1. 目的要求
(1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。 (2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 基本原理
显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。
油镜物镜的基本原理
微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。
使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：
NA＝n·sinα
式中 NA=数值孔径； n=介质折射率；
α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。
因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则： 以空气为介质时： NA=1×0．87=0．87 以水为介质时：
NA=1．33×0．87=1．15 以香柏油为介质时： NA=1．52×0．87=1．32
显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。
式中λ=光波波长。
我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的
因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大
率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。
3. 材料及器材
显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、微生物制片标本等。
4. 方法与步骤
(1) 观察前的准备
A. 置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3—4cm。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。
B. 调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。
调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。 (2) 低倍镜观察
检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。 将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约 0．5cm处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。 (3) 高倍镜观察
将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。 (4) 油镜观察
A. 用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。 B. 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
C. 从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。 D. 从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。 E. 用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。
F. 观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。
G. 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
5. 实验作业
(1) 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到微生物的状态，包括在三种情况下视野中
的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。
(2) 在使用高倍镜和油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？ (3) 用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
1. 目的要求
（1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
2. 基本原理
（1）简单染色法
用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
3. 材料及器材
(1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
(2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等
4. 方法与步骤
Ⅰ 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ 干燥 室温自然干燥。
Ⅲ 固定 固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。 Ⅳ 染色
（1）简单染色法：
① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。
② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。
③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法：
① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
④ 复染 用番红液染1～2min，水洗。
⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
(3) 混合涂片法：
按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
革兰氏染色过程：
5. 实验作业
(1) 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？
(2) 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
实验三 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别
1. 目的要求
(1) 观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。 (2) 学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法。
2. 基本原理
酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片，和水-碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。
3. 材料及器材
(1) 酿酒酵母或卡尔酵母
(2) 0．05％、0．1％吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液 (3) 显微镜，载玻片，盖玻片等
4. 方法与步骤
(1) 在载玻片中央加一滴0．1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片
