转基因番茄植株中通过细菌酶的表达调控乙烯合成

摘要：

乙烯，作为一种植物激素，其合成对于植物的多种发育过程是至关重要的。乙烯对于跃变型果实和蔬菜成熟过程的调控是其中最具特点的。降低乙烯合成的方法之一是调控乙烯的直接前体物质，1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）。土壤细菌中含有一种酶，称为ACC脱氨酶，这种酶可以使土壤细菌把ACC作为唯一氮源而生长。编码ACC脱氨酶的基因已被成功转入番茄植株。转基因植株中乙烯合成的降低没有引起任何植物表征的改变。但是，这些转基因植株结出的果实在成熟过程中却存在明显的延迟，而且，已经成熟的果实较没有转基因的植株果实会出现至少六周或者更长的时间才能软化。这些结果都表明，ACC脱氨酶对于检验乙烯在植物诸多发育过程和应急过程具有重要作用，同时还可以检验对那些被乙烯调控成熟的过程的果实和蔬菜的保质期的影响。 引言

乙烯是一种强有力的植物生长调控因子，影响多种生长发育过程，包括果实的成熟，衰老，以及应激反应。尤其是在跃变型果实的成熟过程中具有重要作用。乙烯合成和作用的化学抑制剂会使多种植物物种的果实成熟及花的衰老过程完全停止。在分子水平上，乙烯被认为是能够诱导许多基因的表达，其中包括成熟和病原体反应过程中涉及的基因。

乙烯从S-腺苷甲硫氨酸通过中间物质ACC进而合成得到。近期，编码ACC合成酶和ACC氧化酶的cDNA克隆成功。这些后来的基因的cDNA反向表达就会导致乙烯合成的减少和减慢离体的番茄果实的成熟。

在植物中，对于乙烯合成抑制的效力，要去除外源性功能作用以及其他化学抑制剂的摄取，应该允许确定的实验可以阐明乙烯在不同发育过程和应激反应现象中起的精确作用。在这里我们提供了一套系统来显示生长和生殖组织中的乙烯合成的下降，并描述其在番茄果实成熟过程中的影响。 结论

对于ACC降解酶的克隆

阻止乙烯合成的方法一般来说包括将乙烯前体，ACC，不可逆地降解，转化成非活性的复合物。目前，对于乙烯在植物体中的生物合成的认识指出，ACC是生理条件下乙烯合成过程的中间代谢前体。除了乙烯生物合成途径外，只有两种ACC的代谢反应是已知的。一种从土壤细菌，Pseudomonas sp 菌株ACPC中分离出来的，可以将ACC转化为α-丁酮酸的酶，另一种酶实在植物体中发现，可以将ACC酰化成丙二酰ACC。我们通过以最小中间产物ACC作为唯一氮源的情况下，机体的生长能力为指标，对具有ACC降解酶的近600种土壤细菌进行了筛选。其中，两种细菌从筛选对象中分离，并进一步鉴定。经过鉴定，均为Pseudomonas种。我们选择了其中之一的Pseudomonas sp 菌株6G5做进一步鉴定。黏粒文库依据基因组DNA建立并转入E. coil中。具有黏粒的E. coil细胞依据它们以ACC作为唯一氮源时的生长能力来进行筛选。一些被分离出来，18种被进一步测定。限制性内切酶降解模式指出，所有的黏粒克隆都包含一个6G5基因组的重叠区域。随后的亚克隆以及针对ACC作为中间产物最小剂量的生长情况的筛选，他们使用一个包含ACC降解酶基因的2.4kb的DNA片段。这个片段是基于DNA测序分析得出，显示出一个1017个核苷酸的单一开放阅读框，编码一个分子量36800的蛋白质分子，如图一所示。 ACC降解酶的测定

因为ACC降解酶的活性在先前的文件中已经有报道，依据此性质，就可以确定克隆基因中是否编码了ACC降解酶的序列。E. coli中6G5开放阅读框也是被设计成高水平表达的。图2中的第二栏表示E. coli 中recA启动子调控下的基因表达情况。可以看出正确大小的蛋

