乙型肝炎患者YMDD变异的检测及意义

临床研究

乙型肝炎患者YMDD变异的检测及意义

普　冬,吴芳华,刘红伟(云南省昆明市第三人民医院检验科　650041)

　　【摘要】　目的　了解拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)DNAYMDD变异的存在情况及意

义。方法　采用聚合酶链反应结合Taqman荧光技术检测昆明市第三人民医院201例拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎患者HBVDNAYMDD变异,对发生HBVDNAYMDD变异的99例患者的HBVDNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及HBVDNAYMDD变异情况进行分析。结果　201例拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎患者中检出HBVDNAYMDD变异共99例(阳性率49.25%),野生株49例,占24.3%(49/201),53例未检出病毒株,占26.3%(53/201),发生YMDD变异株患者有60.3%ALT异常。结论　拉米夫啶在HBVYMDD变异中起主导作用,并且该变异的发生率随着拉米夫啶用药时间的延长而增加;HBVYMDD变异的发生同血清HBVDNA水平相关。

【关键词】　慢性乙型肝炎;　拉米夫啶;　YMDD变异中图分类号:R512.62文献标志码:A文章编号:167229455(2008)2421506202　　拉米夫啶是常用的核苷类抗乙型肝炎病毒(HBV)药物,对HBV有明显抑制作用,但随着拉米夫啶的广泛应用,逐步发现它同时存在可产生HBVDNAYMDD变异的情况。为了解拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎患者YMDD变异的存在状况及意义,笔者对本院201例拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎患者进行了HBVDNAYMDD变异的检测,并对所检出的99例HBVDNAYMDD变异患者情况作了初步分析,以期对临床治疗提供有利的帮助,现报道如下。1　资料与方法1.1　一般资料　201例血清样本均来自本院2007年8月至2008年3月收治的经拉米夫啶抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者。全部病例符合2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中的慢性乙型肝炎的诊断标准,服用拉米夫啶6～12个月27例,13～24个月127例,25～36个月30例,37个月以上17例。1.2　仪器与试剂　HBVDNA定量检测采用荧光实时聚合酶链反应(PCR)法,仪器为RocheLightcycler荧光PCR检测仪,试剂由广州中山医科大学达安基因检测股份有限责任公司提球菌A群链球为主。革兰阴性杆菌对亚胺培南、头孢吡肟、丁胺卡那霉素、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南表现出较低的耐药率;大肠埃希菌对亚胺培南的耐药率为零,但对氨苄青霉素、哌拉西林、氟喹诺酮类药物耐药率较高(大于70%),而且产ES2BLs大肠埃希菌的耐药率明显高于非产酶菌株,对产ESBLs大肠埃希菌亚胺培南是最后一道防线,应慎用。根据NCCLS文件,只要确认为产ESBLs菌,头孢菌素类、青霉素类、单环酞胺类抗菌药物,不论药敏试验显示敏感或耐药,都应视为耐药。由于阴沟肠杆菌常产ESBLs和AmpC酶,使肠杆菌的ESBLs的检测难以常规化,同时其多重耐药也给临床治疗带来很大的困难,碳青霉烯类常成为唯一的药物选择[2]。临床医生应该根据药敏结果科学、合理地选用抗菌药物,以减少治疗时间和费用,合理利用医药资源[3]。

临床经验用药已经不能适应现代抗感染治疗的需要,抗菌药物的长期不规范使用,使得耐药菌株不断出现,这给临床治疗带来很大的困难。临床医生应该重视痰液的细菌培养,根据药敏报告合理选用抗菌药物,同时做好耐药菌株的监测,尽量

