丹参SmNAC1基因的克隆和生物信息学分析

丹参SmNAC1基因的克隆和生物信息学分析

为了研究丹参中特有的NAC转录子在丹参生长发育、激素调节和抗逆胁迫应答调节中的功能，对丹参NAC转录因子进行了克隆和分析。根据丹参毛状根cDNA文库中筛选到的NAC EST序列，克隆了丹参SmNAC1的cDNA全长序列。生物信息学分析显示基因的开放阅读框591 bp，编码166个氨基酸，相对分子质量21.66 kDa，等电点4.36 Genbank kF006346。SmNAC1蛋白的N-端具有保守的NAC_AB结构域，C-端高度变异。根据软件预测SmNAC1可能定位在细胞核。qRT-PCR分析YE+Ag+处理后SmNAC1在丹参毛状根中的表达变化，处理后2 h表达量上调至对照的1.5倍，4～12 h保持2倍的表达量，36 h时下降至对照水平以下，推测SmNAC1可能参与了丹参毛状根对YE+Ag+的胁迫应答调节。

标签： 丹参；NAC转录因子；SmBF3-2；分子克隆；生物信息学

NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族，在植物的生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前为止已经从拟南芥中鉴定出117个NAC转录因子基因[1-2]，水稻中151个[3]，葡萄中143个[4]，毛果杨中163个[5]，烟草[6]和大豆[7]中各有152个。NAC家族转录因子N-端有一个高度保守的NAC结构域，可进一步分为A-E5个保守的子域，具有DNA结合（DNA Binding）或蛋白质和二聚体结合功能。与N-端的保守不同，NAC的C端无论是在氨基酸序列还是长度方面都具有高度的多样性，具有转录激活、抑制或者与蛋白质结合活性[8]。实验证明不同物种的高同源性NAC基因可能执行不同的功能。NAC基因参与介导胁迫对植物生长发育的影响，这往往是生物胁迫间、非生物胁迫间以及生物与非生物胁迫间信号调控通路的关键节点[9]。目前关于NAC的研究较少，且多集中于拟南芥、水稻等模式植物。在丹参中仅克隆到1条NAC转录因子SmBTF[10]。本研究组从丹参毛状根cDNA文库中得到1条NAC转录因子的EST序列，在此基础上克隆得到了SmNAC1基因的全长cDNA序列，并通过生物信息学分析其编码的蛋白质理化性质、保守功能域等生物学信息，为进一步研究丹参中该类转录因子提供信息和依据。

1 材料

用丹参叶片经农杆菌ACCC10060介导产生的不定根[11-12]，用6，7-V培养基继代， 恒温26℃，80 r·min-1摇床暗培养培养18 d，用终浓度30 mmol·L-1Ag+和100 g·L-1酵母提取物联合处理， 0，2，4，8，12，24 h取样，液氮速冻，-80 ℃保存。

2 方法

2.1 RNA提取与反转录 采用Trizol法提取丹参毛状根总RNA。取0.1 g毛状根，加入0.2 mg聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP），在液氮中研磨粉碎，加入1 mL Trizol（Ambion公司）室温放置10 min充分裂解，4 ℃ 12

000 r·min-1离心取上清，依次用氯仿和异丙醇洗脱，75%乙醇-20 ℃沉淀2 h，最后用20 μL去除RNA酶的水溶解。用NANO Drop核酸定量仪测定RNA浓度，取1.0 μg RNA，应用Thermo反转录试剂盒，按照附带的操作流程利用Oligo（dT）18引物反转录成总cDNA。

2.2 SmNAC1cDNA全长克隆 根据得到的SmNAC1基因片段设计PCR特异性引物SmNAC1-F：5′-ATGACTCAATCCCAGGAGGAG-3′，SmNAC1-R：5′-CTAGTTTGTGAGCTCCATAATGG-3′，以丹参毛状根总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为ddH2O 15.4 μL，dNTP 1.6 μL，Ex Taq Buffer 2.0 μL，引物（10 nmol·L-1）各0.4 μL，Ex Taq（5 U·L-1）0.1 μL。扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 30个循环，72 ℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用Thermo Gene JET PCR纯化试剂盒纯化PCR产物后连接pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性单克隆送北京华大基因研究中心测序。

2.3 SmNAC1生物信息学分析 将全长cDNA序列在NCBI数据库的 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.ni.gov/gorf/orfig.cgi）中分析SmNAC1序列的ORF，推导编码氨基酸的基因序列。应用BLAST程序（http：//www.cnbi.nlm.nih.gov）检索相似蛋白，用Clustal W（http：//www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html）对氨基酸序列进行多重比对，并用MEGA4 NJ法（bootstrap 1000）构建系统树。在CCD数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd.shtml），InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）和ExPASy ScanProsite（http：//prosite.expasy.org/）分析保守结构域，用Compute pI/Mw（http：//web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool）预测蛋白的理化性质。用TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行跨膜域分析。SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽分析。WOLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）和TargetP1.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析蛋白的亚细胞定位。在CFSSP（http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman/）进行二级结构预测，Disulfind（http：//cassandra.dsi.unifi.it/cysteines/index.html）进行二硫键预测。在Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白的三级结构预测。2.4 丹参毛状根中SmNAC1表达谱分析 采用SYBR Green Premix染料（TaKaRa公司）进行qRT-PCR分析，以丹参β-actin作管家基因，分别以特异性引物SmNAC F：5′-CTCCCAACATCAGTCAAG-3′，SmNAC R：5′-ATGGCGGTGACGAT-3′，检测SmNAC1在YE+Ag+处理丹参毛状根0，2，4，8，12，24 h的表达变化。PCR体系为 SYBR Premix TaqTM 5 μL，正反引物各0.2 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，稀释10倍的cDNA模板1.0 μL，加ddH2O至10 μL。PCR程序为，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s， 40个循环，增加溶解曲线。每个样品设3个生物学重复。

