(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103743825 A(43)申请公布日 2014.04.23
(21)申请号 201210392294.8(22)申请日 2012.10.16
(71)申请人中国科学院天津工业生物技术研究
所
地址300308 天津市滨海新区天津空港经济
区西七道32号(72)发明人姜文侠 刘琦 周涛
(74)专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限
公司 11322
代理人龙淳 李巍(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)
权利要求书2页 说明书9页 附图3页权利要求书2页 说明书9页 附图3页
(54)发明名称
麦角硫因的检测方法(57)摘要
本发明涉及一种菌丝体中或发酵液中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括对菌丝体或发酵液的预处理步骤和高压液相色谱检测步骤。对菌丝体的预处理步骤包括将发酵液固液分离，收集菌丝体，再加入纯水溶解并进行浸提而得到浸提液，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的透过液。对发酵液的预处理步骤包括对发酵液直接进行浸提，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的透过液。本发明的方法先经过简单的预处理，再利用高压液相色谱进行检测，去除了发酵液和菌丝体中的大部分杂质，提高了色谱柱的使用寿命和样品的分离度，使检测结果更精确稳定，降低了检测的成本。CN 103743825 ACN 103743825 A
权 利 要 求 书
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1.一种菌丝体中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括以下步骤： 1）菌丝体的预处理步骤，包括将发酵液固液分离，收集菌丝体，再加入纯水悬浮并进行浸提而得到浸提液，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的超滤透过液；
2）高压液相色谱检测步骤，对含有麦角硫因待测样品的透过液进行高压液相色谱分析。
2.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，发酵液固液分离的方法选自离心、过滤和抽滤中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提方法包括水浴浸提和/或磁力搅拌浸提。
4.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提方法包括一次性浸提或反复浸提，浸提温度为50～100℃，浸提总时间为10～90min。
5.如权利要求4所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提温度为80～90℃。
6.如权利要求4所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提总时间为60～90min。
7.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，搅拌转数为0～600rpm。
8.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为1.5kDa～30kDa。
9.如权利要求8所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为3kDa。
10.一种发酵液中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括以下步骤： 1）发酵液的预处理步骤，包括对发酵液直接进行浸提，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的透过液；
2）高压液相色谱检测步骤，对含有麦角硫因样品的透过液进行高压液相色谱分析。 11.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提方法包括水浴浸提和/或磁力搅拌浸提。
12.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提温度为50～100℃，浸提时间为10～90min。
13.如权利要求12所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提温度为80～90℃。
14.如权利要求12所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提时间为60～90min。
15.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，搅拌转数为0～600rpm。
16.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为1.5kDa～30kDa。
17.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为3kDa。
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权 利 要 求 书
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18.如权利要求1～17中任一项所述的方法，其中在所述的高压液 相色谱检测步骤中，高压液相色谱检测的条件如下：色谱柱为反相碳十八柱，采取两根柱子串联的连接方式进行检测；流动相溶液成分以体积分数计为甲醇/乙腈-纯水=（0～10）∶（90～100）；流动相的pH范围为4.0～6.5；用于调节pH的酸或盐选自乙酸、乙酸钠、硼酸、甲酸、丁酸、乙二酸、和丙酮酸中的一种或多种；检测波长为250～260nm；柱温为15～40℃；流动相的流速为0.3～1.3mL/min；色谱图的记录时间为40min以下；麦角硫因的出峰时间为3～18min。
19.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，流动相溶液成分以体积分数计为甲醇/乙腈-纯水=（0～5）∶（95～100）。
