生化与分子生物学实验指导

生化与分子生物学实验指导-(1)

实验一 氨基酸纸层析法

一、实验目的

通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。

二、实验原理

纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：

原点到层析斑

在一定条

R= 点中心的距离 f

原点到溶剂前沿的距离

件下某种物质

的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。

三、药品器材

1器材

层析滤纸（新华1号）、喷雾器、剪刀、层析缸、

毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。 2试剂

(1)氨基酸溶液：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液（各组分浓度0.5%）。 (2)展层剂：

V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2 (3)显色剂:

0.5g茚三酮溶于100mL无水丙酮，贮存于棕色瓶中备用。

四、实验方法

1. 滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成5cm×20cm的长方形，在距纸一端2cm处用铅笔轻轻划一基线，在线上每隔1cm作一记号，标出4个原点。 2. 点样：用毛细管将氨基酸样品分别点于原点(用量10~20uL)，用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复2～3 次，点子直径不能超过3mm。

3. 展层：将点好样的滤纸放入装有展层剂的展层缸内盖展层缸进行展层，展层剂液面不能淹没原点基线，当溶剂上升至15~20cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线，把滤纸烘干。

4. 显色：用喷雾器在滤纸上均匀喷上显色剂，用热风吹干，层析斑点即可显现。

5. 结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf 值，与标准氨基酸的 Rf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。

五、实验结果及分析 六、思考题

影响氨基酸Rf值的因素有哪些？

实验二 甲醛滴定法测定氨基氮

一、实验目的

初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。

二、实验原理

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：

－解离时PH高，若用碱

＋

NH3是弱酸，完全为11－12或更滴定－NH3所释

放的H来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。

常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

＋

如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。

三、器材及试剂

1.实验器材

25ml锥形瓶；3ml微量滴定管；吸管；研钵。 2.实验试剂

（1）300ml 0.05mol/L标准甘氨酸溶液

准确称取375mg 甘氨酸，溶解后定容至100ml。

（2）500ml 0.02mol/L标准氢氧化钠溶液 （3）20ml酚酞指示剂

0.5 ％酚酞的50 ％乙醇溶液。 （4）400 ml中性甲醛溶液

在50ml 36－37 ％分析纯甲醛溶液中加入1ml 0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

四、实验方法

1、取3个25 ml的锥形瓶，编号。向1、2号瓶内各加入0.05mol/L标准甘氨酸溶液2ml和水5ml，混匀。向3号瓶内加入7 ml水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2 ml甲醛溶液再混匀，分别用0.02mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。

重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。

2、取未知浓度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。

五、结果处理

1. 回收率计算：

实际

甘氨酸氨基测得氮回收率％量 ＝

加入理论

×100

量

公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。 2. 氨基氮计算：

氨基氮（毫克/毫升）= 公式中V

未

（V未－V对）×NNaOH×14.008

2

为滴定待测液耗用标准氢氧化

钠溶液的平均毫升数。V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NNaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。

六、思考题

为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—NH3+ 基上的 H+，不能用一般的酸碱指示剂？

实验三 蒽酮比色定糖法

一．实验目的：

1.学习分光光度法的基本原理

2.学习对蔬菜和食品中糖含量进行测定的方法

二．实验原理

1.分光光度法基本原理：

溶液中的物质在光的照射激发下，产生对光的吸收效应，不同的物质具有各自选择性的吸收光谱，因此，当某单色光通过溶液时，能量会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质浓度有一定比例关系，即符合于比色原理——比尔定律。

2.朗伯-比尔定律

A=lg(1/T)=Kbc

A：为吸光度,

T：为透射比,是透射光强度比上入射光强度 c：为吸光物质的浓度 b：为吸收层厚度 K：比例常数

3.物理意义

当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,起其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。 4.蒽酮比色法

蒽铜比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于特定的糖类，反应较稳定。 本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。

三．实验试剂

（1）蒽酮试剂：取0.2g蒽酮溶于100mL 80%(V/V)硫酸中，当日配制使用；

（2）标准葡萄糖 溶液(0.1mg/mL)：(可滴加几滴甲苯作防腐剂)； （3）糖样品溶液。

四．实验步骤

1.制作标准曲线：

取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0.2，0.4，0.6,0.8，1.0 ml,并依次用蒸馏水补足体积到1mL，各管均加入蒽酮试剂4mL，沸水浴准确煮沸10min，室温放置10min，用1号试管溶液调零，比色测定A620。用标准糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。

管号 标准葡萄糖溶液(ml) 蒸馏水(ml) 样品液1# 0 1.0 ／ 2# 0.2 0.8 ／ 3# 0.4 0.6 ／ 4# 0.6 0.4 ／ 5# 0.8 0.2 ／ 6# 1.0 7# 0 0 ／ 1.0

