈ）蒸发皿：规格１００ｍｌ。ｉ）具塞比色管：规格１０ｍｌ和５０ｍｌ。２．２　操作步骤２．２．１　　提取２．２．１．１　　固体样品

取有代表性样品，　１　ｇ～５　ｇ（精确至０．０１　ｇ）于５０　ｍｌ具塞比色管中，加入３０　ｍｌ无水乙醇，涡旋混匀３　ｍｉｎ。超声提取３０　ｍｉｎ，抽滤，用无水乙醇淋洗比色管、残渣及抽滤瓶，收集全部滤液于１００　ｍｌ蒸发皿中，加１　ｇ聚酰胺粉，缓慢摇匀。于５０　℃水浴上挥去乙醇。

２　检测方法

２．１　试剂与仪器２．１．１　　试剂与材料

ａ）无水甲醇、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯甲烷，均为分析纯，以下用水除特殊说明外，均为ＧＢ／Ｔ　６６８２－２００８中规定的三级水。

ｂ）聚酰胺粉：过８０目～１００目筛。

ｃ）５　％亚硝酸钠溶液：称取５．００　ｇ亚硝酸钠，加水至１００ｍｌ，溶解混匀，当天配制。

２９

研究报告

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

２．２．１．２　　液体样品

取有代表性样品，１　ｍｌ～１０　ｍｌ（精确至０．１　ｍｌ）于５０　ｍｌ具塞比色管中，加入３０　ｍｌ无水乙醇，涡旋混匀３　ｍｉｎ。超声提取３０　ｍｉｎ，抽滤，用无水乙醇淋洗比色管、残渣及抽滤瓶，收集全部滤液于１００　ｍｌ蒸发皿中，加１　ｇ聚酰胺粉，缓慢摇匀。于５０℃水浴上挥去乙醇，再调节水浴至８０℃蒸干。２．２．２　　净化

在层析柱下端填入少量脱脂棉。用７５　ｍｌ三氯甲烷将蒸发皿中的残留物全部转入层析柱中，洗去脂肪，弃去滤液。用４０　ｍｌ无水甲醇再次冲洗蒸发皿，并转入层析柱中，控制洗脱流速小于６０　ｄ／ｍｉｎ，收集全部洗脱液于５０　ｍｌ容量瓶中，用无水甲醇定容至刻度，待测。

２．２．３　　标准工作曲线的配制及测定

分别吸取标准溶液０　ｍｌ、０．５　ｍｌ、１．０　ｍｌ、２．０　ｍｌ、３．０　ｍｌ、４．０　ｍｌ，相当于芦丁含量为０　μｇ、７５　μｇ、１５０　μｇ、３００　μｇ、４５０　μｇ、６００　μｇ，分别置于６个１０　ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至　５　ｍｌ。各加５　％亚硝酸钠溶液０．３　ｍｌ，振摇后放置５　ｍｉｎ。加入１０％硝酸铝溶液０．３　ｍｌ，摇匀后放置６　ｍｉｎ。加１．０　ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２　ｍｌ，　用３０　％乙醇定容至刻度，摇匀，以零管为空白，用１　ｃｍ比色皿，在５０２ｎｍ处进行吸光度测定（比色测定操作须在６０　ｍｉｎ内完成），并绘制芦丁含量（μｇ）与吸光度的标准曲线。２．２．４　　样品的测定

根据样品中总黄酮含量，取待测液１　ｍｌ～５　ｍｌ（精确至０．１　ｍｌ）于１０　ｍｌ刻度比色管中，以下按标准曲线的测定（２．２．３）操作步骤进行测定。同时另取同体积未加铝盐试剂的样液（补加０．３　ｍｌ水），作为样品基体空白，与标准工作曲线相比较定量。２．３　　结果计算

样品中总黄酮的含量（以芦丁计）按式（１）计算：

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　……………………（１）式中：

Ｘ　—样品中总黄酮的含量（以芦丁计），单位为克每１００克或克每１００毫升（ｇ／１００ｇ或ｇ／１００ｍｌ）；

Ｃ　—从标准曲线上查得的被测液中总黄酮含量，单位为微克（μｇ）；

Ｃ０—从标准曲线上查得的被测液中样品基体空白３０

含量，单位为微克（μｇ）；

Ｖ２—样品定容体积，单位为毫升（ｍｌ）；Ｖ１—取待测液体积，单位为毫升（ｍｌ）；ｍ—称取样品质量或体积，单位为克或毫升（ｇ或ｍｌ）。

计算结果保留至小数点后两位。

３　方法的主要技术研究过程

３．１　测定原理

根据资料，将样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，黄酮类化合物中的３－羟基，４－羟基或５－羟

