凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ２００８ＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆＶｅｍｆｉｎａｒｙＤｒｕｇＢｒａｎｃｈ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量陈智慧１，史梅１，王秋香２，张晓红２（１．新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐８３００６３；２．新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐８３００５２）［摘要］为了更加精确的运用凯氏定氮法检测分析食品中蛋白质的含量，本文分别用全量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法和凯氏自动定氮仪来测定了食品中的蛋白质的含量，结果发现用两种方法对同一样品中的蛋白质含量得出数值高低不同，全量凯氏定氮法的结果更加精确，微量法次之。［关键词］凯氏定氮法；精确；含量；蛋白质ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｔｅｎｔｉｎＦｏｏｄｓＣＨＥＮＺｈｉ—ｈｕｉｌ，ＳＨＩＭｅｉｌ，ＷＡＮＧＱｉｕ—ｘｉａｎ９２，ＺＨＡＮＧＸｉａｏ—ｈｏｎ９２Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｍｏｒｅｐｒｅｃｉｓｅｖｏｌｕｍｅｕｓｅｏｆＫｊｅｌｄａｈｌｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｆｏｏｄ，ｗｅｗｅｒｅｉｎｆｕｌｌＫｊｅｌｄａｈｌ，ｔｒａｃｅＫｊｅｌｄａｈｌｌａｗａｎｄＫａｙ奄ａｕｔｏｍａｔｉｃｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｆｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄｆｏｕｎｄｔｗｏｗａｙｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｄｒａｗｎｈｉｇｈａｎｄｌｏｗｖａｌｕｅｓ，ａｌｌｏｆＫｊｅｌｄａｈｌｍｅｔｈｏｄｍｏｒｅａｃｃｕｒａｔｅｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｒａｃｅｏｆｔｉｍｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｋｊｅｌｄａｈｌ；ａｃｃｕｒａｔｅ；ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｏｏｄ；ｐｒｏｔｅｉｎ测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算，如密度、折射率、紫外吸收、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算，如定氮、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂反应等，主要测定方法有：双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、紫外分光光度法、水扬酸比色法、折光法、旋光法、近红外光谱法。目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，是通过测总氮量来确定蛋白质含量的方法。凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物．凯氏定含量测定。凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛Ｍｊ。在理化实验室，检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法，接下来以大量的试验来比较微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小。１材料与方法１．１试验材料肉禽制品（牛肉、马肉、荤饺子氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法∞Ｊ。至今仍被作为标准检验方法．此法可应用于各类食品中蛋白质－２９６・１．１．１试验样品馅）；豆制品（豆腐乳）；调味品（鸡精）；乳制品（纯牛奶）；糕点（面包）；植物蛋白饮料（椰汁）；冷饮及冰制品（雪糕、冰激淋）。１．１．２试验药品和试剂所有试剂均为分析纯；首届中国兽药大会水为蒸馏水或同等纯度的水；硫酸铜；硫酸钾；浓硫酸；４０％氢氧化钠溶液：称取４０ｇ氢氧化钠溶于６０ｍＬ蒸馏水中；４％硼酸溶液：称取４ｇ硼酸溶于蒸馏水中稀释至１００ｍＬ；０．１ｍｏｉ／Ｌ盐酸标准滴定溶液；甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（１ｇ／Ｌ）与甲基红乙醇溶液（１ｇ／Ｌ）按ｌ＋２体积比混合。１．１．３仪器和设备凯氏烧瓶５００ｍＬ；可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；铰肉机：篦孔径不超过４ｎｍ；组织捣碎机；粉碎机；研钵：玻璃或瓷质；化学消化器；凯氏定氮仪；空气滤过器。１．２试验方法１．２．１微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法的原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的１／１０加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定旧Ｊ。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。１．２．２全量凯氏定氮法全量凯氏定氮法的原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的全部加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。