(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109207627 A(43)申请公布日 2019.01.15
(21)申请号 201811292635.8(22)申请日 2018.10.26
(71)申请人 中国药科大学
地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大
道639号(72)发明人 尹鸿萍 王莹 邢星伟 (51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页 附图3页
(54)发明名称
一种新颖快速真菌检测试剂盒(57)摘要
本发明公开了一种真菌检测试剂盒，其包括真菌DNA提取试剂、环介导恒温扩增引物和显色剂。本发明包括简便的DNA提取方法，设计独特的LAMP四条引物，并用pH显色剂进行视觉观察，建立能够同时检测所有真菌的方法。该试剂盒具有灵敏性与特异性，对临床真菌感染的鉴定有重要意义。
CN 109207627 ACN 109207627 A
权 利 要 求 书
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1.一种新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于：包括DNA的提取试剂，引物组，LAMP扩增组分。
2.根据权利要求1所述的新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于：所述的DNA提取试剂组成：
溶液I：20mM/L-100mM/L Tris，10mM/L-50mM/L EDTA和4-8M/L盐酸胍，pH 4.0-8.0；10-50mg/ml蜗牛酶；溶液II：β-巯基乙醇；溶液III：75％-95％乙醇；溶液IV：ddH2O，pH 7.0-9.0。
3.根据权利要求1所述的新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于：引物序列如下：外引物F3：5’-GGAGAGGGAGCCTGAGAA-3’；外引物B3：5’-CTGCTGGCACCAGACTTG-3’；内引物FIP：5’-ACCTCCCCGTGTCGGGATTG-CGGCTACCACATCCAAGGA-3’；内引物BIP：5’-CGATACAGGGCCCTTTTGGGT-CCCTCCAATTGTTCCTCGTT-3’。
4.根据权利要求1所述的新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于：还包括：RNase-free water、10×Buffer、10mM/LdNTP、100mM/L MgSO4、8U/μL Bst DNA聚合酶和1mM/L-5mM/L中性红溶液。
5.根据权利要求4所述的新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于：10×Buffer包括：0.1 1mM Tris、50mM KCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、50％(V/V)甘油和0.1％(V/V)Triton X-100，pH 7.5-9.0。
6.根据权利要求1所述的新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于：所述两条内引物FIP和FIP浓度为40μM/L，所述两条外引物F3和B3浓度为5μM/L。
7.一种新颖快速真菌检测试剂盒，其特征在于，包括步骤：(1)DNA提取；
(2)配置LAMP反应体系，加入10×Buffer、dNTP、MgSO4、内引物FIP和BIP、外引物F3和B3、Bst DNA聚合酶、中性红溶液、RNase-free water和样本模版；
(3)结果判断：紫色表明是阳性，黄色表明是阴性。
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说 明 书
一种新颖快速真菌检测试剂盒
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技术领域
[0001]本发明属于生物医学诊断领域，具体涉及一种新颖快速真菌检测试剂盒。背景技术
[0002]近年来，由于人口老龄化、器官移植、肿瘤放化疗、造血干细胞移植、超广抗生素的应用以及各种导管介入治疗等，真菌感染发病率逐年上升。根据感染的部位可分为浅部感染和深部感染，浅部感染包括皮肤、黏膜、指甲、毛发、皮下组织等，深部感染包括肺部、血液、胃肠道等器官和组织感染。目前对真菌感染有效的治疗方法仍然是使用抗生素，所以对疾病准确及时的诊断是非常重要的。[0003]目前，临床上诊断真菌感染的方法依靠常规的显微镜镜检、微生物培养、G试验和GM试验。直接镜检虽然快速、简便，但检出率低，会出现假阴性，假阴性不能排除真菌感染的可能，通常需要与微生物培养的方法联合鉴定，但培养的方法耗时长达5-7天，个别真菌培养甚至20天之久。G试验和GM试验虽然特异性强，但检出假阳性高。目前有用分子生物学方法进行检测，最多的用PCR进行检测，该方法能够进行快速检测，可以检测出一定量的病原菌，而对于极微量的真菌感染并不能检出，并且用PCR扩增需要的时间久，扩增完需要用电泳的方法进行检测，不能进行视觉观察，这就可能造成检测房间的污染，增加了下次检测出现假阳性的可能。[0004]近年来，环介导恒温扩增技术(Loop-mediated temperature amplification，LAMP)广泛应用于各种疾病感染的诊断，该方法可以快速、灵敏的检测出病原菌，并且可以加入显色剂，如使用钙黄绿素时溶液会由黄色变为荧光绿色，使用羟基萘酚蓝溶液会由紫色变为蓝色，但是钙黄绿素和羟基萘酚蓝的显色差异不明显，用肉眼不易判断。[0005]本研究通过设计针对真菌的DNA提取方法，将提取的DNA直接加入到扩增反应体系，加热进行反应，最后视觉检测。我们所采用的显色方法为在反应体系中加入中性红显色剂，在低Tris浓度缓冲液条件下，可以进行视觉观察检测结果。发明内容