20.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，流动相的pH范围为4.0～5.0。
21.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，用于调节pH的酸或盐为硼酸。
22.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，麦角硫因的出峰时间为5～8min。
23.如权利要求22所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，麦角硫因的出峰时间为7～8min。
24.如权利要求18所述的方法，还包括对麦角硫因进行定量的步骤，所述的定量步骤包括：
1）麦角硫因标准品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液； 2）对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液分别进行高压液相色谱检测； 3）根据麦角硫因标准品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准线；4）根据麦角硫因待测样品的高压液相色谱出峰时间和峰面积，比照标准品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因进行定量。
25.如权利要求24所述的方法，其中对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液进行高压液相色谱检测的条件，与权利要求18所述的方法中所使用的高压液相色谱检测的条件相同。
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说 明 书麦角硫因的检测方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及化学分析领域，特别是涉及发酵液和菌丝体中麦角硫因的检测方法。
背景技术
麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，
是一种稀有的天然手性氨基酸，它是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸(2-thio-imidazole)，化学结构式如下：
[0002] [0003]
麦角硫因是机体内重要的天然活性物质，具有很强的有抗氧化活性：清除活性氧化物和活性氮化物，激活抗氧化物酶，抑制超氧化物歧化酶（Aruoma OI,Whiteman M,England TG，Halliwell B.Antioxidantaction of ergothioneine assessment of its ability to scavenge peroxynitrite.BBRC,1997,231:389～391.），抑制各种血红素蛋白发生氧化反应等（Romaro R,et al.,The reactivity of thiols and disulfides with differentredox states to myoglobin[J].Biol.Chem.,1992,267:1680～1688.）。此外，麦角硫因还具有防止紫外辐射（Rougee M,et al.,Deactivation ofsinglet molecular oxygen by thiols and related compounds,possibleprotectors against skin photosensitivity[J].Photochem.Photobiol,1988,47:485～489.）、调节细胞内的氧化还原平衡、螯合二价金属离子、参与细胞内的能量调节（Hartman PE.,Ergothioneine as an antioxidant[J].Methods Enzymol,1990,186:310～318.）及细胞生理保护剂等多种功能。[0005] 与其它抗氧化剂和活性物质相比，麦角硫因具有以下优势：它是生物体内的天然产物，无毒，无异味；稳定性好，生理pH条件下不会自发氧化；极易溶于水，在水溶液中不易分解；对光、热不敏感；能同时清除自由基和活性氧化物；对O2-具有极高的亲和力。因此，麦角硫因在器官移植、细胞保存、医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域具有广泛的用途和市场前景。
[0004]
麦角硫因的制备方法有三种：化学合成法、提取法以及生物合成法。由于蕈菌子实
体中麦角硫因的含量较高，利用蕈菌液体深层发酵制备麦角硫因将成为其商业化绿色生产的主导方向。与化学合成法和提取法相比，利用食用蕈菌生物合成制备麦角硫因可以保证产品的安全性，避免原料杂质多，药物残留，提取成本高等问题。与固体发酵相比，液体深层发酵可通过优化菌丝体的发酵条件，提高和稳定麦角硫因的产率，工艺可控制，生产规范，技术经济性好，生产成本低。因此，蕈菌液体深层发酵能够为医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域提供安全性高、成本低的麦角硫因产品。[0007] 在菌丝体和发酵液中，能否实现麦角硫因快速准确的检测与分析对于研究和生
[0006]
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产都至关重要。目前较普遍的方法是利用高压液相色谱对麦角硫因进行定量测定：Huynh N.D.Bao等通过乙醇提取金针菇子实体中的麦角硫因，利用HPLC进行定量检测(Huynh N.D.Bao a,YoichiShinomiya b,Hiroaki Ikeda,et al．,Preventing discoloration and lipidoxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared frommushroom(Flammulinavelutipes)cultured medium[J].Aquaculture，2009,doi:10.1016/j.aquaculture.2009.06.042.)。Univ Nagoya等以HPLC对担子菌子实体和固体发酵菌丝体中的麦角硫因进行了测定(Univ Nagoya,Iwade Kingaku Kenkyusho Kk,Daicel Chem.Method for producingergothioneine[P].JP:JP2009161498A.)。周念波等采用HPLC测定了双孢菇子实体中麦角硫因的含量，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶（250mm×4.6mm，5μm）作为固定相，乙腈-水（3∶97，v/v)作为流动相，在254nm波长下测定麦角硫因（周念波，李轶群，殷勤红，氧化铝柱层析从双孢菇菇柄中提取麦角硫因[J]．安徽农业科学，2010，38(27):14842～14843.)。[0008] 利用蕈菌液体深层发酵制备麦角硫因，由于发酵产物复杂，采用目前报导的HPLC检测条件与方法，难以实现目的峰与杂质峰的有效分离；样品的前处理程序较多，影响麦角硫因的准确定量检测；使用的有机溶剂较多，成本高。因此，本领域迫切需要提供一种前处理简单，检测时间周期短，分离度良好，准确度高且成本更低的测定菌丝体和发酵液中的麦角硫因的HPLC检测方法。
