四川地区脉络膜黑色素瘤患者GNAQ,GNA11基因突变检测

Yan Ke Xue Bao

2019, 34(2) ykxb.amegroups.com

99

doi: 10.3978/j.issn.1000-4432.2019.05.04

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四川地区脉络膜黑色素瘤患者GNAQ，GNA11基因突变检测

何继才1，杨荣琴1，彭睿2

(1. 凉山彝族自治州第一人民医院眼科，四川 凉山 615000；2. 四川大学华西医院眼科，成都 610000)

[摘　要] 目的：检测四川地区脉络膜黑色素瘤患者GNAQ，GNA11基因的突变情况。方法：对22名脉络膜黑色素瘤患者行眼球剜除术，眼球组织用甲醛固定，石蜡包埋保存。从肿瘤石蜡切片中提DNA进行PCR扩增反应，并对GNAQ，GNA11突变位点进行测序分析。结果：在16名患者的肿瘤组织中检测到GNAQ或GNA11基因突变，总突变率为72.73%，其中GNAQ突变率为45.45%，GNA11突变率为27.28%。结论：GNAQ，GNA11基因在四川地区脉络膜黑色素瘤患者中的突变率较高。

[关键词] 脉络膜黑色素瘤；GNAQ基因；GNA11基因

Genetic analyses of GNAQ and GNA11 mutation in uveal

melanoma in Sichuan

HE Jicai1, YANG Rongqin1, PENG Rui2

(1. Department of Ophthalmology, No. 1 People’s Hospital of Liangshan Yi Autonomous Prefecture, Liangshan Sichuan 615000;

2. Department of Ophthalmology, West China Hospital, Chengdu 610000, China)

Abstract Objective: To sequence the GNAQ and GNA11 mutation in patients with uveal melanoma from Sichuan Province. Methods: A total of 22 samples were collected from uveal melanoma patients. DNA was extracted from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Primers of GNAQ and GNA11 were synthesized. Polymerase chain reaction was performed and the products were sent to sequencing. Results: A total of 16 cases among the patients with uveal melanoma were found with GNAQ or GNA11 mutation. The overall mutation rate was 72.73%. And the mutation rates for GNAQ and GNA11 were 45.45% and 27.28%, respectively. Conclusion: The patients with uveal melanoma in Sichuan province have a high level of GNAQ/GNA11 mutation rate.

Keywords uveal melanoma; GNAQ gene; GNA11 gene

脉络膜黑色素瘤是成年人最常见的眼内恶性肿瘤[1]。约50%的脉络膜黑色素瘤患者发生会发生转移，而目前几乎没有任何有效的治疗方法[2]。在发现肿瘤转移后，患者的生存时间一般少于 6个月[3]。

GNAQ和GNA11基因编码Gαq蛋白，其参与

收稿日期(Date of reception)：2019–03–13

通信作者(Corresponding author)：彭睿，Email: 85882216@qq.com

基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金(81602597)。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81602597).

100调节G蛋白偶联受体和下游的效应器[4]。研究[4]表明：原癌基因GNAQ和GNA11的突变率在白种人中约为80%。这2个基因的突变会导致丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激酶通路上调，很可能是脉络膜黑色素瘤发生发展的主要因素[5]。然而最近在中国人群中的研究[6]发现：只有约30%的患者有这2个基因的突变。提示基因突变及其在肿瘤发生中的作用可能随人种不同而不同。本研究检测分析了中国四川地区脉络膜黑色素瘤患者的GNAQ和GNA11基因突变情况，旨在明确这两个基因在该地区患者中的突变率。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2011年1月至2016年1月四川大学华西医院以及四川省凉山彝族自治州第一人民医院的22例脉络黑色素瘤患者。纳入标准：年龄性别不限，明确的组织病理学诊断，患者自愿参加本项研究。排除标准：不符合入选标准者；已经或正在接受脉络膜黑色素瘤放射以及药物治疗的患者。诊断依据包括眼底检查、B超检查以及组织病理检查。临床检查主要包括患者年龄、性别、肿瘤厚度、最大基底直径、组织细胞类型、是否侵犯睫状体、是否侵犯视神经、是否发生转移。随访时间不少于3年。本研究严格遵守赫尔辛基宣言，所有临床与实验室检查均取得患者的知情同意，并经四川大学华西医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 DNA提取及测序

眼球摘除后，常规进行甲醛固定，石蜡包埋。获得石蜡切片后，通过DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini KIT，德国Qiagen公司)对肿瘤组织进行DNA提取。Primer 5.0软件设计GNAQ和GNA11的4号和5号外显子的引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列：GNAQ exon5上游引物为5'-GACTTGGATGATCATCGTCATT-3'，下游引物为5'-AAGAAAGCAAAGAAGTAAGTTCAC-3'；GNAQ exon4上游引物为5'-TGTCCTTCCC- TTTCCGTAGA-3'，下游引物为5'-TGGGAAATAGG-TTTCATGGACT-3'；GNA11 exon 5上游引物为5'-AGCGTCCTTGCCCGTTCTA-3'，下游引物为

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5'-AGGGCCCACCTCGTTGTC-3'；GNA11 exon 4上游引物为5'-GCTGGTTTGGGTGCTGTGT-3'，下游引物为5'-GGCAAATGAGCCTCTCAGTGT-3'。通过PCR反应扩增目标基因，扩增的PCR产物通过ABI PRISM 3.0 Genetic analyzer(ABI，上海生工生物公司)测序。测序结果通过DNAstar软件分析。

