(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105112337 A (43)申请公布日 2015.12.02
(21)申请号 201510584631.7(22)申请日 2015.09.15(83)生物保藏信息
CGMCC No.10348 2015.01.13
(71)申请人重庆大学
地址400044 重庆市沙坪坝区沙正街174号(72)发明人赵彬 安强 郭龙杰 田梦 汪霞(74)专利代理机构重庆博凯知识产权代理有限
公司 50212
代理人李海华(51)Int.Cl.
C02F 101/16(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)C02F 3/34(2006.01)C02F 3/02(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
一株阴沟肠杆菌及其应用(57)摘要
本发明公开了一株具有好氧反硝化功能的阴沟肠杆菌及其在废水处理中的应用。该菌株为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HNR，于2015年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.10348。上述阴沟肠杆菌可以在好氧的条件下，以有机碳为唯一碳源，NO3--N（硝酸盐氮）为唯一氮源，通过好氧反硝化作用将NO3--N转化为气态产物，实现氮素和有机碳的同步脱除。其对NO3--N的去除率高达90%~98%，对总氮的去除率可达85%~95%，对总有机碳的去除率在85%以上。该菌株可用于有机废水中NO3--N的有效脱除，具有全程好氧，脱氮效率高等特点。
权利要求书1页 说明书7页
序列表1页 附图4页
C N 1 0 5 1 1 2 3 3 7 A CN 105112337 A
权 利 要 求 书
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1.一株阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HNR，保藏编号为CGMCC No. 10348。
2.一株保藏号为CGMCC No. 10348的阴沟肠杆菌HNR在含硝酸盐的有机废水处理领域的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的废水的碳氮比为5~20。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的废水的碳氮比为10~15。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的废水pH值为5~10。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的废水pH值为7~9。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的废水的温度为20~40℃。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的废水的温度为20~30℃。9.根据权利要求3-8所述的任一应用，其特征在于，所述的废水的碳氮比为10~15、pH值为7~9、温度为20~30℃。
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说 明 书
一株阴沟肠杆菌及其应用
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技术领域
[0001] [0002]
本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一株阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HNR及其应用。
背景技术
传统的生物反硝化过程是指反硝化细菌在缺（厌）氧的条件下，将NO3-（硝酸盐）还
原成气态产物的过程。通常，在这一过程中，氧气的存在会使NO3-作为电子受体被还原的过程受到抑制。因此，反硝化需要在缺（厌）氧的条件下进行。随着研究的深入，好氧反硝化作用日益受到关注。人们发现反硝化过程不但可以在缺（厌）氧的条件下进行，还可以在好氧的条件下完成。具有好氧反硝化特性菌株的发现，如粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis），恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans），芽孢杆菌（Bacillus sp. ）和施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）等，为废水的生物脱氮引入了全新的概念。好氧反硝化细菌的发现使反硝化在好氧条件下进行成为可能，从理论上增加了含氮废水处理过程中硝化阶段与反硝化阶段在同一单元内同步进行的可能性，从而可大大减少废水处理设施或处理厂的占地面积和建设资金；此外，这类微生物以有机碳作为碳源生长繁殖，在脱氮同时可同步去除废水中的有机碳。这些发现可缓解传统处理工艺在处理效果与经济利益之间的矛盾，为实现废水高效而经济的处理提供了很好的理论基础。[0004] “一种新的好氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现”，孔庆鑫，《应用与环境生物学报》，2005.04中公开：利用间歇曝气富集和氰化钾选择培养基筛选到一株具有好氧反硝化功能的假单胞菌（Pseudomonas sp.）Y2-1-1，该菌株利用柠檬酸钠为碳源，硝酸钾为氮源在好氧条件下5天内将硝酸盐氮由282.0 mg/L降至148.2 mg/L，总氮去除率不足50%。“一株好氧反硝化菌的分类及特性研究”，朱月琪，《微生物学通报》，2009.04中公开：分离得到一株好氧反硝化细菌CY1，初步鉴定为泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus)，该菌株在厌氧和好氧条件下均具有反硝化能力，硝酸盐氮初始浓度为137.25 mg/L时，30h内硝酸盐氮去除率分别为99.89%（厌氧）和60.16%（好氧）。