3 结果

3.1 丹参SmNAC1基因序列分析 丹参SmNAC1基因全长591 bp，编码196个氨基酸。Blastx检索结果显示，SmNAC1与野生马铃薯Solanum chacoense的

NAC1，番茄S. lycopersicum NAC1-like，烟草Nicotiana benthamiana NAC1，水稻Oryza sativa Indica Group NAC-like，紫花苜蓿Medicago truncatula的相似度分别是84%，83%，84%，77%，73%。与SmBTF的相似度只有56%。SmNAC1蛋白55～120 位是NAC_AB（PS51151）的保守结构域。应用Softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）分析调控元件和PLANTCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测，C-端氨基酸有23个顺势作用元件，包括TGGTTT厌氧响应顺式调控元件，AAACAGA赤霉素响应元件，GTTTTCTTAC参与胁迫防御应答的顺式作用元件以及TCTTTAC光应答元件等。使用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸化位点，共发现10个磷酸化位点，其中丝氨酸位点7个，苏氨酸位点2个，酪氨酸位点1个，没有发现糖基化为点。

3.2 SmNAC1编码蛋白质的基本性质分析 SmNAC1蛋白由196个氨基酸残基组成，相对分子质量为21.66 kDa，等电点4.36。CFSSP 对SmNAC1蛋白进行二级结构预测，该蛋白包含87.8%的α螺旋结构， 36.7% 的β折叠结构和14.8%的无规卷曲，见图1（由于α螺旋和β折叠交互计算，故几种结构类型之和>100%）。无规则卷曲主要位于55～120个氨基酸功能区内，连接其他二级结构元件。在SWISS-MODEL用同源建模方法以人的NAC蛋白（3mcbA）为模板构建同源模型，对SmNAC1的NAC结构域氨基酸进行三级结构预测，结果见图2。SignalP 4.0 Server和TMHMM 2.0分析显示SmNAC1非氨基酸序列没有信号肽，也不包含跨膜结构域，也不是分泌蛋白。亚细胞定位分析表明，该基因不定位于叶绿体或线粒体，推测可能定位在细胞核，具有DNA结合，激活，转录调控，乙酰化等功能。

以人的NAC蛋白（3mcbA）为模板，E=9.311 57e-17。将SmNAC1与Genbank中17个物种25种蛋白进行比对，应用MEGA4使用NJ法（bootstrap 1000）构建系统进化树。SmNAC1与茄科马铃薯S. chacoense NAC2（ScNAC2， ACB32231.1），本氏烟N. benthamiana NAC（NbNAC，BAF46352.1）和番茄S.lycopersicum NAC（SINAC，XP_004249331.1）

亲缘关系最近，见图3。从图中可以看出NAC的变异率是比较高的，同一植物的NAC蛋白并不聚在一起，如拟南芥中的拟南芥Arabidopsis thaliana中的5个蛋白NAC1-1（AtNAC1-1，NP_187845.1），NAC1-2（AtNAC1-2，NP_190516.1），NAC1-3（AtNAC1-3，NP_1196889.4），NAC1-4（AtNAC1-4，NP_001078369.1）和NAC1-5（AtNAC1-5，AEE31552.1），AtNAC1-1和AtNAC1-3聚为一小支，AtNAC1-4和AtNAC1-5聚为一小支，而AtNAC1-2则和蓖麻Ricinus communis NAC1-2（RcNAC1-2，XP_002521293.1）聚为一小支，三者间间隔距离较远。玉米种的3个NAC蛋白中ZmNAC1-1（NP_001147422.1）和ZmNAC1-3（NP001148944.1）聚为一支，与ZmNAC1-2（NP_001147705.1）的距离较远。水稻中的3个NAC蛋白则各自聚在不同的分支。可见NAC蛋白虽然具有保守的结构域，但是其结构的变异性非常大。

3.3 SmNAC1基因表达谱分析 对培养18 d的丹参毛状根进行YE+Ag+处理，分析SmNAC1在处理后5个时间点的mRNA水平的相对表达量，见图4。处理

后2 h表达量上调至对照的1.4倍，处理后4 h表达量达到对照的2倍，8～12 h保持2倍的表达水平，处理后24 h SmNAC1下调至对照表达水平以下。说明SmNAC1响应YE+Ag+处理，参与了胁迫应答反应。