基，４－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。用分光光度法于５０２　ｎｍ波长下测定其吸光度，与芦丁标准对照品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。３．２　对样品中总黄酮的提取工艺的研究

总黄酮（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，基本母核可认为是无苯基色原酮，广泛的存在于天然植物中，组分非常复杂。一般都具有４位羰基，大多数以苷的形式存在且呈现黄色。有的具有良好的心脑血管药理活性，有的具有抗菌消炎作用，有的具有保肝作用。黄酮类化合物是用有机溶剂从植物中提取，再经纯化、干燥所得的黄色粉状品，是一种天然化合物，在食品加工中是很多保健食品添加的重要功效成份。

总黄酮纯化过程中多以乙醇提取为佳。其根本原因，是由于黄酮类化合物中的游离苷元难溶或不溶于水，但易溶于乙醇，因此常用不同浓度的乙醇提取总黄酮；而黄酮类化合物中的黄酮苷类一般可溶于水也可溶于醇，因此也可用水或不同浓度的乙醇提取。而且，用水煎煮提取，亦将蛋白质、糖类等水溶性杂质一同提出，可用醇沉法、丁醇萃取法、聚酰胺柱层析法进行分离纯化，过程比较复杂；用乙醇提取，亦将树脂、蜡质、叶绿素、植物甾醇等脂溶性杂质提出，可用水沉法、碱溶酸沉法、丁醇萃取法、聚酰胺吸附层析法、交联ＰＶＰ吸附层析法等分离纯化，过程相对简单。

上述是一般情况，对某一含黄酮的具体保健品而言，应根据所含黄酮的水溶性及其含量的多少，除黄酮外的其有效部分及其性质、所含蛋白质、鞣质、树脂等杂质的情况以及药材所属植物部位不同（全草、根、茎、叶）等具体情况设计出不同的

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

研究报告

溶剂提取和不同的分离纯化工艺，经筛选试验，最终才能获得适宜的溶剂提取工艺和分离纯化工艺。３．３　对样品中总黄酮提取条件的选择

以下选取以银杏叶、淫羊霍、黄芩为主要成分的三种有代表性的总黄酮保健食品为例，尽管以上三位药均含黄酮为主要有效成分，但由于在加工过程中使用的药用部位的不同（银杏叶使用的药用部位是叶，淫羊霍为全草、黄芩为根茎），加工过程中提取溶剂和提取工艺的不同，加工过程中分离纯化工艺的亦不同，导致在实验中得到的结果略有差异，见表１提取条件的选择。

例如，银杏叶胶囊除含黄酮有效成分外，还含有难溶于水的萜类内酯有效成分，银杏叶既含有游离黄酮也含有黄酮苷，因此，不宜用水提取，经试验，用水煎煮提取３次，黄酮的提取率仅为４５％左右；用７０％乙醇回流提取２ｈ，７５％乙醇和无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ，总黄酮提取率才可达９０％以上

酮，一般都具有４位羰基，大多数以苷的形式存在且呈现黄色。而其组分非常复杂，含有大量未知成分（目前还没有任何科学手段能对其全部组分进行测定）。选用芦丁作总黄酮的标准对照品，是因为芦丁不但有较优的化学稳定性，且其组份与大多数总黄酮类化合物最为接近，其在光谱扫描中的特征吸收区与总黄酮类化合物也最为接近。那么，在目前的科学手段还无法全部的测定总黄酮组分时，只能以选取一种最接近其组成的标准对照品来参照标定其含量。所以，在本标准的制定中，我们选用芦丁作为标定总黄酮的标准对照品（本标准测定的总黄酮含量以芦丁计）。３．５　测定波长的选择

由于黄酮类化合物中的３－羟基，４－羟基或５－羟基，４－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成稳定的红色络合物。所以，对芦丁标准品、和含有总黄酮的保健品样品，经显色后进行紫外光谱分析扫描，如图１、图２、图３，由于总黄酮和保健品中组份都很复杂，可见在２７８ｎｍ～４４０ｎｍ处有较大干扰，所以选其最佳吸收峰为５０２ｎｍ。