[0005] 但至今为止对此类好氧反硝化菌的研究尚未完善，好氧反硝化作用的广泛性还需要进一步确定。因此，仍需要分离纯化得到更多的高效、稳定的好氧反硝化菌株。
[0003] [0006]
发明内容
[0007]
针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一株阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HNR及其应用，该阴沟肠杆菌HNR能够在完全好氧的条件下高效去除NO3--N（硝酸盐氮）并同步去除有机碳，因此在废水处理领域有着广泛的应用前景。[0008] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
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说 明 书
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本发明提供的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HNR，于2015年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.10348。本发明的阴沟肠杆菌HNR的16S rRNA 基因序列见序列表，序列长度为1336bp，在GenBank 中基因序列登陆号为KP308150。
[0009] 本发明的阴沟肠杆菌HNR在含硝酸盐的有机废水处理领域有广泛的应用前景。在完全好氧的条件下，该菌株可以利用NO3--N作为唯一的氮源进行好氧反硝化脱氮；其对NO3--N的去除率可达90~98%，对TN（总氮）的去除率可达85%~95%，对TOC（总有机碳）的去除率在85%以上。该菌株可用于废水中NO3--N和TOC的同步脱除，尤其适合于高C/N比（碳氮比）的有机废水的处理。
-[0010] 上述阴沟肠杆菌HNR应用于含NO3-N有机废水的处理时，所述废水C/N比为5~20，较优条件为10~15。
-[0011] 上述阴沟肠杆菌HNR用于含NO3-N有机废水的处理时，所述废水pH值为5~10，较优条件为7~9。
-[0012] 上述阴沟肠杆菌HNR用于含NO3-N有机废水的处理时，所述废水温度为20~40℃，较优条件为20~30℃。
-[0013] 上述阴沟肠杆菌HNR用于含NO3-N有机废水的处理时，最优选处理条件为废水的C/N比为10~15、废水pH值为7~9、废水温度为20~30℃。[0014] 与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的阴沟肠杆菌HNR中的硝酸盐还原酶活性高，可在好氧条件下表达，具有好氧反硝化功能；可利用多种有机碳源。[0015] 2、本发明的阴沟肠杆菌HNR具有在好氧条件下还原NO3--N的功能；同时，该菌株对高浓度的有机碳耐受性极佳，具有良好的有机碳去除能力。[0016] 3、本发明的阴沟肠杆菌HNR应用于废水处理领域，在完全好氧的条件下，该菌株可以利用NO3--N为唯一氮源进行好氧反硝化脱氮；其对NO3--N的去除率可达90~98%，对TN的去除率可达85%~95%，对TOC的去除率在85%以上。该菌株可用于废水中NO3--N和TOC的同步脱除，尤其适合于高C/N比有机废水的处理。[0017] 4、本发明的阴沟肠杆菌HNR是具有好氧反硝化功能的脱氮菌株。该菌株的应用可缓解传统含氮废水处理过程中反硝化阶段需要限制溶氧量的问题，使硝化阶段与反硝化阶段在同一好氧单元内同步进行成为可能，并同时实现有机碳的去除。将该菌株运用于水处理工艺，可减少占地面积，降低基建成本，提高处理效率，有效缓解传统生物脱氮工艺中处理效率与经济利益之间的矛盾，具有良好的社会及环保效益，应用前景广阔。
[0018]
附图说明
[0019]
图1为本发明的阴沟肠杆菌HNR扫描电镜图（放大倍数10000倍）；
图2为本发明的阴沟肠杆菌HNR在不同有机碳源条件下对TN的去除效果对比图；图3为本发明的阴沟肠杆菌HNR在不同C/N比条件下对TN的去除效果对比图；图4为本发明的阴沟肠杆菌HNR在不同pH条件下对TN的去除效果对比图；图5为本发明的阴沟肠杆菌HNR在不同温度条件下对TN的去除效果对比图；
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说 明 书
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图6为本发明的阴沟肠杆菌HNR在硝酸盐废水中的生长及对NO3--N、TN、TOC的去除效果对比图。
[0020]
具体实施方式
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。[0022] 实施例一
一、好氧反硝化菌株的筛选。
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[0023] 本发明所用活性污泥来自重庆市鸡冠石污水厂A/O工艺二沉池，好氧反硝化菌株的筛选采用平板划线法，其中液体培养条件为温度30～35℃，摇床转速90～120rpm；固体平板培养条件为生化培养箱温度30～35℃，具体按如下步骤操作：
1）将1mL从污水厂二沉池取来的污泥接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中富集培养24~72h，再取上述培养液1mL进行梯度稀释后，将不同梯度的稀释培养液分别接种到液体培养基Ⅰ的试管中形成若干组培养液，好氧培养24~72h；
2）测定步骤1）中各组培养液的pH值，吸取pH值降低最多的培养液少许，进行梯度稀释后，再将不同梯度的稀释培养液分别涂布于固体培养基Ⅰ所制的固体平板上，倒置培养2~3d；
