含抗草甘膦 CP4-EPSPS 基因和耐逆 Trihelix 类转录因子GmGT-2 A基因的植物

浙江农业学报Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｚｈｅｉｆａｎｇｅｎｓｉｓ，２０１５，２７（２）：１３３—１４０　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｊｎｙｘｂ．ｃｎ　李雁杰，朱丹华，冯小锋，等．含抗草甘膦ＣＰ４一肼　ｓ基因和耐逆Ｔｒｉｈｅｌｉｘ类转录因子ＧｍＧＴ－２Ａ基因的植物表达载体构　建及转化验证［Ｊ］．浙江农业学报，２０１５，２７（２）：１３３—１４０．　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４—１５２４．２０１５．０２．０１　含抗草甘膦ＣＰ４．剧　Ｓ基因和耐逆Ｔｒｉｈｅｌｉｘ类转录因子　ＧｍＧＴ－２Ａ基因的植物表达载体构建及转化验证　李雁杰　，朱丹华　，冯小锋　，高　莎　，杨清华　，董德坤　（’浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，浙江杭州３１００２１；２浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华３２１００４；　长江大　学园艺园林学院，湖北荆州４３４０２３）　摘要：高效易用的植物表达载体在基因功能相关研究中起着重要的作用。以植物表达载体ｐＢＡ００２为基础　载体，使用抗草甘膦ＣＰ４一ＥＰｓ尸．ｓ基因替换原载体的Ｂａｒ筛选标记基因，获得新的植物表达载体ｐＥＳＯ０２。将　大豆耐逆相关Ｔｒｉｈｅｌｉｘ类转录因子ＧｍＧＴ－２Ａ连接到ｐＥＳＯ０２，构建了同时含耐逆相关基因和抗除草剂标记基　因的植物表达载体ｐＥＳ００２．ＧｍＧＴ－２Ａ。利用农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥，并对转基因植株进行抗草　甘膦和耐盐性鉴定。结果表明，转基因植株在抗草甘膦和耐盐性上均显著强于对照，表明该载体可以用于转　基因相关的基因功能研究。　关键词：ＣＰ４一ＥＰ５Ｐ５；ＧｍＧＴ－２Ａ；草甘膦；转录因子；表达载体　中图分类号：Ｑ　７８　文献标志码：Ａ　文章编号：１００４—１５２４（２０１５）０２－０１３３－０８　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｂｏｔｈ　ｈｅｒｂｉ－　ｃｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ＣＰ４．ＥＰｓＰｓ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＧｍＧＴ－２Ａ　ＬＩ　Ｙａｎ－ｊｉｅ　＇　，ＺＨＵ　Ｄａｎ—ｈｕａ’，ＦＥＮＧ　Ｘｉａｏ—ｆｅｎｇ　，ＧＡＯ　Ｓｈａ　，ＹＡＮＧ　Ｑｉｎｇ—ｈｕａ　，ＤＯＮＧ　Ｄｅ—ｋｕｎ　，　（　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｚｈｅｉｆａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２１，Ｃｈｉｎａ；　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｈｕａ　３２１００４，Ｃｈｉｎａ；　Ｃｏｌ—　ｌｅｇｅ　ｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｙａｎｇｔｚｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ　４３４０２３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｅａｓｙ—ｔｏ—ｕｓｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｅ－　ｔｉｏｎｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｔｏ　ｒｅｐｌａｃｅ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｍａｒｋｅｒ　Ｂａｒ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＢＡ００２．Ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ａｓ　ｐＥＳ００２．Ａ　Ｔｒｉｈｅｌｉｘ　ｔｒａｎ—　ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＧｍＧＴ－２Ａ　ｗａｓ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｌｉｇａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＥＳ００２　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ，ｎａｍｅｌｙ　ｐＥＳ００２一ＧｍＧＴ－２Ａ．Ｔｈｉｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｂｙ　ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐｐｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ　ａｎｄ　ＧｍＧＴ－２Ａ　ｇｅｎｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　ｇｒｅａｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｂｏｔｈ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｓｔｒｅｓｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｗｏｒｋｅｄ　ｗｅｌ１．