时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48小时的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
(2) 用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应
先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。 (3) 将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的
形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 (4) 染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。 (5) 用0．05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。
5. 实验作业
(1) 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间对死活细胞数的影响。
实验四 培养基的制备与灭菌方法
1. 目的要求
(1) 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
(2) 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 (3) 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
2. 基本原理
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
3. 材料及器材
(1) 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、
MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O等。
(2) 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。
(3) 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、
漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。
4. 方法与步骤
(1) 培养基的配制： A. 培养基的种类
据组成成分可分为： 合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
从培养基的物理状态可分为： 液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 半固体培养基：在液体培养基中加入0.5-1%凝固剂而成的半固体状培养基。
常用凝固剂为琼脂（其次为明胶） B. 培养基的配制方法和步骤 称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水
分装：注意不要污染棉塞
包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基
灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用
(2)分离培养微生物常用器皿的准备：
清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等 棉塞的制作及包装培养皿和吸管等
(3)培养基和玻璃器材的灭菌方法 恒温干燥灭菌法步骤如下： 将要灭菌的物品放入干燥箱内，堆积时要留有空隙，勿使接触器壁、铁壳，关闭箱门。 接通电源，把位于箱顶的通气孔打开，使湿空气能逸出，至箱内温度达到100℃时关闭。 调节温度控制器旋钮，直至箱内温度达到所需温度为止，观察温度是否恒定。若不稳定，再行调节，稳定后不可再拨动旋钮和通气孔，保持160~170℃，2h。 灭菌结束后切断电源，待箱内温度降至60℃时才能打开箱门取出灭菌物品。同时，应将温度调节旋钮跳到零点，并打开通气孔。 加压蒸汽灭菌法其步骤如下: 接通电源，进行加热。 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀。 当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持20min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。
(4)培养基和玻璃器材的灭菌方法 间歇灭菌法: 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。
在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 过滤除菌法: 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。 紫外线灭菌法:
一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 化学药剂消毒灭菌:
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。
5. 实验作业
(1) (2) (3) (4)
固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 培养基中加琼脂的作用是什么？
干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？ 如何检查培养基灭菌是否彻底？
实验五 微生物分离与纯化技术
1. 目的要求
(1)了解不同微生物培养在斜面上和液体、半固体培养基中的特征。 (2)进一步熟练和掌握微生物的无菌操作接种技术。
2. 基本原理
微生物的培养特征是指微生物培养在培养基上所表现出的群体形态和生长情况。一般可用斜面、液体和半固体培养基来检验不同微生物的培养特征。它们培养在斜面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、串珠状、疏展状、树枝状或假根状。生长在液体培养基内，可以呈混浊、絮状、粘液状、形成菌膜、上层清晰而底部显沉淀状。穿刺培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延；或仅沿线生长；也可上层生长得好，甚至连成一片，底部很少生长；或底部长得好，上层甚至不生长。利用微生物的培养特征，可以作为它们的种类鉴定和识别纯培养是否污染的参考。 检验微生物的培养特征，或进行其他微生物学实验时，接种过程必须保证不被其他微生物所污染，为此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。
3. 材料及器材
(1) 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白地霉（Geo-trichum candidum），蕈状芽孢杆菌（Bacillusmycoides），粘质沙雷氏菌（粘质赛氏杆菌， Serratia marcescens）。
(2) 肉膏蛋白胨斜面培养基，肉膏蛋白胨液体培养基，半固体肉膏蛋白胨培养基，接种环，接种针，无菌吸管，无菌平皿，酒精灯等。
4. 方法与步骤