2.样品含糖量测定

(ml) 置冰水浴中冷却5min 蒽酮试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 沸水浴中准确加热10min，取出，用自来水冷却，室温放置10min A620nm 糖溶液浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 待测 ：无蛋白糖溶液样品溶液稀释100倍，吸取1mL置试管中，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量（mg/ml）。

五、实验结果

1.制作标准曲线 2.计算样品中糖浓度

六、思考题

H2SO4在实验中起什么作用？

酪蛋白的制备

一、实验目的

1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。

二、实验原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、材料、试剂与仪器

1. 材料 新鲜牛奶 2. 试剂

（1）.95%乙醇 1 200mL 1 200mL

（3）0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液 300ml

（2）无水乙醚

先配A液与B液

A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。

B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。

取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。

（4）乙醇—乙醚混合液 乙醇：乙醚=1 ：1（V/V） 3. 仪器

离心机、抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、温度计

四、操作步骤

1. 酪蛋白的粗提

100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃ 2. 酪蛋白的纯化

（1）用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。

（2）在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合

液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 （3）将沉淀摊开在表面 上，风干；得酪蛋白纯品。 3. 准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）

式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。

五、实验结果及分析 六、思考题

1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？

考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量

一、实验目的

1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法

2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。

离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。 2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。

分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。 2.放入已

加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。 3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。 三、试剂与器材： 1. 试剂：

（1）0.9％NaCl 9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。 （2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。

（3）染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。 2. 器材：

试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722分光光度计

四、操作方法

1. 标准曲线的制备

取6支试管，按下表加入各试剂：

以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 待测样品测定

试管中加蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下吸光度值，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度

管号 标准蛋白溶液(ml) 0.9%NaCl溶液(ml) 待测样品(ml) 考马斯亮蓝试剂(ml) A595nm 0 0 1.0 ／ 5.0 1 0.2 0.8 ／ 5.0 2 0.4 0.6 ／ 5.0 3 0.6 0.4 ／ 5.0 4 0.8 0.2 ／ 5.0 5 1.0 0 ／ 5.0 摇匀，放置5min，测吸光度值

（mg/ml）。

五、实验结果及分析 六、思考题

蛋白质含量的测定还有哪些方法？其优缺点是什么？

影响酶促反应速度的因素

一、实验目的

通过本实验了解温度、PH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。

二、实验原理

唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。淀粉溶液与碘反应呈蓝色；糊精根据分子大小，与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。唾液淀粉酶的活性受温度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。

温度：温度降低，酶促反应减弱或停止；温度升高，反应速度加快。当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反

而会迅速下降甚至完全丧失。

酸碱度：唾液淀粉酶最适pH为pH6.9，高于或低于酶的最适pH值，都将引起酶活性的降低，过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。

抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响，能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。如Cl-为唾液淀粉酶的激活剂，Cu为唾液淀粉酶的抑制剂。

根据上述性质，可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度，间接判断唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。

三、试剂及器材

2+

1.试剂：

1％淀粉溶液，1％氯化钠溶液，1％硫酸铜溶液，1％硫酸钠溶液，碘液，磷酸氢二钠（0.2mmol/L）, 柠檬酸溶液(0.1mmol/L)。 2.器材：

试管，试管夹，恒温水浴锅(37℃),吸管，滴管，试管架。

四、实验操作：

1.收集唾液：实验者先将痰咳尽, 用自来水漱口, 清除口腔内食物残渣, 再含蒸馏水约15 mL, 作咀嚼咕漱运动, 3min后吐入小烧杯中备用。 2.观察温度对酶促反应速度的影响

取试管3支，编号1,2,3，按下表操作： 试剂(ml) 1唾液 ○1○2水浴○5min 碘液 现象

3. 观察pH对酶促反应速度的影响 （1）配制一系列pH不等的缓冲液。 试剂(ml) 0.2mmol/L磷酸氢二钠 1 5.15 2 7.72 3 9.72 1 1 2 1 2 3 1 2 0℃ 1滴 21%淀粉 2 ○却） 100℃（冷37℃ 1滴（冷却） 1滴

0.1mmol/L柠檬酸 pH

4.85 5.00 2.28 6.80 0.28 8.00 （2）取试管3支，编号1,2,3，按下表操作： 试剂(ml) 唾液 缓冲液 1%淀粉 碘液 现象

4观察激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响 取试管4支，编号1,2,3,4，按下表操作： 试剂 滴 1 1%淀粉 20 唾液 10 蒸馏水 6 2 20 10 — 3 20 10 — 4 20 10 — 1 2 2 1滴 2 2 2 37℃水浴10min 1滴 1滴 3 2 2 3（pH5.00） 3（pH6.80） 3（pH8.00）