Ｔｈｕｓ，ｔｈｉｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＣＰ４一Ｅ尸ＳＰＪｓ；ＧｍＧＴ－２Ａ；ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　收稿日期：２０１４－０２．２７　基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（２０１２ＺＸ０８００９００４，２０１３ＺＸ０８００４００２）　作者简介：李雁杰（１９８８一），女，山西大同人，在读硕士研究生，研究方向为大豆分子育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙａｎｊｉｅ０３５２＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｒｎ　通讯作者，董德坤，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｄｅｋｕｎ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ　浙江农业学报第２７卷第２期　现代生物技术和基因工程的迅速发展，为通　过转基因技术研究未知基因功能或改造生物体　个别性状创造了良好的条件。转基因技术在植　物抗逆、抗病以及品质相关基因的功能验证及进　一步应用中起到了尤为重要的作用。而高效易　用的遗传转化表达载体则是植物转基因研究中　的一个重要环节。　在植物转基因过程中，选择经济适合的筛选　标记显得至关重要。目前大约有５０多种标记基　因被用于转基因植物研究和评价，如卡那霉素、　潮霉素等抗生素类标记基因…，草丁膦、草甘膦　基因等除草剂抗性基因　Ｊ，磷酸甘露糖异构酶基　因等糖类代谢标记基因　，甜菜碱醛脱氢酶基因　ＢＡＤＨ　Ｊ、耐锂基因ＧｍＣＡＸ１＿５　等等。由于标记　基因各自的特性，不同种类的标记基因往往存在　诸如生物安全性、操作复杂、遗传稳定性、不够经　济适用等问题。相比之下，抗草甘膦本身就是一　个优异的目标性状。抗草甘膦作物占全球转基　因作物种植面积的一半以上。因而选用抗草甘　膦基因作为筛选标记基因进行遗传转化，既可以　得到具有双重性状（抗草甘膦和转入目标基因性　状）的转基因材料，同时又具有后期筛选操作简　单经济等优点，是植物遗传转化的一个相对理想　的筛选标记。　干旱、高盐、冻害等非生物胁迫因素是造成　农作物损失的重要原因，在这些不利因素的作用　下，植物体已经进化出一套抵御外界不利环境的　复杂调控体系　Ｊ。在逆境胁迫信号传递途径中，　转录因子通过跟真核基因启动子区域的顺式作　用元件发生作用，调节下游干旱、高盐、低温等逆　境胁迫基因的表达，进而改变植物细胞和外部形　态特征，减少不利环境给植物带来的伤害　Ｊ。　目前，已有许多关于过表达转录因子基因提高植　物抗逆性的报道　。　Ｔｒｉｈｅｌｉｘ家族转录因子是新近发现的一类转　录因子，根据不同的结构，被分为ＧＴ－１，ＧＴ－２，　Ｇ　，ＳＨ４和ＳＩＰ１　５个亚家族，在植物响应盐胁　迫、干旱胁迫和冷胁迫等非生物胁迫过程中具有　重要的功能¨　”　。Ｔｒｉｈｅｌｉｘ家族转录因子在拟南　芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｒｅ）、大　豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　Ｍｅｒｒ．）、烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　Ｌ）等作物中均有存在ｌ１８１。ＧｍＧＴ－２Ａ是从大豆　中克隆得到的Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子，属于ＧＴ－２亚家　族。研究表明，它在大豆幼苗受到不同盐、冷、干　旱等胁迫时表达量升高，在拟南芥中过量表达可　提高植物对冷胁迫、干旱胁迫、盐胁迫等的耐　受性　。　本研究以植物表达载体ｐＢＡＯ０２为基础载　体，构建了以抗草甘膦ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ基因为筛选标　记基因，同时含有耐逆相关Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子　ＧｍＧＴ－２Ａ的植物表达载体ｐＥＳ００２一ＧｍＧＴ－２Ａ；而　后转化拟南芥，对筛选标记基因和耐逆目标性状　基因的功能进行了验证。　１　材料与方法　１．１　材料　植物表达载体ｐＢＡ００２由中国科学院遗传与　发育生物学研究所陈受宜研究员惠赠；含有Ｔｒｉ　ｈｅｌｉｘ转录因子基因的植物表达载体ｐＣａｍ．　ｂｉａ３３００一ＧｍＧＴ－２Ａ由杭州国家大豆改良分中心保　存；大肠杆菌菌株ＤＨ５ｃ￣购自ＴｒａｎｓＧｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　公司；ＧｏＴａｑ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｉｘ、Ｔ４一ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏ．　ｍｅｇａ公司；核酸分子量标准购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；　限制性核酸内切酶购自ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ　公司；高保真ＰＣＲ酶ＫＯＤ．Ｐｌｕｓ、克隆载体Ｔａｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ　一Ｐｌｕｓ购自ＴＯＹＯＢＯ公司；质粒提取试剂　盒、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自Ａｘｙｇｅｎ公司。