[0006]本发明需要解决的技术问题是，提供一种新颖快速真菌检测试剂盒，实现对常见真菌的快速检测与鉴定。本发明实现目的的技术方案如下：[0007]一种新颖快速真菌检测试剂盒，它包括：[0008](1)提取试剂组成：溶液I、溶液II、溶液III、溶液IV；[0009]所述的溶液I包括Tris，EDTA和盐酸胍，用之前将蜗牛酶加进去。蜗牛酶的浓度范围在10mg/ml-50mg/ml，其可以溶解真菌细胞壁，有利于后面细胞的破碎。其中Tris的浓度范围为20mM/L-100mM/L，其作用是提供缓冲环境，使溶液的pH保持在一定范围内；EDTA的浓度范围为10mM/L-50mM/L，可以螯合二价金属离子，可以抑制核酸内切酶的活性。盐酸胍是高离盐，在浓度为4-8M/L范围下，可以中和DNA和硅胶膜表面的负电荷，有利于DNA和硅胶膜之间形成氢键，同时高离盐环境可以使细胞膜破碎，使DNA暴露出来，此溶液需要保持在pH
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说 明 书
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4.0-8.0之间。溶液II为β-巯基乙醇，终浓度为0.4％-2.5％的β-巯基乙醇可以使真菌细胞壁更加松散，容易使真菌细胞在蜗牛酶的作用后破壁。溶液III为75％-95％乙醇，乙醇的作用为可以将离心柱上边的杂质洗脱下来，因为细胞破碎后有许多变性蛋白质及多糖；另外在此浓度下乙醇可以使DNA沉淀，使其牢固地结合在硅胶膜上，但在洗脱DNA前需要乙醇挥发完全，在乙醇的存在下影响后续扩增反应；溶液IV为ddH2O，pH 7.0-9.0时，水可以破坏DNA与硅胶膜之间的氢键，由于DNA与硅胶膜之间有静电斥力，所以可以将DNA洗脱下来。[0010](2)反应液：10×Buffer、10mM/L dNTP、100mM/L MgSO4、8U/μL Bst DNA聚合酶、1mM/L-5mM/L中性红溶液、RNase-free water。[0011]一种新颖快速真菌检测试剂盒，其引物序列包括：[0012]外引物F3：5’-GGAGAGGGAGCCTGAGAA-3’；外引物B3：5’-CTGCTGGCACCAGACTTG-3’；内引物FIP：5’-ACCTCCCCGTGTCGGGATTG-CGGCTACCACATCCAAGGA-3’；内引物BIP：5’-CGATACAGGGCCCTTTTGGGT-CCCTCCAATTGTTCCTCGTT-3’；[0013]上述快速真菌检测试剂盒包括如下步骤：[0014](1)提取真菌DNA：将培养的菌悬液离心取沉淀，加入溶液I，混匀裂解，裂解后将混合液加入到离心柱中；离心后加入乙醇洗涤，干燥；加入水进行DNA的洗脱：[0015](2)以(1)中提取的DNA为模版，利用四条引物进行LAMP扩增；[0016](3)观察(2)中扩增管颜色变化。[0017]步骤(2)中，所述的扩增体系包括：10×Buffer 2.5μl、10mM/L dNTP 3.5μl、100mM/L MgSO4 1.5μl、Bst DNA聚合酶8U、40μM/L内引物BIP和FIP 1μl、5μM/L外引物F3和B3 1μl、模版DNA 1μl、1mM/L-5mM/L中性红溶液1μl、加RNase-free water至25μl；LAMP扩增条件：60-65℃，30-60min。[0018]有益效果：[0019](1)本发明通过在NCBI基因库比对多种真菌的18SrDNA基因序列，在保守位点设计的特异性引物，能够对临床常见的致病真菌进行特异性扩增。[0020](2)本发明所述的新颖快速真菌检测试剂盒具有高灵敏性、特异性、操作简便和高通量的有点，可以辅助临床快速诊断真菌感染情况。[0021](3)本发明所用的显色剂结果对比明显，优于其他显色剂。附图说明
[0022]图1为白色念珠菌DNA提取-LAMP结果电泳图[0023]图2为白色念珠菌DNA提取-LAMP结果显色图[0024]图3为LAMP检测限结果电泳图[0025]图4为LAMP检测限结果显色图
[0026]图5为LAMP引物特异性(真菌DNA)电泳图[0027]图6为LAMP引物特异性(真菌DNA)显色图[0028]图7为LAMP引物特异性(非真菌DNA)电泳图[0029]图8为LAMP引物特异性(非真菌DNA)显色图
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具体实施方式