图１　　芦丁标准品紫外光谱扫描图

表１　　提取条件的选择

所以根据试验结果，对某一含总黄酮的具体成分而言，应根据所含黄酮的水溶性及其含量的多少，除黄酮外的其有效部分及其性质、所含蛋白质、鞣质、树脂等杂质的情况以及药材所属植物部位不同（全草、根、茎、叶）等具体情况综合选取提取溶剂，经以上筛选试验，最终获得最适宜的溶剂提取条件为，用无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ。３．４　标准对照品的选择

芦丁属黄酮类，带有明显的黄酮苷集团，是目前国际上最常用的标定总黄酮的标准对照品。由于，总黄酮（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，基本母核可认为是无苯基色原

图２　　银杏叶胶囊紫外光谱扫描图

图３　　黄芩口服液紫外光谱扫描图

３１

研究报告

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

３．６　线性相关性、标准曲线配制、线性方程及相关系数

确定标准溶液的配制方法，并配制不同浓度的标准溶液进行测定，画出不同浓度范围内的标准曲线，计算其相关系数。３．６．１　　标准溶液的配制

３．６．１．１　　标准溶液的配制方法（同２．１．１中ｈ）芦丁标准溶液的配制）

３．６．１．２　　标准溶液的稳定性试验

将浓度为１５０μｇ／ｍｌ的芦丁标准溶液，在０℃～４℃密封条件下保存，每次测定前取出，恢复到室温，吸取１ｃｍ与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成稳定的红色络合物，在５０２ｎｍ处进行吸光度测定（同２．２．３），与标准曲线相比较定量，并计算回收率，如表２。结果表明，浓度为１５０μｇ／ｍｌ的芦丁标准溶液，在０℃～４℃密封条件下保存，最佳保存时间为两个月。

表３　　显色剂用量的选择及稳定性情况

所得结果表明，最佳的显色剂用量和放置时间

表２　　标准溶液的稳定性试验

为：加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加

入１０％硝酸铝溶液０．３ｍＬ，摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ。

②总黄酮在不同溶剂中的吸收情况

吸取１５０μｇ／ｍｌ的总黄酮标准溶液４ｍｌ于３个１０ｍｌ比色管中，各加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍｌ，摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ，各加入无水乙醇、无水甲醇、３０％乙醇定容至刻度，以试剂空白为空白，摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值，如下表４。

３．６．２　　标准工作曲线的配制及测定

３．６．２．１　　对标准工作曲线配制条件的验证

确定标准曲线的含量范围０μｇ～６００μｇ，取６００μｇ为测定峰值，分别确定亚硝酸钠、硝酸铝溶液　、氢氧化钠、乙醇加入的量对显色和测定的影响进行验证：

①显色剂用量的选择及稳定性试验吸取１５０μｇ／ｍｌ的总黄酮标准溶液４ｍｌ于１０个１０ｍｌ比色管中，各加一定量的５％亚硝酸钠溶液，振摇后放置一段时间，加入一定量的１０％硝酸铝溶液，摇匀后放置一段时间，加一定量的１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液，各加入３０％乙醇定容至刻度，以试剂空白为空白，摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值，如下表３。

表４　　在不同溶剂中的吸收情况

３２

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

研究报告

所得结果表明，在相同条件下总黄酮在３０％乙醇溶剂中的吸光值最大测定灵敏度最高。

③显色后待测液的稳定性试验

吸取１５０μｇ／ｍｌ的总黄酮标准溶液１０ｍｌ于１０个５０ｍＬ比色管中，各加５％亚硝酸钠溶液１．５ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液１．５ｍｌ，摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液１０ｍｌ，各加入无水乙醇、无水甲醇、３０％乙醇定容至刻度，放置不同时间后，以试剂空白为空白，摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值，如下表５。所得结果表明，显色后须在６０ｍｉｎ内上机测定。