克　隆与检测引物等由上海生工生物工程股份有限　公司合成。氨苄青霉素及壮观霉素购自Ｓｉｇｍａ公　司，其他试剂均为分析纯。　１．２方法　１．２．１　ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ与ＧｍＧＴ－２Ａ基因的高保真　螬　根据ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ５９６９４８．１）及　ＧｍＧＴ－２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ２２１７５３．１）序列设计扩增　引物，并根据相关限制性内切酶位点及植物表达　载体ｐＢＡ００２的多克隆位点信息，在ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ　上下游引物的５　端分别引入　ｆ　ｉｉ的酶切位点，　上游引物ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ—Ｆ：５　一ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＴＧ　Ｃ３Ｗ　ＣＡＣ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　Ａ－－５，下游引物ＣＰ４一　ＥＰＳＰｓ—Ｒ：５　ｒ—ＧＣＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＡＧＣ　Ｃｎ　ＡＧＴ　ＧＴＣ　ＧＧ－３　（下划线部分为船ｆ　ＩＩ酶切位　点），预期产物大小为１　３６８　ｂｐ。在ＧｍＧＴ－２Ａ上　李雁杰，等．含抗草甘膦ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ基因和耐逆Ｔｒｉｈｅｌｉｘ类转录因子ＧｍＧＴ－２Ａ基因的植物表达载　体构建及转化验证　・１３５。　下游引物的５　端分别引入Ｘｂａ　Ｉ和Ｓａｃ　Ｉ的酶切　菌双蒸水至５Ｏ　ＩｘＬ，３７℃温育４　ｈ。酶切产物经　１％琼脂糖凝胶电泳，紫外拍照后用Ａｘｙｇｅｎ凝胶　回收试剂盒对ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ（片段大小约１．４　ｋｂ）　与ｐＢＡ００２载体大片段（片段大小约１０　ｋｂ）进行　割胶回收。　位点，上游引物Ｘｂａ　Ｉ—ＧｍＧＴ－２Ａ—Ｆ：５　一ＧＧＣ！　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　Ｇ．３　（下划线部分为Ｘｂａ　Ｉ酶切位点），下游引物　ＧｍＧＴ－２Ａ．Ｓａｃ　Ｉ．Ｒ：５　．ＧＧＣ　ＧＡＧ　ＣＴＣ　ｒｒＡ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　ＴＧＣ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　Ａ．３　（下划线为　目的片段的连接：将回收后的ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ与　Ｓａｃ　Ｉ酶切位点），预期产物大小１　５０３　ｂｐ。　利用ＣＴＡＢ法　提取进口转基因商品大豆　ｐＢＡ００２大片段进行连接：反应体系含Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　２　Ｕ，摩尔比约１：３的ｐＢＡ００２大片段与目　的基因组ＤＮＡ，然后通过高保真ＰＣＲ扩增ＣＰ４－　ＥＰＳＰＳ基因。同时利用高保真酶从ｐＣａｍ—　ｂｉａ３３００．ＧｍＧＴ－２Ａ质粒中扩增Ｔｒｉｈｅｌｉｘ类转录因　子基因ＧｍＧＴ－２Ａ。　高保真ＰＣＲ扩增的反应体系如下：终浓度　０．３　Ｉｘｍｏｌ・Ｌ　的上下游引物，１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ．Ｐｌｕｓ，０．２　ｍｍｏｌ・Ｌ～ｄＮＴＰｓ，１．５　ｍｍｏｌ・Ｌ一　ＭｇＳＯ４，１　Ｕ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ，ｐＣａｍｂｉａ　３３００一ＧｍＧＴ－２Ａ质　粒约５０　ｎｇ或进口转基因大豆基因组ＤＮＡ约１００　ｎｇ，然后补充双蒸水至总体积为５０　。ＰＣＲ反　应参数为：９４℃预变性２　ｍｉｎ；９４℃变性１０　Ｓ，５８％　退火３０　Ｓ，６８℃延伸９０　ｓ，共３５个循环；６８℃延伸　１０　ｍｉｎ；ＰＣＲ产物４￣Ｃ保存。取８　ＩｘＬ　ＰＣＲ产物进　行１％琼脂糖凝胶电泳分离，观察电泳结果并　拍照。　１．２．２　高保真ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆与验证测序　ＰＣＲ产物两端加Ａ反应：根据Ｔａｒｇｅｔ　ＣｌｏｎｅＴＭ－Ｐｌｕｓ试剂盒说明书，９　ＩｘＬ　ＰＣＲ产物与１　Ｌ　１０×Ａ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ充分混合，６０℃反应３０　ｒａｉｎ。　加Ａ反应产物的克隆：加Ａ反应产物１　ＩｘＬ，　２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　５　ｐ．Ｌ，ｐＴＡ２　Ｖｅｃｔｏｒ　５０　ｎｇ（１　Ｌ），Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　１　Ｌ，灭菌蒸馏水补充至１０　Ｌ，置于室温（２０℃）反应３０　ｒａｉｎ，构建重组质粒　ｐＴＡ２一ＧｍＧＴ－２Ａ及ｐＴＡ２．ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ　将上述连接产物分别转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，　并进行菌落ＰＣＲ检测。