RNA干扰综述

RNAi研究及其进展

公光业 M110107259

前言

RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一 种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学 成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。

正文

RNAi的发现：

上世纪 90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家 Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉 (Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现象称为消除作用(quelling或基因压制)。

1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。

这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首 次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，

是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R-

NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，

与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。

RNAi作用机制:

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，

继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。

研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。

3 RNAi作用的特点

3.1 高序列特异性

RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19nt的dsNRA几乎可以完全抑制基因的表达,而将其中的1nt突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源的mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA，从而实现对目的基因的精确沉默。因此，

RNAi具有重大的医学价值。

3.2高效性

RNAi存在级联放大效应,由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA的结合并降解后者，产生新的siRNA，新产生的siRNA可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同源mRNA降解的多次利用，

如此循环，使相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能产生强烈的NRAi效应(每个细胞仅需几分子siRNA就可产生RNAi效应)，并可达到缺失突变体表型的程度。相比普通的siRNA，具有短发卡结构的双链RNA(short hairpin RNA,shRNA)产生的NRAi

效应更强。

3.3 RNAi抑制作用迅速

RNAi基因的表达发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA的快速降解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。

3．4 RNAi作用的靶基因位点有选择性

外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响，以内含子或启动子序列构成的外源dsRNA无法引起

RNAi效应.

3.5具有高稳定性

与反义寡核昔酸不同,siRNA是3’端悬挂TT碱基的双链RNA,所以化学性质很稳定,无须像反义核昔酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。

3.6可传播性和可遗传性

RNAi抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，在不同的细胞间长距离传递和维持。在线虫中干涉效应可以传递到子代，但这种遗传只限于子一代，子二代往往又恢复到野生型

3.7 RNAi效应的依赖性

只有连续输dsRNA，沉默效应才能持续下去，否则将产生短暂的沉默反应，而且这种效应的强度与初始dsRNA的浓度有关。

4 siRNA的设计与合成

RNAi技术在基因功能研究，以至于基因治疗方面显示出巨大的前景。双链siRNA的设计、合成是进行RNAi研究的关键。根据目前发表的文献和一些实验经验，siRNA的设计可遵循以下几点进行:

(1)选择以碱基A或G开始的91-12碱基大小的目的mRNA。因为

RNA polyMeraseⅢ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能起作用。（2）针对目的mRNA一般选择2-4个不同序列，CG含量为30%-50%，避免4个碱基T或A的连续序列，避免选择起始密码下游50-100碱基、终止密码上游100碱基以及5和3端的非编码区域，BLAST检查设计序列的特异性。(3)设计适当的实验对照，比如设计有1-2个碱基错配的序列，或者是随机变更siRNA的碱基排列顺序。

siRNA的制备方法有体外制备和体内表达，前者是在体外制备siRNA，然后导入细胞，而后者则导入DNA使之在细胞内表达siRNA。根据具体方法可进一步划分，下面分别予以介绍。

体外制备法包括：（1）化学合成 这是最简单、快速的体外制备方法。目前有许多基因公司能提供多种siRNA的合成，但其价格昂贵，

不适合筛选siRNA等长时间的研究。（2）体外转录 通过合成得到DNA

Oligo模版,应用试剂盒体外转录合成siRNA。相对化学合成法而言,这是一种性价比高的筛选siRNA的好方法.

体外合成法效率低,表达短暂,因此又发展了体内表达法。

（1）RNaseⅢ消化长片断双链RNA制备siRNA

与其他制备方法相比,它不需要设计和检验多个siRNA序列以 便找到一个最有效的siNRA。它选择200-1000Pb的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片段的dsNRA，

然后应用RNaseⅢ(或Dicer)在体外消化,得到一个siRNA的混合体,除去未消化的dsRNA后,将siRNA直接转染细胞,它能保证目的基因被有效抑制。

（2）siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶Ⅲ启动子（polⅢ）中的一种(目前常用的是人源和鼠源U6启动子或者人源H1启动子),操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。这种方法是合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后，克隆到相应载体的polⅢ启动子下游。siRN表达载体的优点在于可以进行长期研究。

（3）siRNA表达框架

siRNA表达框架(SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法包括一个NRA polⅢ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA polⅢ终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等的步骤,可以直接由PCR得到。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRN A和长效抑制的研究。

RNAi的应用

RNAi在探索基因功能中的应用：

人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达

产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。 RNAi在基因治疗领域中的应用：

RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

RNAi在整形外科领域的应用前景：

已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。

最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为

原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。

瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βII型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和III型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。

病毒性疾病的治疗：

加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。

遗传性疾病的治疗：

美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi同脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。

肿瘤病的治疗：

肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。 尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞，却不能有效的靶向肿瘤细胞，因此，在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡，实现靶向肿瘤细胞同样也是以 RNA 干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。目前已有很多针对不同基因的RNA干扰在体内和体外有效的抑制了肿 瘤 细 胞 的 生 长，这 些 目 的 基 因 包 括 ：B c l-2 、survivin、EGFR、VEGF 等。RNA 干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，R NA 干扰技术设计更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。

在植物学中的应用：

Napoli等将1个查尔酮合成酶基因(chs)置于1个强启动子后导人矮牵牛(Petunia hybrida)，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了

花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制(co-suppression)。类似的结果同样在真菌脉胞菌(Neurospora crassa)中和其它转基因植物中存在。对于部分转基因植物来说，基因沉默可能是因为特异基因的甲基化而导致，这被称为转录水平基因沉默。但确实部分植物中的基因沉默是在转录后发生的，这被称为转录后基因沉默。实验表明在发生PTGS的个体中同源转录确实存在，但是很快在胞浆中被降解，没有积聚。Palauqui等进一步证实，在植物中将出现转基因沉默的植株嫁接到另一没有基因沉默的转基因植株中同样可以导致PTGS，但对非转基因植株却无效。 Cogoni等证实PTGS由一种可扩散的反式作用分子所介导。

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