一、实验目的要求
1、 了解细菌总数检验的意义。
2、 掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法 3、 掌握国际法测定菌落总数的方法和技能 4、 掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能 5、 熟练无菌操作技术。
二、原理
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。 霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
三、试剂和仪器
细菌总数的检验部分：
（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）
规格名称 数量 1、500ml广口瓶 1个 2、500ml三角瓶 1个 3、250ml三角瓶 2个 4、18×180mm试管 3支 5、1ml移液管 5 支 6、直径为90mm平皿 10套 7、250ml量筒 1支 8、玻璃珠：直径约5mm （二）应灭菌、消毒的器材
用途 稀释样品 配制生理盐水 配制营养琼脂 稀释样品
倒营养平板
剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只， 开瓶器 （三）应制备的培养基
培养基总量
1、 0.85%NaCl生理盐水 1瓶 300ml/瓶 2、 营养琼脂：
2瓶 100ml/瓶
所用容器
500ml三角瓶 250ml三角瓶
食品中霉菌和酵母菌的计数部分：
（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）
规格名称
数量
1个 1个 2个
用途
1、500ml广口瓶 2、500ml三角瓶 3、250ml三角瓶 4、18×180mm试管 5、1ml移液管 6、10ml移液管
稀释样品 配制生理盐水 配制营养琼脂 稀释样品
3支
５ 支 1支
6、直径为90mm平皿 10套 7、250ml量筒
1支
倒平板
8、玻璃珠：直径约5mm 适量 （二）应灭菌消毒的器材
剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只 （三）应制备的培养基
培养基总量
1. 灭菌蒸馏水：
所用容器 500ml三角瓶
1瓶 300ml/瓶
1瓶 120ml/瓶
2. 高盐察氏培养基： 250ml三角瓶 250ml三角瓶
3. 孟加拉红培养基： 1瓶 120ml/瓶
四、实验内容
细菌总数的检验部分：
（一）、基本操作过程：
样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。 （二）、样品的稀释（样品的处理）
样品：袋装乳粉
外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。
3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。
4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。 注意：
①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。
②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。
③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。 ④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。 （三）、倒平板
稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。 注意：
①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过
度，以免溅起触及上盖。
②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。
（四）、培养
待琼胶凝固后，翻转平皿，置36±1℃温箱内培养48h后取出，立即计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 注意：
（1） 琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。 （2） 如果把不能立即计数，要将平板放入0～4℃冰箱中，但不能超过24 h。 不同产品菌落总数测定的培养时间：
肉、乳、蛋及制品： 37℃培养 48h 水产品： 30℃培养 48h：
清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等：37℃培养 24h
食品中霉菌和酵母菌的计数部分：
（一）、基本操作过程：
样品称量→→样品的稀释→→倾注平皿→→培养5天→→计数报告。 （二）、样品的稀释（样品的处理）
样品：糕点、果脯、糖果类，或粮食类
外包装消毒→→无菌称取样品25g→→加无菌水→→加盖振荡、吹吸均匀
➢ 糕点：如为原包装，用灭菌镊子夹下包装纸，采取外部及中心部位。如为带馅糕点，取外皮及内馅25g,奶花糕点，采取奶花及糕点部分各一半共25g。
➢ 果脯：采取不同部位称取25g检样，加入灭菌水225mL，制成混悬液。
➢ 糖果：用灭菌镊子夹取包装纸,称取数块共25g，加入预温至45℃的灭菌水225mL，待溶化后检验。
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，以无菌操作开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中。然后加入225mL的灭菌水，采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇30 min，振摇均匀，即为1:10的稀释液。
2、用10ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液10ml，注入无菌试管内，另用带橡皮乳头的1ml灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
3、用1ml灭菌吸管，吸取上述1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌水的试管内，换一支1ml灭菌吸管反复吹吸5次，制成1∶100稀释液。
4、另取1ml灭菌吸管，吸取上述1∶100稀释液1ml，注入含有9ml灭水的试管内，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。
5、根据对检样污染的情况估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
6、用1ml无菌水作空白对照试验，做2个平皿。
注意：
①加入检样液时，吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液，并将吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。
②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内紧贴。
③每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。 （三）、倒平板
稀释液移入平皿后，及时将凉至46℃的培养基（可放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并正反转动平皿使混合均匀。 注意：
①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，
以免溅起触及上盖。
②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜过长。 （四）、培养：
待琼脂凝固后，翻转平皿，置25～28℃温箱内培养5天，从第3天开始观察后取出，共观察培养5天。
（五）、菌落计数及报告：
选取菌落数10～150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。稀释度选择及菌落数报告方式可参考菌落总数测定的报告方式。
五、思考题
1、 食品检验为什么要测定细菌菌落总数？
2、 食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？ 3、 为什么营养琼脂培养基在使用前要保持地（46±1）℃的温度？ 4、 培养时为什么要把培养皿倒置培养？
5、 在菌落总数测定和霉菌、酵母菌的计数中，两者在样品处理过程中有何不同？列表说明？计数时又有何异同处？
6、 计数下表中的数值： 稀释度及菌落数 项目 例次 1 2 10-1 10-2 两稀释度菌 菌落总数/ 报告方式/ 10-3 落数之比 [cfu/g（mL）] [cfu/g（mL）] 25 45 40 多不可计 120 多不可计 250 多不可计 180 菌落总数测定3 4 5 6 7 多不可计 多不可计 320 28 0 12 0 1 0 15 8 26 25 多不可计 310 多不可计 120 200 180 140 120 霉菌、酵母菌计数8 9 10 11 12 多不可计 多不可计 152 0 0 0
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