２分析过程试样制备。固体样品：取有代表性的样品至少２００ｇ，用研钵捣碎、研细，不易捣碎、研细的样品应切（剪）成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少２００ｇ；粉状样品：取有代表性的样品至少２００ｇ（如粉粒较大也应用研钵研细），混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少２００ｇ，混合均匀；固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少２００ｇ，用组织捣碎机捣碎，混合均匀；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少２００ｇ，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。上述试样应放入密闭玻璃容器中，于４０Ｃ冰箱内贮存备用，尽快测定。２．１微量凯氏定氮法的分析过程２．１．１样品消化步骤：准确称取一定量的样品，中国畜牧兽医学会动物药品学分会２００８学术年会论文集加入硫酸铜０．５ｇ、硫酸钾１０ｇ和浓硫酸２０ｍＬ、玻璃珠数粒－＋小心移入干燥洁净的５００ｍＬ凯氏烧瓶中（固体或粉末用纸卷成纸筒送入），轻轻摇匀，以４５７斜支于有小孔的石棉网上＿＋用电炉以小火加热（或先烧瓶放在距电炉较远处），待内容物全部炭化、泡沫停止产生后＿＋加大火力（或将烧瓶放在电炉上），保持瓶内液体微沸－＋至液体变蓝绿色透明后＿＋继续加热微沸３０ｍｉｎ＿＋关闭电炉，取下烧瓶、冷却－十转移至１００ｍＬ容量瓶中，加水定容。２．１．２蒸馏与吸收按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至２／３容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入１０ｍＬ４０ｇ／Ｌ硼酸及２滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液１０ｍＬ于反应管内，经漏斗再加入１０ｍＬ氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏１０ｍｉｎ，将冷凝管尖端提离液面继续蒸ｌｍｉｎ。２．１．３滴定将接受瓶内的硼酸液用０．０ｌｍｏｌ／Ｌ盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。２．１．４结果计算形：竺盟！皇婴唑塑×１００ｍ×而ｌＵ式中：ｗ一蛋白质的质量分数（％）；ｃ一盐酸标准溶液的浓度（ｍｏｌ／Ｌ）；Ｈ一空白滴定消耗标准液量（ｍＬ）；屹一试剂滴定消耗标准液量（ｍＬ）；ｍ一样品质量（ｇ）；０．０１４一氮的毫摩尔质量（ｇ／ｍｍ０１）；Ｆ一蛋白质系数（表１）。表１几类常见食物的蛋白换算系数食品种类小麦一５小麦粉及其制品５大麦、燕表、黑麦５米５花生５大豆及其制品５畜禽肉及其制品６乳及乳制品６芝麻、向日葵子、南瓜子５栗、胡桃５其他食品６计算结果精确至小数点后第二位。同一试样做・２９７・Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ２００８ＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇＢｒａｎｃｈ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ两次平行试验，同时做空白试验。２．２全量凯氏定氮法的分析过程２．３２．３．１自动凯氏定氮仪的分析过程样品消化准确称取一定量的样品，加入２．２．１样品消化同“微量法”。２．２，２硫酸铜０．５ｇ、硫酸钾１０ｇ和浓硫酸２０ｍＬ、小心移蒸馏与吸收安装好全量定氮蒸馏装置。人与化学反映器配套的消化管内，置于化学反映器上消化，同时打开空气过滤器，预约消化温度为４１０℃，预约时间为１８０ｍｉｎ，到达预约时间后，化学于水蒸气发生瓶内装水至２／３容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加人数粒玻璃珠。在接受瓶中加入４０ｍＬ４０ｇ／Ｌ硼酸及反映器自动停止加热，冷却至室温。２．３．２蒸馏、吸收、滴定、计算打开凯氏定氮仪和冷凝水开关，检查机器与试剂的连接是否完好，将样品的质量和蛋白质系数输入系统，把装有冷却消化液的消化管连接在凯氏定氮仪上，按下“ＥＮ－ＴＥＲ”键，约５ｍｉｎ后，打印出此样品相关信息的屏条，将直接显示样品中蛋白质的百分含量。３试验结果和分析３滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。将全部消化液转移于反应管内，加入１２５ｍＬ蒸馏水，摇匀后再加入４０ｍＬ氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏１０ｍｉｎ，将冷凝管尖端提离液面继续蒸１ｍｉｎ。２．２．３滴定同“微量法”。２．２．４计算通过实验得到的蛋白质含量数据如表２所示。石（％）：！！二垦！兰竺：Ｑ！兰兰！×Ｆ×１００表２蛋白质含量数据微量法微星法全量法全量法自动定氮仪自动定氮仪（芝！塑！垒纯牛奶豆腐乳蛋糕冰激淋马肉２．９８６６．８０２５．７４１３．６７２１５．７３２ｌ芝！塑！曼３．１０６６．７８１５．７２０！《！塑９２垒３．１０３ｆ芝！塑９２璺３．１５５７．２４５６．３４１４．４６５１６．７２４４９．４１５１．２０４！《！塑９２垒３．２０６７．４０５６．６４４４．５７３１７．７３３Ｉ么！塑９２曼３．２０６７．４０６６．６４３３．６７２１７．７３４７．２０２６．３４２４．４７１１６．７３３４８．４０９１．１９２１．５０ｌ３．６４５１５．７２０４５．４０ｌ１．１３０１．２７４棉柏４５．４１２含乳饮料椰汁１．１０３５０．４１９，５０．４１８１．２３４１．６０８１．２７８１．３０２１．５９４１．６４２分析：微量凯氏定氮法所测定的样品平行样间平均差别为：Ｏ．１２０８；全量凯氏定氮法所测定的样品平行样问平均差别为：Ｏ。０３５３；微量凯氏定氮法的测定结果与自动定氮仪的平均差别为：０．７６９７；全量凯氏定氮法的测定结果与自动定氮仪的平均差别为：０．