白被表达出来。细菌表达这种蛋白，就显示其具有将ACC降解为等摩尔的氨和α-丁酮酸的能力。为了确定6G5蛋白的存在，必须获得早前已经鉴定过的有机体， Pseudomonas sp 菌株ACPC，利用该有机体产生的ACC降解酶进行纯化，并且与已公布的标准做同质性检测。该蛋白经过氨基端氨基酸测序，前21个氨基酸已经确定。这21个氨基酸种的17个与预测的6G5序列表达出来的氨基酸是一致的，剩下不同的4个氨基酸中的2个是保守性的替换。因此6G5序列是编码ACC降解酶的。先前报道中，有活性的ACC降解酶的分子量为104000，而预测的亚单位的分子量为36800，可以推测该酶是以三聚体的形式存在的。 植物体中ACC降解酶的表达

ACC降解酶基因被放置在花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子之后，并受其调控，该基因用来转化UC82B番茄植株。然而，CaMV的35S启动子会在特定的组织中优先表达， 在大部分的组织中，启动子会表达出可检测的水平。因为乙烯参与多种植物生理反应，因此当植物体内对于乙烯的抑制时，可能会极大程度影响植物生长过程。然而，有一些的表现性正常的转基因植株可以从这些转化体中筛选出来。如图2所示，为植物组织中酶蛋白的印记杂交分析，结果表明，这些植株中很多能够高水平表达ACC降解酶的基因，产物量超过总蛋白的0.5%。

植物体的新叶组织中ACC降解酶表达最高的两个通道被用作乙烯生成分析。如表1所示，ACC降解蛋白表达最高的通道，5673，乙烯生成量降低了90%。在第二个实验中，这条通道显示出更高的效力，乙烯生成量的降幅达到97%。在ACC降解蛋白表达次高的通道，5854中，乙烯的降幅也达到了78%。这些数据都是由基因表达数据组合而成的。基于印记反应的数据，5673通道的ACC降解酶包含了大约0.5%的可溶性蛋白，而5854包含了大约0.05%。

纯和植株5673根据其表型效应进行检测。通过转基因植株获得的种子正常发芽，长出的植株与对照组在表型上并没有什么区别。同时，植株在花期和成熟期并没有出现延迟的情况，然而，他们却在成熟的过程上有着明显的不同。图3所示为，植株5673和UC82B的果实虽然在3天的时候乙烯的量都达到了峰值，但是5673果实的乙烯合成水平仅是UC28B的10%。表2和图4都表明了采摘后在破色期的果实延迟成熟的情况。对照组的果实经过7天从破色期到红熟期，仅仅2周后就出现明显的软烂。转基因组的果实经过24天后达到红熟期，并且在很长一段时间保持果实硬实。图4A图示在破色期摘下的果实，并将其放在室温下7天让其成熟。图4B图示了在破色期就摘下，室温储存4个月的果实过分成熟的的情况，而这种果实是有ACC降解酶表达的。图4C则图示了在植株上生长成熟的果实在同样条件下的情况。转基因的果实在超过40天的生长下仍然硬实并且没有脱落，而对照组的果实14天就脱落。 讨论

乙烯是已知的可以促进跃变型果实成熟的因素，并且是由ACC转化合成。因为ACC是目前已知参与到乙烯合成代谢途径的物质，所以，ACC的降解可能是乙烯合成过程中唯一起着生物化学上具有重要的抑制作用。可能是因为衰老组织中具有大量的ACC以及其代谢物丙二酰-ACC，因此具有降解ACC能力的微生物很容易从土壤中分离出来。我们在四大洲获得的样本中独立分离出来具有ACC降解酶的细菌。这些分离的基因转入番茄植株并表达，使得乙烯的产量大大降低。ACC的降解产物α-丁酮酸自然出现在植物体中。α-丁酮酸是乙酰乳糖合成酶的底物，因此α-丁酮酸在植物体中可以被转化成氨基酸侧链。

很有意思的是，实验组一些组织，例如，叶片和果实中的乙烯合成量大幅减少，这种现象除了正在成熟的果实中外，与对照组相比没有明显差别。这些结果证明了直到果实成熟之前，乙烯在植物生长中起到的作用不大。这也说明，转基因植株中持续合成的乙烯对于一般番茄的生长也是足够的。在实验室条件下，拟南芥的一种表形正常但对乙烯不敏感的突变的