2 结果

2.1 临床结果

本研究对22位脉络膜黑色素瘤患者行眼球摘除术。患者年龄为(42.1±14.8)岁，男女比例为12/10(表1)。患者均为单眼发病。在随访期间，7名患者发现了肿瘤转移，其中5名患者为肝转移，2名患者为多器官转移。这7名患者都因肿瘤转移发生死亡，术后存活时间为(424.1±69.33) d。其余未发生肿瘤转移的患者的随访时间均大于3年。

表1 脉络膜黑色素瘤患者的临床及病理情况

Table 1 Clinicopathological data of uveal melanoma patients临床病理特征数值年龄/岁42.1±14.8 (24~69)民族/[例(%)]汉族16 (72.73)少数民族6 (27.27)性别(男/女)/[例(%)]12 (54.55)/10 (45.46)最大基底膜直径/mm16.7±3.3肿瘤厚度/mm12.5±4.2细胞类型/[例(%)]梭形细胞13 (59.1)类上皮样细胞1 (4.55)混合细胞型8 (36.36)巩膜侵犯13 (59.1)累及睫状体6 (27.27)累及视神经3 (13.64)转移/[例(%)]7 (31.82)诊断到手术的时间/d146.5±71.2转移患者术后存活时间/d

424.1±69.33 四川地区脉络膜黑色素瘤患者GNAQ，GNA11基因突变检测 何继才，等101

2.2 基因检测结果

对GNAQ和GNA11基因的4号、5号外显子进行测序。总突变率分别为45.46%，27.28%；其中，GNAQ基因发生Q209P突变的突变率为31.82%，发生Q209L的突变率为13.63%(表2)。没有患者同时发生GNAQ和GNA11基因突变(图1)。

表2 基因突变分布

Table 2 Proportion of each mutation type 基因GNA11 exon 5GNA11 exon4GNAQ exon 5突变位点c.626A>T (Q209L)−c.626A>C (Q209P)c.626A>T (Q209P)GNAQ exon 4−7331.8213.64n6百分比/%27.28A

GNA11WT

B

GNA11

c.626T>A (Q209L)

C

GNAQWT

D

GNAQ

c.626A>C (Q209P)

E

GNAQ

c.626A>T (Q209L)

图1 基因突变位点Figure 1 Mutation sites

(A)GNA11基因野生型序列；(B)GNA11基因点突变，cDNA序列626位点胸腺嘧啶突变为腺嘌呤；(C)GNAQ基因野生型序列；(D)GNAQ基因点突变，cDNA序列626位点腺嘌呤突变为胞嘧啶；(E)GNAQ基因点突变，cDNA序列626位点腺嘌呤突变为胸腺嘧啶。

(A) Wildtype sequence of GNA11 gene; (B) Point mutation of GNA11, c. 626 T>A; (C) Wildtype sequence of GNAQ; (D) Point mutation of GNAQ, c. 626 A> C; (E) Point mutation of GNAQ, c.626 A>T.

1023 讨论

在本研究中，脉络膜黑色素瘤发生GNAQ和GNA11基因突变率分别为45.46%和27.28%，总突变率为72.74%。Van Raamsdonk等[4]报道：在高加索人群中，83%的脉络膜黑色素瘤中检测到GNAQ或GNA11突变。本研究结果与之相近。然而，Xu等[6]报道：在中国脉络膜黑色素瘤患者中，GNAQ或GNA11突变率仅为38%(GNAQ：18%；GNA11：20%)。推测其原因如下：1)本研究样本量太小，可能会造成统计误差；2)肿瘤组织长期保存中发生DNA降解，导致测序不准确；3)中国北方人和南方人或者少数民族患者之间可能存在基因差异。由于本研究医院所属地区脉络膜黑色素瘤患者较少，且不易随访，因此样本确实有限。为减小测序误差，所有PCR产物都测序2次，若结果不一致再加测。

脉络膜黑色素瘤的突变负担小于大部分肿瘤，与儿童肿瘤的突变负担相似[7]。而GNAQ和GNA11突变一直被认为是在肿瘤早期发生的突变，并被认为在肿瘤的发生中起重要作用[8-11]。在Van Raamsdonk等[4,12]的报道中，大多数GNAQ和GNA11突变都发生在209密码子，少数发生在183密码子。在本研究中，GNAQ和GNA11突变都发生在209密码子。另外笔者团队[6]也未发现4号外显子突变，这与之前关于中国人群的报道相符。

综上，GNAQ和GNA11基因在四川地区脉络膜黑色素瘤患者中的突变率较高。

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本文引用：何继才, 杨荣琴, 彭睿. 地区脉络膜黑色素瘤患者GNAQ，GNA11基因突变检测[J]. 眼科学报, 2019, 34(2): 99-102. doi: 10.3978/j.issn.1000-4432.2019.05.04

Cite this article as: HE Jicai, YANG Rongqin, PENG Rui. Genetic analyses of GNAQ and GNA11 mutation in uveal melanoma in Sichuan[J]. Yan Ke Xue Bao, 2019, 34(2): 99-102. doi: 10.3978/j.issn.1000-4432.2019.05.04