3）挑取步骤2）中固体平板上菌落周围培养基颜色发生变化的单个菌落，分别于装有液体培养基Ⅱ的试管中进行好氧培养3~5d后，测定每个试管中NO3--N（硝酸盐氮）和TN（总氮）的去除效果，选取NO3--N和TN去除效果最好的培养液于固体培养基Ⅱ制成的平板上进行划线培养；
4）挑取单个菌落分别于装有液体培养基Ⅱ的试管中，好氧培养3~5d，选取NO3--N和TN去除效果最好的培养液于固体培养基Ⅱ上平板划线；
5）重复步骤4），直至获取一株对NO3--N和TN去除效果稳定的菌株，命名为HNR，该菌株具有好氧反硝化性能。
[0024] 其中涉及的培养基的构成分别为：
牛肉膏蛋白胨液体培养基的构成为（每升）：蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，pH=7.0~8.0；
液体培养基Ⅰ构成为（每升）：硝酸钾0.5778g，柠檬酸三钠-C（即柠檬酸三钠中的碳，下同）200mg，葡萄糖-C 200mg，琥珀酸钠-C 200mg，乙酸钠-C 200mg，NaCl 4g，六种微量元素水溶液各3～5mL，pH=7.0～8.0；
固体培养基Ⅰ是在液体培养基Ⅰ中加入溴百里酚蓝试剂（0.1～0.3g溴百里酚蓝溶于10~15mL无水乙醇中），琼脂粉15~20g制成；
液体培养基Ⅱ的构成为（每升）：硝酸钾0.5778g，葡萄糖-C 800mg，NaCl 4g，，六种微量元素水溶液各3~5mL，pH=7.0~8.0；
固体培养基Ⅱ是在液体培养基Ⅱ中加入琼脂粉15~20g制成；所述的六种微量元素水溶液构成为（每升）：MgSO4·7H2O 3.0135g，MnSO4·H2O 3.36g，H3BO3 1.12g，ZnSO4·7H2O 3g， FeSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.6g。[0025] 二、好氧反硝化菌株HNR的鉴定。
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说 明 书
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菌株HNR为革兰氏阴性粗短杆菌，菌体宽为0.6~1.0μm、长为1.2~2.0μm，其扫描电镜形态见附图1；在普通牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上生长形成表面光滑、大而湿润的黏液状菌落，菌落直径2~5mm、半透明、圆形、凸起、有核。其具体生理特性见表1。[0027] 该菌株的16S rRNA 基因序列见序列表，序列长度为1336bp，在Gen Bank中基因序列登陆号为KP308150。将该序列在GenBank中进行比对，结果显示与Enterobacter cloacae的序列相似性最高。结合细菌形态特征和生理生化特征，该菌株属于阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），并命名为Enterobacter cloacae HNR。[0028] 表1 菌株HNR生理生化特性
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说 明 书
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注：“+”：阳性，“-”：阴性
本发明所提供的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）HNR，于2015年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.10348。
[0029]
实施例二
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说 明 书
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阴沟肠杆菌HNR在不同碳源条件下对TN的去除效果检测。
-[0030] 在以NO3-N作为唯一的氮源（初始浓度为100 mg/L）， C/N比（碳氮比）为10，pH为7，温度为30℃的好氧条件下，分别选用乙酸钠、丁二酸钠、葡萄糖、柠檬酸三钠、琥珀酸钠作为碳源，利用阴沟肠杆菌HNR进行反应。结果表明菌株HNR能够利用多种碳源，尤其以葡萄糖为最优碳源进行好氧反硝化。在以葡萄糖作为碳源时TN去除率可达到85%以上。其结果见图2。
[0031] 实施例三
阴沟肠杆菌HNR在不同C/N比条件下对TN的去除效果检测。
-[0032] 在以NO3-N作为唯一的氮源（初始浓度为100 mg/L），葡萄糖为碳源，pH为7，温度为30℃的好氧条件下，分别考察阴沟肠杆菌HNR在不同C/N比时对TN的去除效果。结果表明菌株HNR在C/N比为10~15时TN去除效果较优。当C/N比为10时，TN去除率可达到90%左右。其结果见图3。[0033] 实施例四
阴沟肠杆菌HNR在不同pH条件下对TN的去除效果检测。
-[0034] 在以NO3-N作为唯一的氮源（初始浓度为100 mg/L），葡萄糖为碳源，C/N比10，温度为30℃的好氧条件下，分别考察阴沟肠杆菌HNR在不同pH时对TN的去除效果。结果表明菌株HNR在pH为7~9时TN去除效果较优。当pH为7时，TN去除率可达到90%左右。其结果见图4。
[0035] 实施例五
阴沟肠杆菌HNR在不同温度条件下对TN的去除效果检测。
-[0036] 在以NO3-N作为唯一的氮源（初始浓度为100 mg/L），葡萄糖为碳源，C/N比10，pH为7的好氧条件下，分别考察阴沟肠杆菌HNR在不同温度时对TN的去除效果。结果表明菌株HNR在温度为20~30℃时TN去除效果较优。当温度为30℃时，TN去除率可达到90%左右。其结果见图5。[0037] 实施例六
阴沟肠杆菌HNR的好氧反硝化性能检测。[0038] 配制模拟废水：葡萄糖4.4g，硝酸钾0.7223g，NaCl 4g，六种微量元素溶液各3mL，pH 7.0~7.5。其中六种微量元素水溶液由MgSO4·7H2O 3.0135g，MnSO4·H2O 3.36g，H3BO3 1.12g，ZnSO4·7H2O 3g，FeSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.6g溶于1000mL H2O所得。