ＰＣＲ检测阳性的菌落转　入含有５０　ｍｇ・Ｌ　氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基　中，３７℃，２００　ｒ・ｒａｉｎ　培养过夜，并将菌液送上海　桑尼生物科技有限公司进行测序鉴定。　１．２．３　重组质粒ｐＥＳ００２的构建与验证　ｐＢＡ００２与ｐＴＡ２－ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ的双酶切：取２　支２００　ＩｘＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，分别加入２　ｇ的　ｐＴＡ２一ＣＰ４一ＥＰｓＰｓ和ｐＢＡ００２质粒，５　１０　Ｘ　ＮＥＢｕｆｆｅｒ　４，０．５　ＩｘＬ　１００×ＢＳＡ，２　ｔｘＬ　Ｂｇｌ　１Ｉ，加灭　的基因ＣＰ４一Ｅ尸５Ｐｓ，终浓度１　Ｘ的Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ，　２２ｑＣ连接１　ｈ构建重组质粒，并命名该载体为　ｐＥＳ００２。重组质粒经冻融法转化大肠杆　菌ＤＨ５ａ。　ｐＥＳ００２的菌落ＰＣＲ检测：ＣＰ４一肼）５Ｐ５基因　的上下游检测引物分别为：ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＴＧ　ＣＴＴ　ＣＡＣ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　Ａ／ＧＣＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＡＧＣ　ＣＴＹ　ＡＧＴ　ＧＴＣ　ＧＧ，目标产物大小为　１　３６８　ｂｐ；其构建特异性ＰＣＲ检测上游引物位于　载体ＣＰ４一ＥＰＳＰＳ上，下游引物位于载体ｐＥＳ００２　上，序列分别为：ＧＣＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＡＧＣ　ＣＴＴ　ＡＧＴ　ＧＴＣ　ＧＧ／ＴＣＡ　ＴＡＴ　ＴＡＡ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＴＣＡ　１ＴｒＡ　ＧＡＧ　ＧＣ，目标产物大小为１　７８７　ｂｐ。　挑取菌落ＰＣＲ检测阳性，构建特异性检测连　接方向正确的克隆于含有５０　ｍｇ・Ｌ　壮观霉素的　ＬＢ培养基中，３７￣（２，２００　ｒ・ｍｉｎ　培养过夜，并使　用Ａｘｙｇｅｎ质粒提取试剂盒提取质粒。　１．２．４　重组质粒ｐＥＳ００２一ＧｍＧＴ－２Ａ的构建与　验证　ｐＥＳ００２与ｐＴＡ２一ＧｍＧＴ－２Ａ质粒的双酶切：２　支２００　ＩｘＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中分别加入ｐＴＡ２－　ＧｍＧＴ－２Ａ质粒与上一步构建好并测序验证过的　新质粒ｐＥＳ００２各２　ｇ，５　１０×ＮＥ　Ｂｕｆｆｅｒ　４，　０．５　ＩｘＬ　１００×ＢＳＡ，１　ｖ，Ｌ　Ｓａｃ　Ｉ—ＨＦ，１　ｔｚＬ　Ｘｂａ　Ｉ，　加灭菌双蒸水至５０　Ｌ，３７ｑＣ温育８　ｈ。酶切产物　经１％琼脂糖凝胶电泳，紫外拍照后用Ａｘｙｇｅｎ凝　胶回收试剂盒对目的基因ＧｍＧＴ－２Ａ与ｐＥＳ００２大　片段进行割胶回收。　将回收后的目的基因ＧｍＧＴ－２Ａ与ｐＥＳ００２大　片段进行连接：反应体系含Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　２　Ｕ，　摩尔比约１：３的ｐＥＳ００２大片段与目的基因　ＧｍＧＴ－２Ａ，终浓度１×的Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ，２２℃连接　１　ｈ构建重组质粒ｐＥＳ００２一ＧｍＧＴ－２Ａ，重组质粒经　冻融法转化大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ。　浙江农业学报第２７卷第２期　高效遗传转化，同时目的基因和筛选标记基因正　常表达；转基因植株抗除草剂和耐盐性显著提　高。研究结果一方面肯定了载体的可用性，另一　方面进一步验证了过量表达ＧｍＧＴ－２Ａ基因可以　提高植物的耐逆性。由于转基因后代筛选过程　中只要喷施除草剂即可，极大减少了操作的繁琐　性，因而该载体具有简单易用的特性，可以进一　步用于转基因相关的科学研究。　参考文献：　［１］Ｍｉｋｉ　Ｂ，Ｍｃｈｕｇｈ　Ｓ．ｓｅｌｅｃｔａｂ１ｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔｓ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｈｅｍａｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｓａｆｅｔｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ－　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１０７（３）：１９３—２３２．　［２］侯爱菊，朱延明，张晶，等转基因植物中筛选标记基因的　利用及消除［Ｊ１．遗传，２００３，２５（４）：４６６—４７０．　［３］　Ｉ，ｕｃｃａ　Ｐ，Ｙｅ　Ｘ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａ　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｎｎｏｓｅ　ａｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ　［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００１，７（１）：４３—４９．　［４］Ｄａｎｉｅｌｌ　Ｈ，Ｍｕｔｈｕｋｕｍａｒ　Ｂ，Ｌｅｅ　ＳＢ．