存在，证明了，乙烯对于植株的作用与实验组直到果实成熟之前，乙烯在植物生长中起到的作用不大的情况一致。相反地，乙烯似乎是环境或生理条件改变至关重要的信号，例如在果实成熟期或者应急反应中。在这种情况下，环境对于转基因植株的细微差别是无法去除的。

另一种减少乙烯合成的方法，包括一种反转录基因的表达，会导致这种内源性的生物合成途径关闭。这种方法已经被证明能够有效延迟果实的成熟。因为ACC合成酶与ACC氧化酶都是多基因家族，每种酶的表达都是有严格的时效性和空间性，很难评价在不同器官中对于乙烯合成的抑制的效用。本文中所提及的方式是可以在植株各个部位减少乙烯合成的。此外，ACC脱氨酶通常用作乙烯在抗病性、环境应激性以及发育等方面所起作用的研究。

在表达编码ACC脱氨酶的基因的转基因番茄中，乙烯的抑制效用和成熟过程的延迟之间存在一定联系。对于储存在室温下的转基因番茄果实的直观观察也表面，软化过程存在着明显的延迟，果实较对照组保持坚硬要长五个月。在同样的时间，如图4B所示，对照组果实早已完全干瘪。ACC的降解会阻碍乙烯的合成，但是不会影响果实感知乙烯的能力，这好似因为，转基因果实一般是暴露于外源性乙烯中催熟的。所有这些因素表明，ACC脱氨酶会会使得番茄或其他跃变果实和蔬菜显著延长储存期。 方法

微生物的筛选

对保存的600种细菌菌株依据其分解ACC的能力进行筛选。大部分的微生物都是具有荧光的Pseudomonas 种，剩下的微生物在土壤中很据代表性。筛选是设计成选择那些在ACC作为唯一氮源，浓度只有3.0mM的最小值仍然可以生长的微生物。样品在96孔微量板30℃条件下培养4天。每个孔中包含0.2mLDF盐溶液，该溶液除去其他氮源，只保留ACC，含0.2%葡萄糖、0.2%葡萄糖酸、0.2%柠檬酸。筛选出来三种在含有ACC基质中生长的微生物。他们可以在含有ACC的基质中生长，这一现象通过将这些微生物再次在300mL同样的液体培养基中的生长来证明。选择在ACC基质中生长最好的两个菌种，分别标记为3F2和6G5，再做进一步分离。

为了准备从 Pseudomonas sp 菌株的6G5菌株中获得染色体DNA，在LB培养基进行培养，约200mL。将这些细胞收集起来，并重悬于10mL由25mM Tris-HCl、pH为8、10mM EDTA所配成的溶液中。最后加入浓度为1%的SDS溶液，将此悬浮液进行三次冷冻溶解循环，每个循环包括，将悬浮液放入干冰15分钟，再放入70℃水浴10分钟。之后，用等体积的苯酚、氯仿将该溶解产物萃取4次，再用乙醇使其沉淀。沉淀物重悬于5mL由10mM Tris、pH为7.5、1.0mM EDTA所配成的溶液中。6G5DNA被EcoRI部分分解，根据其大小分离在10%~40%的蔗糖浓度梯度溶液中。包含超过20kb DNA片段的碎片都被汇集在一起。由EcoRI切的pMON17016片段构成黏粒库，这个片段是黏粒载体pHC79的衍生物。pMON17016质粒中具有一个T7噬菌体中提出10启动子基因连接的克隆位点。黏粒文库被转入λ噬菌体中，通过厂商加工，再被转入Escherichia coli MM294。为了筛选具有ACC脱氨酶基因的黏粒克隆，将文库在包含3mM ACC作为唯一氮源的M9基质上涂平板。将平板在37℃条件下培养3天。大约56000个黏粒中的300个（每200中的一个）可以在平板上生长。