[0030]本发明提供了一种新颖快速真菌检测试剂盒，为使本发明的目的、技术方案和效果更加清楚，以下结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅为了解释本发明，并不限定于本发明。[0031]实施例1：试剂组成[0032](1)DNA提取试剂[0033]溶液I、溶液II、溶液III、溶液IV。溶液I含有20mM/L-100mM/L Tris，10mM/L-50mM/L EDTA，4-8M/L盐酸胍，用之前加入10mg/ml-50mg/ml蜗牛酶，pH 4.0-8.0；溶液II为β-巯基乙醇；溶液III为75％-95％乙醇；溶液IV为ddH2O，pH 7.0-9.0。[0034](2)LAMP扩增组分[0035]10×Buffer、10mM/L dNTP、100mM/LMgSO4、8U/μL Bst DNA聚合酶、1mM/L-5mM/L中性红溶液、RNase-free water。[0036]实施例2：应用实施例1试剂盒进行检测[0037](1)真菌DNA的提取，以培养白色念珠菌为例，具体步骤如下：[0038](1a)取培养至1-9×107CFU/ml菌悬液1ml，8000r离心1min；[0039](1b)去除上清后，加入300μl溶液I，0.4％-2.5％溶液II，37℃保温30min，8000r离心1min；[0040](1c)将混合液加入离心柱，8000r离心1min；加入500μl溶液III，10000r离心2min，开盖室温放置使残留溶液挥发完全；[0041](1d)加入20μl溶液IV，10000r离心1min。[0042](2)以(1)中提取的DNA为模版，利用四条引物进行LAMP扩增；[0043]所述的扩增体系包括：10×Buffer 2.5μl、10mM/LdNTP 3.5μl、100mM/L MgSO4 1.5μl、Bst DNA聚合酶8U、40μM/L内引物BIP和FIP 1μL、5μM/L外引物F3和B3 1μl、模版DNA 1μl、1mM/L-5mM/L中性红溶液1μl、加RNase-free water至25μl；LAMP扩增条件：60-65℃，30-60min。[0044](3)将(2)中扩增完的混合液进行电泳或显色观察。结果如图1和图2，表明该方法可以将DNA提取出来。[0045]实施例3：敏感性实验[0046](1)梯度稀释后进行DNA的提取，步骤如下：[0047](1a)将1ml浓度为1-9×107CFU/ml白色念珠菌10倍梯度稀释8个梯度，8000r离心1min；；[0048](1b)去除上清后，加入300μl溶液I，0.4％-2.5％溶液II，37℃保温30min，8000r离心1min；[0049](1c)将混合液加入离心柱，8000r离心1min；加入500μl溶液III，10000r离心2min，开盖室温放置使残留溶液挥发完全；[0050](1d)加入20μl溶液IV，10000r离心1min。[0051](2)以(1)中提取的DNA为模版，利用四条引物进行LAMP扩增；[0052]所述的扩增体系包括：10×Buffer 2.5μl、10mM/LdNTP 3.5μl、100mM/L MgSO4 1.5μl、Bst DNA聚合酶8U、40μM/L内引物BIP和FIP 1μL、5μM/L外引物F3和B3 1μl、模版DNA
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1μl、1mM/L 5mM/L中性红溶液1μl、加RNase-free water至25μl；LAMP扩增条件：60-65℃，30-60min。[0053](3)将(2)中扩增完的混合液进行电泳或显色观察。结果如图3、图4，灵敏度可以达到10CFU以下。[0054]实施例4：引物特异性实验[0055](1)对白色念珠菌、酵母菌、黑曲霉，毛霉，黑根霉、青霉进行培养；[0056](1a)取浓度为1-9×107CFU/ml的真菌溶液1ml，8000r离心1min；[0057]去除上清后，加入300μl溶液I，0.4％-2.5％溶液II，37℃保温30min，8000r离心1min；[0058](1c)将混合液加入离心柱，8000r离心1min；加入500μl溶液III，10000r离心2min，开盖室温放置使残留溶液挥发完全；[0059](1d)加入20μl溶液IV，10000r离心1min。[0060](2)对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行培养；[0061](2a)取浓度为1-9×107CFU/ml的细菌溶液1ml，8000r离心1min；[0062]去除上清后，加入300μl溶液I，溶液I中不加入蜗牛酶，再加入0.4％-2.5％溶液II，37℃保温30min，8000r离心1min；[0063](2c)将混合液加入离心柱，8000r离心1min；加入500μl溶液III，10000r离心2min，开盖室温放置使残留溶液挥发完全；[0064](2d)加入20μl溶液IV，10000r离心1min。[0065](3)以(1)和(2)中提取的DNA为模版，利用四条引物进行LAMP扩增；[0066]所述的扩增体系包括：10×Buffer 2.5μl、10mM/LdNTP 3.5μl、100mM/L MgSO4 1.5μl、Bst DNA聚合酶8U、40μM/L内引物BIP和FIP 1μL、5μM/L外引物F3和B3 1μl、模版DNA 1μl、1-5mM/L中性红溶液1μl、加RNase-free water至25μl；LAMP扩增条件：60-65℃，30-60min。[0067](4)将(3)中扩增完的混合液进行电泳或显色观察。结果如图5、图6、图7和图8，表明特异性较好。
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