1％氯化钠1％硫酸铜 — — — 1滴 6 — — 1滴 — 6 — 1滴 — — 6 1滴 1％硫酸钠37℃水浴5—10min 碘液 现象

五、实验结果及分析 六、思考题

影响酶促反应速度的因素有哪些？它们如何影响酶的活性？

实验七 酶的活性及专一性测定

一、实验目的

通过本实验，了解酶的活性测定方法及其对底物催化的专一性。 二、实验原理

唾液淀粉酶能专一的催化淀粉水解，生成一系列水解产物，即糊精、麦芽糖、葡萄糖等。麦芽糖或葡萄糖都属于还原糖，能使班氏试剂中的二价铜离子还原成亚铜，并生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，且蔗糖本身不是还原糖，所以不能与班氏试剂作用呈色，以此证明酶催化底物的专一性。 三、器材及试剂

1. 器材：试管、试管夹、样品杯、滴瓶、温度计、恒温水浴箱，冰箱等。 2. 试剂：

（1）0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）：称取可溶性淀粉0.5g，加5ml蒸馏水调成糊状，徐徐倒入80ml煮沸的蒸馏水中，不断搅拌，待其溶解后，加0.3gNaCl，加蒸馏水至100ml。此液应新鲜配制，防止细菌污染。

（2）2%蔗糖溶液：称2g蔗糖，加蒸馏水至100ml溶解。

（3）班氏试剂：溶解结晶硫酸铜17.3g于100ml热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml为A液。取柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g，加蒸馏水600ml ,加热溶解，冷却后加水至850ml为B液。将A液缓慢倒入B液中，混合即可。

（4）稀释唾液：用清水漱口，清除食物残渣。再含蒸馏水15ml作咀嚼运动，2分钟后将稀释唾液收集于样品杯中备用。

（5）碘-碘化钾溶液： 四、实验方法

1. 唾液淀粉酶的活性测定

唾液的稀释：取10支试管，分别编上号1-6，取1ml唾液加入1号试管，加水稀释10倍后从中取出1ml加入2号试管，依次梯度稀释。 试剂管号 唾液(ml) 蒸馏水(ml) 1 1 9 2 1 9 3 1 9 4 1 9 5 1 9 6 1 9 各取上述稀释的唾液各1ml，分别加入相应编号的试管里，然后向6支试管内同时加入1ml的0.5％的淀粉溶液，振荡混匀后放入37 ℃ 恒温水浴中，10分钟后取出，滴加2滴碘液，振荡混匀，观察颜色，选取颜色变化适中的一支，记录稀释倍数，计算酶的活性，用于后续实验。 2. 淀粉酶的专一性

取3个试管，分别编号，按下表操作，记录实验现象。

试管编号 稀释的唾液淀粉酶/mL 0.5%淀粉溶液/mL 2%蔗糖溶液/mL 蒸馏水/mL 3 3 3 1# 1 2# 1 3# 1 摇匀，37℃保温15min Benedict试剂/mL 2 2 2 摇匀，沸水煮2分钟 观察记录结果

五、实验结果及分析 六 思考题

每组中蒸馏水分别起什么作用？将酶煮沸10min，重复以上实验可能会有什么结果？

实验八 维生素C的定量测定

一、目的要求

1. 学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。 2. 了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。 二、实验原理

维生素C是具有L系糖型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等）中的含量更为丰富。 维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉

红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。 三．材料、器材及试剂 1．材料：新鲜青菜

2．器材：电子天平，酸式滴定管，移液管，容量瓶，量筒，锥形瓶，研钵。 3. 试剂

（1）2%草酸溶液：草酸1g溶于100ml蒸馏水中。 （2） 2, 6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一 周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。 （3）标准抗坏血酸溶液（0.2mg/ml）: 准确称取20mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于2%草酸溶液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用前配制。

四．操作步骤

1．样品的处理和提取

（1）取材：称取4.0g样品洗净、切碎。 （2）研磨：样品置研钵中，加少量2%草酸溶液研磨成汁液，用2%草酸溶液冲洗转移至50ml离心管，3000r/min离心15min，上清转移到50ml容量瓶中，2%草酸溶液定容至50ml。 2. 空白测定

取2%草酸10ml，放入50ml三角瓶中，用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至三角瓶内溶液呈粉红色，15秒内不褪色为终点，记录所用滴定液体积，重复三次取平均值。

