DNA提取与检测

2.1.2 试剂及溶液

（1）DNA提取缓冲液按100ml(pH 8.0)

Tris-HCl 100 mmol/L 1.211g，

EDTA 50 mmol/L 1.4615g，

1% SDS 1g，

NaCl 500 mmol/L 2.922g ；

配试剂：提取缓冲液=70ML蒸馏水+ Tris-HCl+ EDTA+ 1% SDS+ NaCl

注：没加完一种试剂必须等它完全溶解后方可加入下一种试剂，当加完EDTA后可调节溶液的PH值。用1%mol/L NaOH和1%mol/L HCl调节PH至8.0

（2）醋酸钾(KAc) 3 mol/L 29.442g（用蒸馏水定容至100ML）

（3）蛋白酶K 20 mg/mL 10Mg Pr+500UL ddH2O

（4）无水乙醇；

（5）75%乙醇；

（6）V(氯仿)∶V(异戊醇抽提液)=24∶1；

（7）液氮；

（8）蒸馏水；

（9）ddH2O双重蒸馏水

（10）电解缓冲液；

（11）上样缓冲液；

（12）染色液等试剂

2.2 基因组DNA的提取方法

2.2.1 常用方法-KAc法提取步骤：从两种体系的烟粉虱中提取基因组DNA，

模板DNA采用五头匀浆法获得，方法如下：

a. 将五头R和S样本分别置于1.5 mL离心管中,用液氮破碎研磨，滴加150μL提取缓冲液匀浆,50μL缓冲液清洗研棒3次、合并混匀;匀浆液中滴加5μL蛋白酶K,混匀。

b. 然后水浴60℃水浴2 h(中途混匀1~2次);100℃沸水浴5 min。

c. KAc抽提：DNA匀浆液中加入400μL KAc抽提2次,每次冰浴半小时 ,12 000 r/min离心15 min,取上清液。

d. 沉淀DNA加入800μL预冷无水乙醇,于-20℃沉淀上清液1 h以上, 12 000 r/min离心15 min,小心弃去上清液。

e. 洗涤DNA加入400μL预冷的75%乙醇,12 000 r/min离心15 min,小心弃去上清液。

f. 干燥和溶解将EP管倒扣于干净滤纸上,自然干燥30 min,每管加入30μL超纯水,充分溶解后于-20℃保存备用。PCR扩增时吸取2μL水溶液作为DNA模板。

2.2.2 DNA提取改进方法：氯仿—异戊醇抽提法

1. 配制试剂：

1）提取缓冲液(PH=8.0)

Tris-HCl 50 mmol/L 0.3027g，

EDTA 1 mmol/L 0.0146g，

SDS 1% 0.5g，

NaCl 20 mmol/L 0.058g ；

H2O 50ml

2） 醋酸钾(KAc) 3 mol/L 29.442g（用蒸馏水定容至100ML）

3) 蛋白酶K 20 mg/mL 10Mg Pr+500UL ddH2O

4) 无水乙醇；

5) 75%乙醇；

6) V(氯仿)∶V(异戊醇抽提液)=24∶1；

2. 提取方法：

a. 将五头样本分别置于1.5 mL离心管中,用液氮破碎研磨，滴加150μL提取缓冲液匀浆，50μL缓冲液清洗研棒3次、合并混匀;匀浆液中滴加5μL蛋白酶K,混匀。

b. 然后水浴60℃水浴1 h(中途混匀1~2次);100℃沸水浴5 min。

c. 氯仿-异戊醇抽提：DNA匀浆液中加入200μL 氯仿-异戊醇抽提2次,每次轻柔混匀数试十次，冰上放置10 min ,10 000 r/min离心10 min,取上清液。

d. 沉淀DNA： 加入2倍体积预冷无水乙醇,轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min，然后 12 000 r/min离心15min,小心弃去上清液。

e. 洗涤DNA： 加入2倍体积预冷的75%乙醇,12 000 r/min离心15 min,小心弃去上清液。

f. 干燥和溶解将EP管倒扣于干净滤纸上,自然干燥30 min,每管加入30μL超纯水,充分溶解后于-20℃保存备用。PCR扩增时吸取2μL水溶液作为DNA模板。

2.3 DNA样品检测

以SCAR标记技术对提取的DNA样品进行PCR扩增,产物采用含0.8%的平板琼脂糖90-100 V电压电泳40 min,电泳结果以凝胶成像系统进行检测分析。

2.4 随即引物的PCR扩增与电泳检测

反应体系：超纯水18.5Μl+ 10×Taq Buffer(Mg2+Free) 2.5μL+ 0.25mmol/L dNTPs(each) 1μL + 引物1μL + DNA模板1μL + Taq酶1μL+ Mg2+ 2.5μL。

扩增程序为: 95℃预变性4min;共35个循环; 94℃变性 45s ,38℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸5 min;4℃保存。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离。