Ｍａｒｋｅｒ　ｆｒｅｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔｓ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｅｉ￣ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，３９（２）：１０９—１１６．　［５］　黄文佳，李永光．王志坤，等．氯化锂作为转基因大豆筛选　剂的研究［Ｊ］．大豆科学，２０１２，３１（４）：５５２—５５６，５６７．　［６］　Ｖｉｊ　Ｓ，Ｔｙａｇｉ　ＡＫ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｃｒｏｐ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏ—　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，５（３）：３６１—３８０．　［７］　Ｓｉｎｇｈ　ＫＢ，Ｆｏｌｅｙ　ＲＣ，Ｏｆｉａｔｅ—Ｓ￣ｍｅｈｅｚ　Ｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，５（５）：４３０—４３６．　［８］　Ｕｄｖａｒｄｉ　ＭＫ，Ｋａｋａｒ　Ｋ，Ｗａｎｄｒｅｙ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｌｅｇｕｍｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ—　ｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ：ｇｌｏｂａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｒｅ—　ｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｎｌｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，１４４　（２）：５３８—５４９．　［９］Ｌｉｕ　Ｃ，Ｍａｏ　Ｂ，Ｏｕ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．ＯｓｂＺｌＰ７１，ａ　ｂＺＩＰ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ，ｃｏｎｆｅｒｓ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，８４（１—２）：１９—３６．　［１０］　Ｒａｏ　ＳＳ，Ｅ１一Ｈａｂｂａｋ　ＭＨ，Ｈａｖｅｎｓ　ＷＭ，ｅｔ　ａ１．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧｍＣａＭ４　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ａｎｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　２０１４，１５（２）：１４５—１６０．　［１１］Ｌｉｕ　ＱＬ，Ｘｕ　ＫＤ，Ｐａｎ　ＹＺ，ｅｔ　ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｏ・　ｖｅｌ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ＷＲＫＹ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４，　３２：２８２—２８９．　［１２］　ＩＪｉ　ＣＢ，Ｚｈｏｕ　ＡＬ，Ｓａｎｇ　Ｔ．Ｒｉｃｅ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ【ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１１（５７６９）：１９３６—１９３９．　［１３］Ｌｉｎ　ＺＷ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　ＭＥ，Ｌｉ　ＸＲ，ｅｔ　ａ１．Ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｓｈａｔｔｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｒｉｃｅ（　Ⅱｓａｔｉｖａ　Ｌ．）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２０Ｏ７，２２６（１）：１１—２ｏ．　［１４］　Ｇａｏ　ＭＪ，Ｌｙｄｉａｔｅ　ＤＪ，Ｌｉ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｍａｔｕｒａ．　ｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ａ　ｔｒｉｈｅｌｉｘ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２００９，２ｌ（１）：５４—７１．　［１５］Ｆａｎｇ　ＹＪ，Ｘｉｅ　ＫＢ，Ｈｏｕ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧＴ　ｆａｃｔｏｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｒｅｖｅａｌｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｌ　Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，　２８３（２）：１５７—１６９．　