供。HBVYMDD变异采用PCR结合Taqman荧光探针技术,分3管平行检测,其中C检测管检测样本中的总HBVDNA包括野生型和突变型DNA,Ⅰ管检测管检测样本中YIDD突变DNA,V管检测管检测样本中YVDD突变DNA。试剂盒由上海克隆生物高技术有限公司提供,仪器为DA7600荧光PCR检测仪。1.3　标本采集　用一次性注射器抽取患者静脉血4mL,不添加抗凝剂,分离血清,于-70℃保存。1.4　检测方法　血清标本、试剂盒内强Ⅰ/V阳性血清、临界Ⅰ阳性血清、临界V阳性血清、阴性血清各取50μL分别加入50μL核酸提取液A,振荡15s,13000r/min离心10min,去上清液。分别加入100μL核酸提取液B至沉淀中,振荡10s,100℃保温10min,13000r/min离心2min。处理后的样品应在1h内使用,或-20℃最长保存1个月(不宜反复冻融)。按试剂盒要求配置反应液并进行操作。选择50℃2min,94℃5min,再按94℃20s→53℃30s,循环40次进行PCR扩增反应。在53℃荧光通道,选择FAM进行荧光检测。1.5　结果判断　HBVYMD变异检测,基线调整取5～10个减少和预防耐药菌株的出现。根据彭少华等[4]报道,几乎所有

ESBLs阳性菌感染患者在该菌出现之前均使用过头孢菌素治

疗。因此,合理选用抗菌药物,对预防产ESBLs以及控制医院感染十分重要。参考文献

1234

佘丹阳,刘又宁.不同国家、地区细菌耐药性差别与抗感染治疗对策[J].中华医学杂志,2004,84(22):191621919.

陈晓玲.阴沟肠杆菌耐药机制的研究进展[J].中国抗感染化疗杂志,2005,5(5):3112312.

左淑兰,王莹.老年人下呼吸道常见病原菌的分布特点及耐药性分析[J].检验医学与临床,2007,4(10):8562957.彭少华,李从荣,蔡璇.产超广谱β2内酰胺酶肺炎克雷伯菌的随机扩增多态性DNA分型研究[J].中华医院感染学杂志,2002,12(7):4942496.

(收稿日期:2008210206)

检验医学与临床2008年12月第5卷第24期　LabMedClin,December2008,Vol.5,No.24・1507・

循环的荧光信号,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。C检测孔的Ct=40;判断待检样品为HBV阴性;C检测孔的Ct<36且Ⅰ检测孔的Ct=40且V检测孔的

Ct=40;判断待检样品为YMDD野生型;C检测孔的Ct值小

YMDD变异,拉米夫啶对HBVDNA的抑制作用明显下降,病

于36且Ⅰ检测孔的Ct<36且V检测孔的Ct=40;判断待检样品为YIDD突变;C检测孔的Ct值小于36且Ⅰ检测孔的Ct

=40且V检测孔的Ct值小于36;判断待检样品为YVDD突

毒就会重新出现复制。减少或避免出现耐药YMDD变异,也

显得日益重要。本研究中的201例患者,共产生YMDD变异株99例,应用拉米夫啶治疗6～12个月出现的变异率为18.5%(5/27),与治疗13～24个月出现的变异率为50.0%(63/126)、治疗25～36个月出现的变异率为60.0%(18/30)、治疗37个月以上出现的变异率为72.2%(13/17)的国内学者同期报道基本相符[122],变异集中发生在治疗13～24个月。治疗时间延长,YMDD变异率逐渐增加。由于HBVYMDD变异直接影响临床疗效及预后判定,因此对于应用拉米夫啶治疗的患者进行血清HBVYMDD变异监测有利于指导临床用药及治疗。

本研究中发现HBVDNA病毒载量在1.0×105～1.0×

106时YMDD变异53例,HBVDNA病毒载量在1.0×107～1.0×108时YMDD变异10例,占总变异株的63.6%(63/99),显示YMDD变异株HBV复制是处于中、高度水平,与有

变;C检测孔的Ct值小于36且Ⅰ检测孔的Ct<36且V检测

孔的Ct值小于36;判断待检样品为YIDD/YVDD共生突变。如果检测Ct值在38～40之间,重复检测1次,Ct值仍在38～

40之间则判为阳性,否则判为阴性。

1.6　统计学方法　应用SPSS11.5软件进行数据分析,样本

均数的比较采用t检验,率的比较采用χ2检验,P<0.05有统计学意义。2　结　　果

2.1　服用拉米夫啶治疗的201例患者血清样本中检测YM2DD变异株99例,占49.25%(99/201),野生株49例,占24.3%(49/201),53例未检出病毒株,占26.3%(53/201),发生YMDD变异株患者有60.3%ALT异常,ALT(102.5±95.2)U/L,YMDD野生株ALT异常者占18.7%,未检出病毒者ALT无异常改变,这表明YMDD与ALT异常有相关性。在变异株中,治疗不同时间的患者YMDD变异情况见表1。