⑴接种的操作方法 ①斜面接种 在肉膏蛋白胨斜面试管上，用记号笔写上将接种的菌名、日期和接种者。 点燃酒精灯或煤气灯。 将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平状态。在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。 右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞（或试管帽），将其取出，并迅速烧灼管口。 将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使环接触管壁或管口。 接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上。将接种环逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注意此点。
②液体培养基接种
向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种时相同，不同之处是挑取菌体的接种环放入液体培养基后，应在液体表面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体从环上脱落，混进液体培养基，塞好试管塞后，摇动液体，使菌体在液体中分布均匀，或用试管振荡器混匀。
向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可将无菌水或液体培养基注入菌种试管，用接种环将菌苔刮下，再将菌种悬液以无菌吸管定量吸出加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液体培养物，则可用无菌吸管定量吸出加入或直接倒入液体培养基。整个接种过程都要求无菌操作。 穿刺接种 ③穿刺接种
用接种针挑取菌种（针必须挺直），自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近管底，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管塞，烧灼接种针。
试验者应反复练习无菌操作接种技术，直至较熟练地掌握。
④将已接种的斜面、液体和半固体培养基放置28—30℃温箱，培养2—3天后取出观察结果。 ⑵分离的操作方法 ①平板划线分离法：
倒平板：将融化的琼脂培养基冷却至45℃左右，在酒精灯火焰旁，以右手的无名指及小指夹持棉塞，左手打开无菌培养皿的盖的一边，右手持三角瓶向平皿里注入10-15ml培养基。将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平位置待凝。
划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作取一环分离菌液。划线时，琼脂平板可放在台面上也可以持在手中。左手握琼脂平板，在火焰上方稍抬起皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上第一个区域沿“Z”字形来回划线。划线时，使接种环与平板表面成30－40°角轻轻接触，以腕力使接种环在琼脂表面作轻快地滑动，勿划破表面。灼烧接种环，待其冷却后，将手中平皿旋转约70°角，用接种环在划过的第一区域接触一下，然后在第二区域进行划线，并依次对第三和第四区域进行划线。划线完毕后，在平皿底用记号笔注明样品名称、日期、姓名（或学号），将整个平皿倒置放入28－30℃恒温培养箱中培养。18－24小时后观察并记录单菌落的生长和分布情况。
②倾注平板法：
－－－
编号：取6支盛有4.5ml无菌水的试管排列于试管架上，依次标上101，102，10
－－－3
，104，105，106字样。
－
稀释：以1ml无菌吸管按无菌操作从样品中吸取0.5ml菌液于101试管中，然后用
－－－
另一吸管在101试管中吹吸三次，使其混合均匀，制成101稀释液。再用此吸管从101
－－－－－－
管中吸取0.5ml稀释液注入102管中，依次制成102，103，104，105，106稀释液。
加样：用1ml无菌吸管分别吸取104，105，106稀释液1ml注入已编好号的104，－－
105，106号无菌培养皿中。 倾注平板：将融化后冷至45℃左右的琼脂培养基，向加有稀释液的各培养皿中分别倒入10－15ml，迅速旋转培养皿，使培养基和稀释液充分混合，水平放置，待其凝固后，倒置于28－30℃恒温箱中培养。18－24h后，观察并记录各平板上菌落生长和分布情况。哪个稀释度最合适？
－
－
－
－
③涂布平板法：
－－－
平板制备：制备三套无菌平板，并分别写上104，105，106。 稀释：同倾注平板法。
－－－
加样：用无菌吸管分别吸取104，105，106稀释液0.2ml对号注入编好号的琼脂平板中。 涂布：用无菌棒在各平板表面进行均匀涂布。待涂布的菌液干后，将培养皿倒置于28－30℃恒温培养箱中培养。18－24小时后观察并记录单菌落的生长和分布情况。
5. 实验作业
⑴为什么要把培养皿倒置培养？
⑵记录你所做的试验中各种微生物在斜面上、液体和半固体培养基中的培养特征。 ⑶用各种方法接种时，怎样才能更好地保证菌种不被污染？
实验六 酵母菌的血球板计数法
1. 目的要求
(1)明确显微镜计数的原理。
(2)学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
2. 基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的
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计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。
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每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻
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片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数
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因1ml=1cm=1000mm，
=50000A·B（个）
同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则
3. 材料及器材
酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。
4. 方法与步骤
(1)稀释
将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 (2)加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 (3)显微镜计数
静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 (4)清洗血球计数板
使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
5. 实验作业
(1) 将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。
(2) 根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少
误差，力求准确？
实验七 实验室环境中微生物的测定
1. 目的要求
（1）证明实验室内存在多种微生物，观察不同类型微生物的菌落特征。 （2）强调微生物实验的无菌操作技术的重要性。
2. 基本原理
微生物的基本特点是在自然界分布广泛，实验室内亦不例外。由于其个体微小、结构简单，绝大多数用肉眼看不到，因此，只有通过微生物细胞在营养琼脂培养基上适宜温度下培养，大量繁殖形成微生物细胞群体，即菌落，才能用肉眼直接可见。