-[0039] 将阴沟肠杆菌HNR在NO3-N初始浓度为110mg/L，C/N比为10，pH为7，温度为30℃条件下好氧培养30h。阴沟肠杆菌HNR菌株的生长（OD600）及其对NO3--N、TN、TOC（总有机碳）的去除情况如图6所示。阴沟肠杆菌HNR菌株在该人工配水中生长良好，NO3--N去除率达到98%，TN去除率大于90%，TOC去除率大于85%。表明菌株HNR对高C/N比的含硝酸盐废水具有良好的处理能力。
[0040] 通过实施例二至六可以看出，本发明的阴沟肠杆菌HNR具有在好氧条件下还原NO3--N的功能。同时，该菌株可利用多种有机碳源，对高浓度的有机碳耐受性极佳，具有良好的有机碳去除能力。本发明阴沟肠杆菌HNR应用于污水处理领域，在完全好氧的条件下，该菌株可以利用NO3--N为唯一氮源进行好氧反硝化脱氮；其对NO3--N的去除率可达90~98%，对TN的去除率可达85%~95%，对TOC的去除率在85%以上。该菌株可用于废水中硝酸盐和
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有机碳的同步脱除，尤其适合于高C/N比有机废水的处理。
[0041] 本发明的阴沟肠杆菌HNR是具有好氧反硝化功能的脱氮菌株。该菌株的应用可缓解传统含氮废水处理过程中反硝化阶段需要限制溶氧量的问题，使硝化阶段与反硝化阶段在同一好氧单元内同步进行成为可能，并同时实现有机碳的去除。将该菌株运用于水处理工艺，可减少占地面积，降低基建成本，提高处理效率，有效缓解传统生物脱氮工艺中处理效率与经济利益之间的矛盾，具有良好的社会及环保效益，应用前景广阔。[0042] 本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
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序 列 表
<110> 重庆大学
<120> 一株阴沟肠杆菌及其应用<130> 说明书<160> 1
<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 1336<212> DNA
<213> Enterobacter cloacae<400> 1
agcggcggac gggtgagtaa tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga 60aacggtagct aataccgcat aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg 120ccatcagatg tgcccagatg ggattagcta gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac 180gatccctagc tggtctgaga ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact 240cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc 300cgcgtgtatg aagaaggcct tcgggttgta aagtactttc agcggggagg aaggtgttga 360ggytaataac ctcagcaatt gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca 420gcagccgcgg taatacggag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac 480gcaggcggtc tgtcaagtcg gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcga 540aactggcagg ctagagtctt gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg 600tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag 660gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 720gtcgacttgg aggttgtgcc cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc 780gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc 840ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca 900gagaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct 960gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc 1020tttgttgcca gcggttaggc cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa 1080ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat 1140ggcgcataca aagagaagcg acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag 1200tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca 1260gaatgctacg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt 1320gggttgcaaa agaagt 1336
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