表1　治疗不同时间的患者YMDD变异情况

治疗时间

6～12个月13～24个月25～36个月37个月以上

YMDD变异(n)

5631813

YMDD变异%

18.550.060.072.2

关报道变异后复制水平较低不同[3]。但这也许能解释临床治

疗过程中较高HBVDNA水平患者应用拉米夫啶治疗后DNA水平下降十分显著,但随后又反弹的现象。因此在应用拉米夫啶治疗过程中,还应参考患者血清HBVDNA水平来确定治疗方案。

本研究共产生YMDD变异株99例,其中以YVDD变异最多,其次为YIDD变异及YIDD/YVDD变异,与Gauthier等[4]报道相近,其中以YVDD变异最为常见。对比分析血清HBVDNA水平与变异类型的关系发现二者分布差异无统计学意义(P>0.05),表明血清HBVDNA定量水平与YMDD变异类型并不相关,与有关报道相符[526]。发生YMDD变异株患者有60.3%ALT异常,ALT(102.5±95.2)U/L,显示YM2

DD变异株的致病性轻重不等,ALT可为正常,也可是轻、高度

2.2　血清HBVDNA定量水平与YMDD变异类型的关系,

见表2。结果显示各组患者YMDD变异类均可见YVDD、

YIDD、YVDD/YIDD,但3种变异类型分布差异无统计学意义(P>0.05)。

等不同程度增高。因此,慢性乙型肝炎患者在应用抗病毒药物治疗过程中应严密观察HBVDNA含量和ALT水平变化,对指导临床用药治疗和监测具有重要的意义。参考文献

12

表2　血清HBVDNA定量水平与YMDD变异类型的关系(n)

病毒载量(copy/mL)

<1.0×10

3

姚光弼,王宝恩,崔振宇,等.拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎三

年疗效观察[J].中华内科杂志,2003,42(6):3832387.宋世会,齐俊英,杨道锋,等.乙型肝炎病毒基因型与YM2DD变异的关系[J].中西医结合肝病杂志,2005,15(4):1992201.

朱枚,姚光弼,钱又宏.慢性乙型肝炎患者出现YMDD变异后继续长期应用拉米夫啶的疗效[J].肝脏,2002,7(2):822

83.

GauthierJ,BourneEJ,LutzMW,etal.Quantitationofhep2atitisBviremiaandemergenceofYMDDvariantsinpa2tientswithchronichepatitisBtreatedwithlamivudine[J].JInfectDis,1999,180:175721762.

nYVDD42522556

YIDD03104

YVDD/YIDD

1330539

531531099

1.0×103～1.0×1041.0×105～1.0×1061.0×107～1.0×108

3

合计

4

3　讨　　论

拉米夫啶作为一种重要的抗HBV药物,近年来成为临床上最常用的药物,随着拉米夫啶的广泛应用,拉米夫啶导致的耐药问题日益突出。HBVYMDD变异是引起拉米夫啶耐药的主要机制。YMDD是酪氨酸2蛋氨酸2天冬氨酸2天冬氨酸这

4个氨基酸的缩写,该4个氨基酸位于HBVDNA聚合酶上,

65

武昌.慢性乙型肝炎YMDD变异基因的检测及分析[J].医

学检验与临床,2007,18(4):46247.

唐孝亮,符正远,李通忠.乙型肝炎病毒YMDD自然变异与病毒治疗后变异特点[J].检验医学与临床,2008,5(9):5202522.

(收稿日期:2008206226)

是拉米夫啶的主要作用位点。如果该位点发生突变,就称为YMDD变异。最常见的变异是M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)或Ⅰ(异亮氨酸)取代,分别称为YVDD或YIDD变异,一旦发生了