3.标定2,6-二氯酚靛酚钠溶液

取2ml标准抗坏血酸溶液加8ml 2%草酸溶液，置于50ml三角瓶内，用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至终点，记录所消耗2,6-二氯酚靛酚钠溶液的量，重复三次取平均值。 4．样品的测定

取样品液10ml，放入50ml三角瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的粉红色并保持15秒内不褪色，记录所消耗滴定液的体积，重复三次取平均值。

五．实验结果及分析

X=（V1-V2）

*K*V*100/(W*V3) K=0.2*2/(V0-V2)

其中X—100克样品所含维生素C毫克数（mg/100g） W—称取样品重（g）

V0—标定染料时滴定标准维生素C所消耗的染料毫升数 V1—滴定样品所用染料毫升数 V2—滴定空白所用样品液毫升数 V3—样品测定时所用样品液毫升数 V—样品提取液稀释之总体积

K—1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数

六、思考题

本实验方法的优缺点有哪些？

实验九 质粒DNA的提取与检测

一、实验目的

1、学习质粒 DNA 的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理；

2、掌握质粒 DNA 的提取方法； 3、掌握电泳检测DNA的方法。

二、实验原理

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分子,以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: DNA 的分子大

小，琼脂糖浓度，DNA 分子的构象，电源电压，嵌入染料的存在及离子强度等。

该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB） 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

三、材料、设备及试剂

1. 材料：含pET32a的E. coli DH5α菌株，1.5ml 塑料离心管(又称eppendorf 管),离心管架。 2. 设备：台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，移液枪(20μl,200μl,1000μl)及枪头，琼脂糖平板电泳装置，微波炉或电炉,紫外透射仪。 3. 试剂

（1）LB 液体培养基： 酵母膏 5g ，蛋白胨 10g ，NaCl 10g，加蒸馏水至 1000ml ，用NaOH和HCl调节pH 7.0~7.2，分装灭菌。

（2）LB 固体培养基：加1.5%琼脂粉的LB液体培养基，灭菌倒平板。

（3）氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。

（4）溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisHCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃。

（5）3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水中溶解40.81g NaAc•3H2O,用冰醋酸调pH 至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。 （6）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15 分钟,储存于4℃冰箱。 （7）溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释)，1％ SDS。

（8）溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

（9）RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于

-20℃。

（10）酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1(V/V/V)。 （11）TE 缓冲液：10 mmo/L TrisHCl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃ 冰箱中。

（12）电泳所用试剂：

①.TBE 缓冲液(5×)：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 ②.上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

③.溴化乙锭(:将EB 配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 四、操作步骤

1. 细菌的培养和收集

将含有质粒pET32a 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。 2. 质粒DNA快速提取

（1）取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心30 秒。

（2）弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

（3）菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。

（4）加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟。

（5）加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。

（6）上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5分钟。 （7）将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g 离心10 分钟。

（8）弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 离心5-10 分钟。

（9）吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10 分钟或室温干燥。

（10）将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。 3. 质粒DNA的检测

1、取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。

2、胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也

不可太快,否则容易出现气 泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、加样：取10μl DNA与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。 6、染色：未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中,室温下染色20-25 分钟。 7、观察：在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

五、实验结果及分析

六、思考题

琼脂糖凝胶电泳过程中影响DNA迁移率的因素有哪些？

实验十 PCR扩增目的基因

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

二、实验原理

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。

1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2. 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3. 引物的延伸：DNA模板－引物结合物在Taq

DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶。 三、仪器与试剂

1. 仪器与耗材：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，移液枪、离心管。 2. 试剂

（1）10×PCR Buffer

（2） dNTP （ 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为2.5 mmol/L ）

（3） M13 Forward 和Reverse引物（10 μM） （4） DNA模板 （质粒DNA，100 ng/μL ） （5） Taq DNA聚合酶（5 U/μL）

四、实验步骤

1. 反应体系：

在RCR管中加入以下反应体系。 反应物 10×PCR缓冲液 2.5mmol/L dNTP 上游引物 下游引物 Taq DNA聚合酶 模板DNA(1ng/μL) 加ddH2O至25μL

2.反应条件：

在PCR热循环仪上设置以下程序，按程序设置的条件进行扩增。

（1）94℃预变性5min； （2）94℃变性45s; （3）55℃退火45s； （4）72℃延伸60s；

（5）重复步骤（2）～（4）30次；

体积/μL 2.5 1.0 1.0 1.0 0.2 1.0 18.3

（6）72℃延伸10min； （7）4℃ ∞。

3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制1％琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电压120V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。

五、实验结果及分析 六、思考题

影响PCR反应效率的因素有哪些？