对其进行线性回归分析。回归方程为Ｙ＝０．００１１ｘ　＋０．００２３，相关系数为Ｒ＝０．９９９９。

３．７　　对方法进行重现性、精密度和准确度的测试３．７．１　　方法重现性和精密度的测试

分别吸取标准溶液（３．６．１．１）２．０ｍｌ（相当于芦丁含量为３００μｇ）于　６个１０ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至５ｍｌ，摇匀（以下操作过程同３．６．２．２标准工作曲线的配制及测定）。分别以配制成的３００μｇ标准溶液为进样溶液，６个样液按上述条件，测定其含量，计算标准偏差和相对标准偏差。所得结果表明本方法重现性好，达到一定的精密度，如表７。

表５　　显色后待测液的稳定性情况

３．６．２．２　　标准工作曲线的配制及测定结果

分别吸取标准溶液（３．６．１．１）０　ｍｌ、０．５　ｍｌ、１．０　ｍｌ、２．０ｍｌ、３．０ｍｌ、４．０ｍｌ，相当于芦丁含量为０、７５μｇ、１５０μｇ、３００μｇ、４５０μｇ、６００μｇ移入１０ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至５ｍＬ，摇匀。再各加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍＬ，摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ，用３０％乙醇定容至刻度。以零管为空白，摇匀后用１ｃｍ比色杯，在５０２ｎｍ处进行测定吸光度（比色测定操作须在６０　ｍｉｎ内完成），绘制芦丁含量（μｇ）与吸光度的标准曲线，如表６、图４。

表７　　方法重现性和精密度的测试

３．７．２　　方法的准确度

根据上述测定结果，已知６个样液配制含量为３００μｇ，计算测定值与真实值的绝对误差和相对误差。所得结果表明本方法的准确度良好，如表８。

表６　　标准曲线系列方程及相关系数

表８　　方法的准确度计算

３．８　　样品处理条件的选择

３．８．１　　水浴温度的选择

３．８．１．１　　在水浴上挥去乙醇的最佳温度

选取四种有代表性的已知含量样品，在不同温

图４　　标准曲线

３．６．３　　线性关系

以吸光值为纵坐标，芦丁标准品含量为横坐标

度的水浴条件下，挥去乙醇，观察现象并测定其含量，计算其回收率，如表９。结果表明在５０℃水浴上挥去乙醇，测定总黄酮效果最好。

３３

研究报告

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

中，分别加入的０．５、１．０、２．０、３．０ｇ聚酰胺粉。充分搅拌２ｍｉｎ后，分别用约１０ｍｌ无水乙醇分几次充分洗涤烧杯转移至１００蒸发皿中，缓慢摇匀，于５０℃水浴上挥去醇类溶剂后，转入层析柱。先用７５ｍｌ三氯甲烷洗去脂肪，并弃去滤液。然后用无水甲醇洗脱，收集此滤液并定容至５０ｍｌ待测。

移取上述待测液１ｍｌ于１０ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至５ｍｌ，各加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍｌ摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ，用３０％乙醇定容至刻度，以试剂空白为空白，摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值（比色测定操作须在６０ｍｉｎ内完成），并与标准曲线相比较定量、计算其回收

表９　　挥去乙醇的水浴温度试验

率。结果表明用１．０ｇ聚酰胺粉吸附总黄酮，效果最好，如表１１。

３．８．１．２　　液体样品在水浴上除去水分的最佳温度

选取四种有代表性的液体样品（已知含量），经无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ，抽滤并转移滤液于１００ｍｌ蒸发皿中，加入１ｇ聚酰胺粉摇匀，分别在５０℃水浴上挥去乙醇后，在不同温度的水浴上除去水分，观察现象、计算回收率。结果表明在８０℃水浴上除去水分，测定总黄酮效果最好，如表１０。

表１１　　吸附剂用量对回收率的影响

３．８．３　　对去脂肪净化溶剂的选择及用量３．８．３．１　　对去脂肪净化溶剂的选择

选取四种有代表性的样品（已知含量），经无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ，抽滤并转移滤液于１００ｍｌ蒸发皿中，加入１ｇ聚酰胺粉摇匀，分别在５０℃水浴上挥去乙醇，液体样品另在８０℃的水浴上除去水分后，转入层析柱。用过量的不同溶剂洗去脂肪，并弃去滤液。然后用无水甲醇洗脱，收集此滤液并定容至５０ｍｌ待测。

移取上述待测液１ｍｌ于１０ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至５ｍｌ，各加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍｌ摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ，用３０％乙醇定容至刻度。同时另取同体积未加铝盐试剂的样液