3. 材料及器材
牛肉膏蛋白胨营养琼脂、0.85%灭菌生理盐水
无菌棉签、镊子、剪刀、无菌牙签、无菌平皿、记号笔等
4. 方法与步骤
以2人为一组，取7个已倒好灭菌营养琼脂的平板，其中1个作为对照不要开盖，其余每人3个平板，组员分别选择下列处理方法：
（1）空气检验 打开培养基皿盖，在空气中暴露10～15min，然后盖上皿盖。
（2）尘土检验 用灭菌棉签先蘸一下灭菌生理盐水，而后在实验台（或凳子）上擦两下，打开皿盖，在培养基表面轻轻滚动涂抹，然后盖上皿盖。注意不要将培养基擦破。
（3）自来水检验 用灭菌棉签蘸少量自来水，打开皿盖点接于培养基表面，注意不要将培养基划破，然后盖上皿盖。
（4）人体微生物检验
① 打开培养基皿盖，用手指触摸培养基表面几个点，注意不要将培养基戳破，然后盖上皿盖。
② 用剪刀取自己的头发（约5cm长）3～5根，打开皿盖，用镊子将头发放于培养基表面，注意头发要贴在培养基表面，然后盖上皿盖。
③ 用灭菌牙签取少量牙垢，打开皿盖涂于培养基表面，注意不要将培养基划破，然后盖上皿盖。
（5）培养 在小皿盖上用记号笔写明班级、姓名、日期及处理方法。将营养琼脂平板倒置于37℃温箱培养48h后，观察结果。
5. 实验作业
(1) 描述你处理的培养皿中长出的菌落形态特征。 微生物来源 空气 尘土 水 手指印 头发 牙垢 菌落数 菌落表面凸起边缘菌落菌落菌落表面透明是否形大小 形状 情况 情况 形状 质地 颜色 光泽 程度 成菌苔
(2) 微生物实验的无菌操作有何意义？
(3) 比较不同来源样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？
实验八 常用简易保藏菌种方法
1. 目的要求
（1）了解几种保藏菌种的基本原理
（2）掌握几种常用的微生物菌种包藏的方法。
2. 基本原理
菌种保藏的原理是人工创造一个低温、干燥、缺氧、缺乏营养素及添加保护剂等环境条件，将微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，而又使菌种达到不变异和不死亡。
（1）斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法 将在斜面或半固体培养基上生长健壮的培养物置于4℃冰箱中保藏，定期移植。此法是利用低温抑制微生物的生长。优点是不需特殊设备，操作简便易行。缺点是保藏时间短，菌种传代次数较频，遗传性状易发生变异和衰退，面塞易长霉引起菌种污染。霉菌、放线菌和有芽孢的细菌可保存3～6个月，酵母菌2～3个月，无芽孢细菌1～3个月。半固体穿刺保藏法一般可保藏菌种半年至一年。
（2）液体石蜡保藏法 在新鲜斜面培养物上覆盖一层灭菌液体石蜡，置于4℃冰箱中保藏。液体石蜡有隔绝空气作用，又防止培养基的水分蒸发。此法是利用缺氧和低温双重抑制微生物生长。优点是操作简单易行，保存期较长。缺点是必须直立保存，不便携带。霉菌、放线菌和有芽孢的细菌可保存2年以上，酵母菌1～2年，无芽孢细菌1年左右。
（3）沙土管保藏法 将待保藏菌种接种于斜面培养基上，经培养后制成孢子悬液，将孢子悬液滴入灭菌沙土管中，孢子即吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，吸干沙土管中水分，经密封后置于4℃冰箱中保藏。此法是利用干燥、缺氧、缺乏营养素、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间，可保藏菌种1年到数年。
（4）甘油保藏法 在液体新鲜培养物中加入适量（15%～50%）的灭菌甘油，置于-20℃冰柜或-70℃超低温冰柜中保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，同时在低温冷冻条件下，可大大降低细胞代谢水平，从而达到延长保藏时间的目的。此法可保藏菌种半年到一年。
（5）液氮超低温保藏法 将微生物细胞直接或离心浓缩后悬浮于液体培养基中或含保护剂的液体培养基中，或者将带菌的琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，直接放入-80℃超低温冰柜中保藏，或经缓慢冷冻后，再转移至液氮冰箱内，于液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。
每种保藏方法都有其适用范围，要根据被保藏菌种的特性选择适宜的保藏方法。有的微生物不耐冷，可采用真空干燥保藏法而不选择冷冻真空干燥保藏法；有的不耐干燥，则最好不选择沙土管保藏法。
3. 材料及器材
⑴菌种：待保藏的细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。
⑵培养基：牛肉膏蛋白胨斜面和半固体深层培养基、麦芽汁斜面和半固体培养基（培养酵母菌）、马铃薯蔗糖斜面培养基（培养霉菌）。
⑶试剂：无菌水、无菌液体石蜡、10%HCl溶液、河沙、黄土、无菌甘油（丙三醇，AR）。
4. 方法与步骤
（1）斜面低温保藏法（适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的保藏）
① 贴标签 注明菌株名称、日期。
② 接种 将待保藏的不同菌种以划线接种法移接至适宜的斜面培养基上。 ③ 培养 细菌置37℃培养1～2d，酵母菌置25～28℃培养2～3d，放线菌和霉菌置28℃分别培养5～7d和3～5d。
④ 保藏 将培养好的菌种置于4℃冰箱中保藏。保存温度不宜太低，否则斜面培养基因结冰脱水而加速菌种的死亡。必要时用固体石蜡熔封管口外的棉塞，以防止棉塞受潮长霉菌及培养基水分蒸发，延长保存时间。
（2）半固体穿刺保藏法（适用于兼性厌氧细菌和酵母菌的保藏）
① 贴标签 注明菌株名称、日期。
② 接种 将待保藏的不同菌种以穿刺接种法移接至适宜的半固体深层培养基中央，注意不要穿透底部。
③ 培养 细菌置37℃培养1～2d，酵母菌置25～28℃培养2～3d，放线菌和霉菌置28℃分别培养5～7d和3～5d。
④ 保藏 将培养好的菌种置于4℃冰箱中保藏。必要时用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替棉花塞并塞紧。
（3）液体石蜡保藏法法（适用于酵母菌、霉菌、放线菌的保藏）
① 无菌液体石蜡的制备 选用优质中性液体石蜡（相对密度0.865~0.890）装入100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，0.1MPa灭菌30min后，置于105~110℃的烘箱内干燥2h，以除去液体石蜡中的水分，经无菌检查后备用。
② 接种、培养与保藏 将菌种划线接种于适宜斜面培养基上，在适宜的温度下培养，使其充分生长。用无菌吸管吸取无菌液体石蜡注入到已经长好菌的斜面上，液体石蜡的量以高出斜面顶端1cm左右为准，使菌种与空气隔绝，直立于4℃冰箱或室温下保藏。 （4）甘油保藏法（适用于细菌保藏）
① 无菌甘油的制备 将甘油置于100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，0.1MPa灭菌20min后，置于40℃的温箱中2周，蒸发除去甘油中的水分，经无菌检查后备用。
② 接种、培养与保藏 挑取一环菌接种于LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至充分生长。用无菌吸管吸取0.85mL培养液于1.5mL的Eppendorf管中，再加入0.15mL无菌甘油，封口，振荡混匀。然后将其置于液氮中速冻。最后将其置于-20℃低温冰柜中保藏。
5. 实验作业
⑴简述微生物菌种保藏的一般原理。
⑵实验室中最常用哪一种简便方法保藏细菌？
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