4 讨论

NAC家族基因是陆生植物特异的转录因子家族，NAC蛋白参与植物的生长发育、形态建成及多马铃薯Solanum chacoense NAC2（ScNAC2， ACB32231. 1）；本氏烟Nicotiana benthamiana NAC（NbNAC，BAF46352. 1）；番茄S. lycopersicum NAC（SINAC，XP_004249331. 1）；丹参Salviae miltiorrhizae NAC1（SmNAC1，kF006346）；黄瓜Cucumis sativus（CsNAC， XP_004171778. 1）；葡萄Vitis vinifera NAC2（VvNAC2，XP_003632619. 1）；野草莓Fragaria vesca subsp. vesca NAC（Fvssp. vescaNAC，XP_004306474. 1）；拟南芥Arabidopsis thaliana NAC1-3（AtNAC1-3，NP_1196889. 4）；拟南芥A. thaliana NAC1-1（AtNAC1-1，NP_187845. 1）；水稻Oryza sativa Japonica Group NAC1（OsNAC1，BAB89723. 1）；水稻O. sativa NAC1-3（OsNAC1-3，AAT01337. 1）；葡萄V. vinifera NAC1（VvNAC1，XP_002283581. 2）；二穗短柄草Brachypodium distachyon NAC（BdNAC，XP_003557882. 1）；玉米Zea mays NAC1-3（ZmNAC1-3，NP001148944. 1）；玉米Z. mays NAC1-1（ZmNAC1-1，NP_001147422. 1）；大豆Glycine max NAC（GmNAC，XP_003554096）；蒺藜状苜蓿Medicago truncatula NAC1（MtNAC1，XP_003624883. 1）；火炬松Pinus taeda NAC（PtNAC，AAF27917. 1）；Micromonas sp. RCC299（Msp. NAC1，ACO64924. 1）；Coccomyxa subellipsoidea C-169（CsuNAC1，EIE21909. 1）；拟南芥A. thaliana NAC1-5（AtNAC1-5，AEE31552. 1）；拟南芥A. thaliana NAC1-4（AtNAC1-4，NP_001078369. 1）；水稻O. sativa NAC1-2（OsNAC1-2，AAM52321. 1）；玉米Z. mays NAC1-2（ZmNAC1-2，NP_001147705. 1）；拟南芥A. thaliana NAC1-2（AtNAC1-2，NP_190516. 1）；蓖麻Ricinus communis NAC1-2（RcNAC1-2，XP_002521293. 1）。种生物和非生物胁迫应答过程。如玉米的ZmSNAC1基因在低温、干旱、高盐及脱落酸处理后表达量显著上调，而水杨酸处理后表达下调[13]。葡萄中的VvNAC1基因响应病原菌、脱落酸、茉莉酸和乙烯处理表达上调[14]。在巴西橡胶树HbNAC1启动子序列中有多个CCAAT-box，EECCRCAH1，MYB2CONAENSUSAT元件识别MYB和MYC转录因子，在ABA信号通路和非生物胁迫答应中起重要作用[15]。SmBTF3与SmNAC1氨基酸序列的相似度只有56%，但是在N-端都具有NAC-AB保守结构域，二级结构都以α螺旋为主。荧光定量PCR分析表明SmBTF3在根中的表达量最高，对ABA诱导的响应不明显，干旱胁迫短时间内抑制其表达。本研究发现SmNAC1在YE+Ag+联合处理后2 h表达量上调至对照的1.4倍，4 h上调至对照的2倍，24 h表达量下调至对照表达水平一下，可见丹参中的这2个转录因子在丹参的抗逆胁迫中起作用。

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Cloning and bioinformatics analysis of SmNAC1 from Salvia miltiorrhiza hairy root

WANG Ya-jun1， JIANG Chao1， ZHAO Rong1， ZHAO Le2， SHEN Ye1*， HUANG Lu-qi1*

（1.National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2.College of Pharmaey， Henan University of Traditional Chinese medicine， Zhengzhou 450008， China）

[Abstract] In order to study function of NAC transcription in development， hormone regulation and the stress response of Salvia miltiorrhiza， the NAC transcription was cloned and analyzed. By retrieving cDNA database of S. miltiorrhiza hairy root one NAC unigene was found， then a full length of cDNA was cloned by designing specific primers and PCR amplifying. Using ORF finder it was found that the cDNA containing a NAC-AB conserved domain in N-terminal， so the cDNA was a NAC transcription factor， named as SmNAC1（kF006346）. Bioinformatics analysis showed that SmNAC1 had an open reading frame （ORF） of 591 bp encoding 196 amino acids. The calculated protein had isoelectric point （pI） of 4.36 with molecular weight about 21.66 kDa. The transcription level of SmNAC1 after dealing with yeast extract （YE） and silver ion （Ag+） in S. miltiorrhiza hairy root was markedly stimulated up regulating. It was 1.4 fold compared with the control after induction 2 h， and maintained 2.0 fold on 4-12 h after induction. SmNAC1 may participate in regulation of stress response of YE+Ag+.

[Key words] Salvia miltiorrhiza； basic transcription factor； stress responsiveness； bioinformatics analysis

doi：10.4268/cjcmm20131305