SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。 Acr：丙烯酰胺
Bis：甲叉双丙烯酰胺
AP：过硫酸铵——化学催化剂
TEMED：四甲基乙二胺——加速剂
实验材料
1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）：将60ml水预热至37摄氏度，加入丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis），溶解并补水至100ml。用0.45微米孔径滤纸过滤，查证溶液pH值不超过7.0。贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。（Acr）29.2g及（Bis）g
丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积效应。称量时应戴手套和口罩。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris），加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris，加双蒸馏水至80ml，
调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
100ml分离胶1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：将Trisg完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至8.8，加水定容至100ml。室温保存。 100ml积层胶：将Trisg完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至6.8，加水定容至100ml。室温保存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS（电泳级）存储液（），用去离子水补至1000ml。pH 8.3。
5、10% 过硫酸铵（AP）：过硫酸铵于1.5ml进口EP管中，用时加1ml去离子水溶解。2周内使用。
6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）：在900ml水预热至68摄氏度，加入100g电泳级SDS溶解，补水至1000ml。SDS颗粒易扩散，称量时戴面罩。10%SDS无需灭菌。室温保存。
7、四甲基乙二胺（TEMED）：10% TEMED 0.1ml TEMED , 加0.9 ml蒸馏水。
8、上样缓冲液 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS ，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。
样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，溴酚兰，10g蔗糖，加水定容至100ml。 2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝，1MTris·Cl（）1ml巯基乙醇，10%SDS 4ml。 2×上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。 2×上样缓冲液（10ml）：1ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，2ml 100%的甘油，4ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），2g溴酚蓝，1ml去离子水，在-20℃保存数月。
9、考马斯亮蓝R250染色液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液，溶解考马斯亮蓝R-250，加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。用Whatman 1号滤纸过滤染液去除颗粒物质。不可隔夜以免影响染色效果。
10、脱色液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液。 取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。
考马斯亮蓝脱色液：10ml甲醇，10ml冰醋酸，80ml蒸馏水。
11、蛋白质分子量标志物：市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液 溶液成分 6% 水 总体积 总体积 总体积 总体积 总体积 总体积 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 30%丙烯酰胺 Tris(pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 8% 水 30%丙烯酰胺 Tris(pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 10% 水 30%丙烯酰胺 Tris(pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 12% 水 30%丙烯酰胺 Tris(pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 15% 水 30%丙烯酰胺 Tris(pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED
配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液 溶液成分 水 30%丙烯酰胺 1M Tris(pH 6.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 总体积 3ml 总体积 4ml 总体积 5ml 总体积 6ml 总体积 8ml 四、实验方法
1、用1％琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12％分离胶（15ml），凝胶液加至约距前玻璃板顶端（距梳子齿约），接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约30min后，若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面，表明凝胶已聚合。将水倒出，吸干，灌满5％浓缩胶（8ml，4ml用于Mini-Protein Ⅲ 型电泳槽）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子。
2、预电泳：将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽，使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内；接通电源，上槽为负极，下槽为正极，80V预电泳3～5min。
3、取20-30μl蛋白提取液与20-30μl样品缓冲液混合，于100℃水浴加热3-5min使蛋白变性（离心 5～10s），用微量进样器以50μl的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。 取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。 取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。
4、打开电源将电压调到80v，待样品跑过压缩胶后将电压调到120－150v至电泳到胶底部为止。
5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2－3h（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）；待条带清晰后倒出染色液，凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。
将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档照射20秒，倒出脱色液，再加入新鲜脱色液照射20秒，重复5－6次，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析。
【注意事项】
1. 凝胶不聚合的可能原因
（1）试剂质量差，应使用电泳级别的试剂。
（2）过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液。 （3）凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。
2． 上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。 3． 经过煮沸的样品虽然可以在-20℃保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20℃取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。
4． 注意避免电泳条带弯曲畸变：①“微笑” 现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善.②“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。③“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服。（主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。）④“晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。
5． 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。 6． 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测，须特别注意：1）已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量，并在同一块凝胶上电泳和染色。 2. 样品如何处理？
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 9. 什么是“鬼带”，如何处理？
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 11. 为什么电泳的条带很粗？
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压； 12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。
14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？
通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长？
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
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