表１０　　除去水分的水浴温度试验

（补加０．３　ｍＬ水），作为样品基体空白。摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值，并与标准曲线相比较定量、计算其回收率。结果表明，用三氯甲烷去脂肪后，测定总黄酮效果最好，如表１２。

３．８．２　　吸附剂用量的选择

分别吸取５００μｇ／ｍｌ的芦丁标准溶液（配制方法同３．６．１．１标准溶液的配制）６０ｍｌ于４个１００ｍｌ烧杯３４

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

研究报告

分别吸取５００μｇ／ｍｌ的芦丁标准溶液（配制方法同３．６．１．１　标准溶液的配制）６０ｍｌ于３个１００ｍｌ烧杯中，分别加入１．０ｇ聚酰胺粉。充分搅拌２ｍｉｎ后，分别用约１０ｍｌ无水乙醇分几次洗涤烧杯，转移至１００ｍｌ蒸发皿中，缓慢摇匀，于５０℃水浴上挥去醇类溶剂后，转入层析柱。先用７５ｍｌ三氯甲烷洗去脂肪，并弃去滤液。然后分别用以下几种解吸液洗脱，控制洗脱流速小于６０ｄ／ｍｉｎ，收集此滤液并定容至５０ｍｌ待测。

移取上述待测液１ｍｌ于１０ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至５ｍｌ，各加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振

表１２　　不同去脂肪溶剂用量对回收率的影响

摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍｌ摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ，用３０％乙醇定容至刻度，以试剂空白为空白，摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值，并与标准曲线相比较定量、计算其回收率，结果如表１４。

３．８．３．２　　对三氯甲烷用量的选择

选取四种有代表性的样品（已知含量），向固体样品中加入５．０ｇ油脂，液体样品中加入１０ｍｌ油脂（称质量为５．６ｇ），混匀后经无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ，抽滤并转移滤液于１００ｍｌ蒸发皿中，加入１ｇ聚酰胺粉摇匀，分别在５０℃水浴上挥去乙醇，液体样品另在８０℃的水浴上除去水分后，转入层析柱。用不同量的三氯甲烷洗去脂肪，并收集滤液。将三氯甲烷滤液在水浴上旋转蒸干，计算洗去的脂肪质量，并计算脂肪回收率。结果表明，用７５ｍｌ三氯甲烷去脂肪效果最好，如表１３。

表１４　　其它不同解吸液中的解吸附情况

所的结果表明，前两种解吸液都可使用，第三种解吸液滤液回收率较低且易产生混浊影响比色。本实验选用第一种解吸液，无水甲醇溶液。３．８．４．２　　解吸溶剂用量的选择

分别吸取５００μｇ／ｍｌ的芦丁标准溶液（配制方法同３．６．１．１标准溶液的配制）６０ｍｌ于４个１００ｍｌ烧杯中，分别加入１．０ｇ聚酰胺粉。充分搅拌２ｍｉｎ后，分别用约１０ｍｌ无水乙醇分几次洗涤烧杯，转移至１００蒸发皿中，缓慢摇匀，于５０℃水浴上挥去醇类溶剂后，转入层析柱。先用７５ｍｌ三氯甲烷洗去脂肪，并弃去滤液。然后分别用以下几种解吸液洗脱，控制洗脱流速小于６０ｄ／ｍｉｎ，收集此滤液并定容至５０ｍｌ待测。

移取上述待测液１ｍｌ于１０ｍｌ刻度比色管中，加入３０％乙醇溶液至５ｍｌ，各加５％亚硝酸钠溶液０．３ｍｌ，振摇后放置５ｍｉｎ，加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍｌ摇匀后放置６ｍｉｎ，加１．０ｍｏｌ／ｌ氢氧化钠溶液２ｍｌ，用３０％乙醇定

表１３　　三氯甲烷用量的选择

容至刻度，以试剂空白为空白，摇匀后于５０２ｎｍ处用１ｃｍ比色杯测定其吸光值，并与标准曲线相比较定量、计算其回收率。结果表明，用４０ｍｌ无水甲醇，控制洗脱流速小于６０ｄ／ｍｉｎ，洗脱效果最好，如表１５。