０５２３。差别较大。４．２通过比较传统凯氏定氮法中的微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法可以看出，后者的数据高于前者，精密度高于后者，是由于前者在实验的过程中转移的次数较多，误差较大。４．３通过比较以上三组数据可以得知：凯氏定氮仪的的精密度最高，微量凯氏定氮法的最低；全量凯氏定氮法得到的数据和凯氏定氮仪的数据差别较小，准确度高。４．４量取的样品倒入凯氏烧瓶时，不要将样品粘在瓶颈上，以免加入消化液后试样炭化粘在瓶颈上消化不彻底，消化过程中要逐渐升温，当低温加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升温使溶液沸腾，但应避免剧烈沸腾。４．５消化液加蒸馏水稀释后，应及时蒸馏，否则应４讨论４．１通过比较传统凯氏定氮法和凯氏自动定氮仪所测定出的食品的蛋白质含量可以看出，用传统的凯氏定氮法所测定的蛋白质含量比凯氏自动定氮仪测出的结果偏低，前者两次测定的同一食品的蛋白质含量差别较后者大，即样品的平行性平行性不够好，精密度不高，是由于在传统定氮的过程中存在着样品消化液的转移，在转移的过程中有误差的存在，导致消化液的流失，从而测定的数据稍偏低，・２９８．首届中国兽药大会保存消化液，临用时再加蒸馏水稀释．反应室加入碱液后，应立即盖塞并加水封，注意各接头处的密封情况，防止漏气。４．６蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用。若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀．所以加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。４．７蒸气发生瓶内的水装至三分之二体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。４．８因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以蒸馏时，蒸气要发生均匀，充足，蒸馏中不得停火断气，否则会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸Ｉｍｉｎ后关掉热源。蒸馏是否完全，可用精密ＰＨ试纸测冷凝管口的冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。５结论５．１由于凯氏定氮法的误差，主要因消化操作的条件而产生，因此要格外注意。５．２全量凯氏定氮法的准确度和精密度比微量凯氏定氮法高，即精确度高。５．３凯氏自动定氮仪的误差较传统的凯氏定氮法小，精密度高，因而精确度最高。５．４在实际的生产实验中，凯氏定氮法作为一种国家标准，应该严格按照标准的分析试剂、用量及分析过程来操作。中国畜牧兽医学会动物药品学分会２００８学术年会论文集参考文献：Ｃ１］陆卫明，尹华。用蛋白质测定仪测定食品中的蛋白质［Ｊ】。江苏预防医学；２００７，１．【２】姚军，郝琳．凯氏袤ｌ／蛋白质测定仪测定食品中蛋白质［Ｊ】．中国卫生检验杂志，２００１，（２）；１９０．［３］张继红．自动定氮仪测试技术在食品中蛋白质测定的综述评价［Ｊ］．广州食品工业科技，２００４，（２）：２４—２６．【４］刘红梅．新型蛋白质测定仪测定食品中蛋白质［Ｊ］．预防医学情报杂志，２００３，（３）；８４．［５］王雪松，曹德秋．日常饮用的几种牛奶中酪蛋白含量的测定［Ｊ］．齐齐哈尔医学院学报，２００８，（３）：３４—３６．［６】中国乳制品工业行业规范ＲＨＢ６０１－２００５生鳞牛初乳【Ｊ］．新疆畜牧业，２００６，（２）：１４—２６．［７］张蓉蓉．乳品企业原料乳的验收与质量控制［Ｊ］．中国乳业，２００６，（７）：８—２０．［８］尹家振．影响牛奶蛋白质和脂肪含量的因素及调整措施［Ｊ］．新疆畜牧业，２００６，（６）：２４—３６．［９］陈魏勇．冰淇淋品质的不良表现及其原因［Ｊ］．农产品加工，２００７，＜１１）．［１０］ＯｗｅｎＲ．Ｆｅｎｎｅｍａ．王璋，许时耍，江波，等译．食品化学（ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）［Ｍ］．第３版．北京：中国轻工业出版社，１２４—２２６．［１１】张朝武．现代卫生检验［Ｍ］．北京：人民卫生出版杜，２００５：２４—５６．［１２］李建武等编．生物化学实验原理和方法［Ｍ］．北京：北京大学出版社。１９９４：１４—２６．［１３］胡宏纹．有机化学［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００１：１２４—１５６．［１４］张洪渊等。生物化学教程［Ｍ］．第２舨，成都：四』ｌ｝大学出版社，１９９４：７４—９６．［１５】北京师范大学生物系．基础生物化学实验［Ｍ］．第２版．北京：高等教育出版社，１９９９：８４—１２６．［１６］Ｖｏｅｔ．Ｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２蚵ｅｄｉｔｉｏｎ）．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ．Ｉｎｅ．Ｎ．Ｙ．１９９５：１２４—１７２．［１７］Ａｌｂｅｒ随．Ｂ．ｅｔ越Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌ（３“ｅｄｉｔｉｏｎ），ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎＳ．Ｉｎｅ．Ｎ．Ｙ．１９９４：２７—８６．・２９９・用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量

作者：作者单位：

陈智慧， 史梅， 王秋香， 张晓红

陈智慧,史梅(新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐,830063)， 王秋香,张晓红(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐,830052)

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