ACC脱氨酶的活性可以由其分解产物α-丁酮酸及氨的含量来测定。α-丁酮酸通过2，4-二硝基苯肼的衍生物来测定。氨通过谷氨酸脱氢酶测定工具来测定，该工具由Sigma公司出品。α-丁酮酸是通过反相离子高效液相色谱将固定相与其共洗脱来确定。检测的混合物需要用乙酸乙酯萃取2次，并弃水相。乙酸乙酯部分再用10%碳酸钠萃取，并将得到的水相直接加入C-18层析柱。样品在同等条件下用60%的甲醇，1.5%乙酸和1.0mM的四丁胺磷酸作为离子配对剂进行洗脱。洗脱物用分光光度计在374nm下检测。

一个长度为10.6kb的BamHI-Xbal片段包含ACC脱氨酶活性，此片段从一个黏粒中亚

克隆并转入pUC118中。随后通过HindIII和Smal切割，将具ACC酶活性的片段长度缩小至2.4kb。这条链通过美国生物化学公司DNA测序工具进行测序，一个长1017bp的ACC脱氨酶基因的开放阅读框被分离出来。 蛋白质测序

纯化过的ACC脱氨酶利用埃德曼分解法进行自动测序，测序仪器为应用生物系统470A蛋白质测序仪。

细菌基因的表达和抗体的制备

Ndel位点是在ATG起始位点上引进的由ACC脱氨酶开放阅读框直接诱变得到的。这个基因被亚克隆为一段1127bp的Ndel-Hindlll片段，并转入E. coli表达载体中，该载体包含recA启动子和基因10前导序列。这个质粒，pMON10078，被转入E. coli W3110中，并置于50μg/mL的萘啶酸中，37℃培养20小时，使基因表达。细胞颗粒进行再悬和超声波处理1分钟，使可溶性和不可溶性的片段在10%~20%的变性胶进行跑胶。最大的条带的分子量大约37000，联系到我们预测的ACC脱氨酶的分类为36800，条带出现在不溶性的部分。样品依据其氨基末端的氨基酸序列测定。用1.5mg蛋白感染山羊来得到抗体。 ACC脱氨酶在番茄内的表达

一个从pMON10027质粒中提取的，长度为1071bp，含有ACC脱羧酶开放阅读框的EcoRv-Sacl片段，被克隆到转运载体pMON893中。这个过程讲开放阅读框添加到复制的CaMC 35S启动子上和豌豆的rbcS-E9基因3’末端。这个质粒载体利用协助质粒pRK2013通过三亲本联合体系转入农杆菌ABI菌株。ABI菌株是C58农杆菌携带去除pTiC58的质粒pMP90Rk。转化结合子通过Luria平板筛选，该平板组分为50μg/mL的卡那霉素，25μg/mL的氯霉素，100μg/mL壮观霉素。番茄UC82B叶片组织通过McCormik描述的过程进行改造。果实将如Kader和Morris所描述，依照其成熟度来分级。最小的10个果实来作为每个实验点的代表。在这个实验中，果实的软硬度依靠观察而非定量测定。 乙烯的测量

乙烯的产生量通过以下方法测定。将整个果实或者叶片放置在密闭容器中，一小时后抽出1.0mL空气。通过装备有氧化铝柱和火焰电离检测器的气体色谱测定乙烯含量。 蛋白质凝胶印记

将蛋白质样品在凝胶上样缓冲液中煮沸3分钟，并在4%~20%的聚丙烯酰胺迷你蛋白II准备胶中电泳。蛋白质通过MilliBlot-SDE电印记装置转移到硝化纤维膜上。将膜在4℃、1%BSA、10mM Tris、pH为8、150mM 氯化钠、0.05%Tween20（洗涤缓冲液）条件下培养一夜。为了使摸容易杂交，培养之后在室温下温和搅拌。ACC脱氨酶的一抗结合到在1:1000的山羊血清及洗涤缓冲液中培养1小时的膜上。紧接着，用洗涤缓冲液洗涤膜三次，每次10分钟。二抗在5μC的碘125标记的G蛋白和20mL的洗涤缓冲液条件下结合到膜上。用0.1%Triton X-100溶液洗涤膜4次，每次10分钟，并显影。