［１６］　Ｗｉｌｌｍａｎｎ　ＭＲ，Ｍｅｈａｌｉｃｋ　ＡＪ，Ｐａｃｋｅｒ　ＲＬ，ｅｔ　ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｔｉｍｉｎｇ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１　１，１５５（４）：１８７１—１８８４．　［１７］　Ｋａｐｌａｎ—Ｌｅｖｙ　ＲＮ，Ｂｒｅｗｅｒ　ＰＢ，Ｑｕｏｎ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｔｒｉｈｅｌｉｘ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ－ｌｉｇｈｔ，ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，１７（３）：１６３—１７１．　［１８］罗军玲，赵娜，卢长明．植物Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子家族研究进　展［Ｊ］．遗传，２０１２，３４（１２）：１５５１—１５６０．　［１９］Ｘｉｅ　ＺＭ，Ｚｏｕ　ＨＦ，Ｌｅｉ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｓｏｙｂｅａｎ　ｔｒｉｈｅｌｉｘ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ＧｍＧＴ－２Ａ　ａｎｄ　ＧｍＧＴ－２Ｂ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，　２００９，４（９）：ｅ６８９８．　［２０］　Ｍｕｒｒａｙ　ＭＧ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＷＦ．Ｒａｐｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉ【ｇｈ　ｍｏｌｅｃｕ—　ｌａｒｗｅｉｇｈｔ　ｐｌａｎｔ　ＤＮＡ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｓｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８０，８：　４３２１—４３２５．　（２１］Ｃｌｏｕｇｈ　ＳＪ，Ｂｅｎｔ　ＡＦ．Ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐ：Ａ　ｓｉｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・・ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ－—　ａｒｉａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８，１６（６）：７３５—７４３．　［２２］Ｊａｍｅｓ　Ｃ．２０１１年全球生物技术／转基因作物商业化发展　态势【Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１１，３１（３）：１—１２．　［２３］Ｒｏｙ　ＳＪ，Ｎｅｇｒａ５　Ｓ，Ｔｅｓｔｅｒ　Ｍ．Ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃｒｏｐ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，２６：１１５—１２４．　［２４　Ｊ　Ｈｒｍｏｖａ　Ｍ，Ｌｏｐａｔｏ　Ｓ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ—　ｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｍ］／／Ｔｕｂｅｒｏｓ　ａ　Ｒ，Ｇｒａｎｅｒ　Ａ，Ｆｒｉｓｏｎ　Ｅ．Ｇｅ．　ｎｏｍｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．２０１４：２９１—３１６．　［２５］　Ｚｈｕ　ＪＫ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｕｓｉｎｇ　Ａｒａｂｉ—　ｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２４：９４１—９４８．　［２６］　Ｚｈｕ　ＪＫ．Ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｔｈｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒｎａｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐｌａｎｔｓ　【Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，５３：２４７—２７３．　［２７］Ｚｈｕ　ＪＱ，Ｚｈａｎｇ　，Ｔａｎｇ　Ｐｄ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴｈｌＰＫ２，ａｎ　ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｈｏｍｏ—　ｌｏｇ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ　ｈａｌｏｐｈｉｌａ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｓ　ｃｎ　ｎａｐｕｓ［　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２００９，１３６（４）：４０７—４２５．　［２８］马晓丽，朱丹华，李雁杰，等．ＰＨＤ类转录因子ＧｍＰＨＤ２　和Ｂａｒ基因的植物表达载体的构建［Ｊ］．科技通报，２０１３，　２９（１）：５７—６２．　（责任编辑张韵）