３５

３．８．４　　解吸溶剂的选择和用量

３．８．４．１　　解吸溶剂的选择

研究报告

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

３．９．４　　样品准确度的测定

针对以上已知含量的样品进行多次测量，计算其准确度。所得结果表明，本方法测定的样品准确度良好，如表１８。

表１５　　不同用量解吸液的解吸附情况

３．９　　样品含量、样品重现性、精密度及准确度的测定３．９．１　　样品含量的测定

选择有代表性的四种样品，用以上（２．２）确定的外标法重复测定其总黄酮含量数次，求平均值，如表１６。

表１８　　样品的准确度计算

表１６　　样品重现性的测试

３．９．２　　样品重现性和精密度的测定

针对以上测得的数据，计算样品标准偏差和相对标准偏差。所得结果表明，本方法测定的样品重现性和精密度良好，如表１７。

３．１０　　对样品进行回收率测试

针对样品加入不同浓度的标准物质，按以上方法进行处理并测定其含量，计算回收率，结果表明样品均能达到一定的回收率如表１９、２０。

表１９　　样品第一次加标的回收率计算

４　方法定量限和检出限的测定

表１７　样品精密度的测试

４．１　　方法检出限的测定

３６

生命科学仪器　　２００９　第８卷／２月刊

研究报告

表２２　方法定量限的测定

５　误差讨论

对于含葡萄、山楂等有色水果为原料的样品，必须用未加铝盐试剂的样液为空白或采用标准加入法进行测定，以避免样液颜色对测定干扰而引起结果偏高。参考文献

表２０　　样品第二次加标的回收率计算

［１］［２］［３］

王光亚．保健食品功效成分检测方法［Ｍ］．中国营养学会营养分析分会，　中国轻工业出版社，　２００２年１月：２９－３１；曹根生，薛爱珍，李平等．脉安冲剂中总黄酮含量测定方法的初步研究［Ｊ］．中成药研究，１９８１年１２月：　１３－１５；罗兰，郭丽冰，曾常青．　大山楂丸中总黄酮的含量测定［Ｊ］．时珍国医国药，　２００７年０９期王自军，邓红．　淡竹中总黄酮的提取与含量测定［Ｊ］．　甘肃中医，　２００４年０７期：　３６－３７３；［４］

表２１　方法检出限的测定

［５］［６］［７］

赵大洲，徐本明，刘珂．三氯化铝络合分光光度法测定淫羊藿中总黄酮含量［Ｊ］．　中草药，２００４年０２期：　９９－１００；中华人民共和国国家标准．蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法［Ｓ］．ＧＢ／Ｔ　２０５７４－２００６

中华人民共和国农业部标准．　荞麦及其制品中总黄酮含量的测定［Ｓ］．ＮＹ／Ｔ　１２９５－２００７

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｔｈｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｅｍ　ａｎｄ　Ｌｅａｆ　ｏｆＡｒｔａｂｏｔｒｙｓ．　ｈａｉｍａｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］．合成化学，　２００４年Ｓ１期：１４２。

将１５０μｇ／ｍＬ标准溶液逐级稀释至１μｇ／ｍＬ，测定

本标准检出限为５μｇ／ｍＬ，如表２１。

４．２　　方法定量限的测定

将标准品逐级稀释添加到空白样品中，按标准方法进行提取、测定，最终确定本标准检出限为２５μｇ／ｇ，如表２２。

新闻动态

我国国家环保标准突破１１００项

从全国环保科技工作会议上获悉，２００８年我国共完成１２３项国家环保标准的制订、修订工作，现行国家环保标准突破１１００项，环保标准体系建设工程取得巨大进展。

据环境保护部副部长吴晓青介绍，２００８年我国完成了声环境质量标准和工业企业、社会生活噪声排放标准及铁路边界噪声标准的修改方案，一揽子解决了长期困扰我国环境噪声监管工作的一些“老大难”问题，规范和促进了噪声污染防治工作。

地方环保标准制订也取得进展。河北、上海、山东分别制订了当地环保标准规划，内蒙古、黑龙江、吉林、上海、福建等省（区、市）发布了一系列地方环保标准，形成了具有地方特色的标准体系。

据了解，为适应开展氮氧化物排放削减和控制的需要，今年环保部门将尽快制订氮氧化物排放标准，出台氮氧化物污染防治技术政策。

３７