发明内容
[0009] 针对现有的检测技术在麦角硫因的检测方法中存在的局限性，本发明提供了测定菌丝体和发酵液中麦角硫因含量的HPLC检测方法。该方法通过一次高效液相色谱检测，实现了目的峰与杂质峰的有效分离，可以快速、准确、灵敏地测定菌丝体和发酵液中麦角硫因的含量。
[0010] 因此，本发明提供一种菌丝体中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括以下步骤：
[0011] 1）菌丝体的预处理步骤，包括将发酵液固液分离，收集菌丝体，再加入纯水悬浮并进行浸提而得到浸提液，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因的超滤透过液；和[0012] 2）高压液相色谱检测步骤，对含有麦角硫因样品的透过液进行高压液相色谱分析。
[0013] 更具体地，菌丝体的预处理条件如下：发酵液固液分离的方法可以包括但不限于离心、过滤、抽滤；菌丝体悬液的浸提方法可以包括但不限于水浴浸提和磁力搅拌浸提；浸提可以为一次性浸提或反复浸提；浸提温度为50～100℃，优选80～90℃；浸提总时间为10～90min，优选60～90min；根据需要加入适量的水，例如，加入纯水的量使得最终得到的浸提液的总体积与发酵液的体积相同；搅拌转数为0～600rpm；超滤过程中用到的超滤膜截留分子量选择1.5kDa～30kDa，优选3kDa截留分子量的超滤膜。[0014] 高压液相色谱检测的条件如下：色谱柱为反相碳十八柱，采取两根柱子串联的连接方式进行检测；流动相以体积分数计为甲醇/乙腈-纯水=（0～10）∶（90～100），优选（0～5）∶（95～100），最优选1∶99；流动相的pH范围为4.0～6.5，优选4.0～5.0，最优选5.0；用于调节pH的酸或盐选自乙酸、乙酸钠、硼酸、甲酸、丁酸、乙二酸、和丙酮
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酸中的一种或多种，优选硼酸；检测波长为250～260nm，优选254nm；柱温为15～40℃，优选20～30℃，最优选25℃；流动相的流速为0.3～1.3mL/min，优选0.7～1.0mL/min，最优选0.7mL/min；色谱图的记录时间为40min以下，优选30min以下，更优选25min；麦角硫因的出峰时间为3～18min，优选5～8min，最优选7～8min。[0015] 另一方面，本发明还提供一种发酵液中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括以下步骤：[0016] 1）发酵液的预处理步骤，包括对发酵液直接进行浸提，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的超滤透过液；和[0017] 2）高压液相色谱检测步骤，对含有麦角硫因样品的透过液进行高压液相色谱分析。
[0018] 更具体地，发酵液的预处理条件如下：发酵液的浸提方法可以包括但不限于水浴浸提和磁力搅拌浸提；浸提温度为50～100℃，优选80～90℃；浸提时间为10～90min，优选60～90min；搅拌转数为0～600rpm；超滤过程中用到的超滤膜截留分子量选择1.5kDa～30kDa，优选3kDa截留分子量的超滤膜。[0019] 在本方法中，高压液相色谱检测的条件与以上所述的菌丝体中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法中使用的条件相同。[0020] 进一步地，本发明的高压液相色谱检测方法还包括对麦角硫因进行定量的步骤。[0021] 更具体地，所述的定量步骤包括：[0022] 1）麦角硫因标准品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液；
[0023] 2）对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液分别进行高压液相色谱检测；[0024] 3）根据麦角硫因标准品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准曲线；和[0025] 4）根据麦角硫因待测样品的高压液相色谱出峰时间和峰面积，比照标准品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因进行定量。[0026] 其中，麦角硫因标准品的预处理步骤包括，精密称取麦角硫因标准品10mg，于25mL容量瓶中用纯水配制成浓度为400mg/L的对照品贮备液；再精密吸取贮备液适量，以纯水制成不同浓度的溶液；经微孔滤膜过滤，即得含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液。上述微孔滤膜过滤步骤中选择孔径0.1～0.45μm的微孔滤膜，优选0.22μm孔径的微孔滤膜。
更进一步地，对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液进行高压液相色谱检测的条
件，可以与以上所述的菌丝体和发酵液中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法中使用的条件相同。
[0028] 本发明采用样品先经过预处理再利用高压液相色谱进行检测，去除了发酵液和菌丝体中的大部分杂质，提高了色谱柱的使用寿命和样品的分离度，使检测结果更精确稳定。[0029] 本发明的优势在于：待测样品的预处理过程简单；以水溶液替代有机溶剂作为浸提溶剂，不添加其他化学试剂，不仅浸提溶剂的成本最低，而且保证了提取过程中操作的安全性，将这种浸提方法用于麦角硫因的生产中，不仅能避免大量使用有机溶剂可能带来的危险，减低浸提溶剂的成本，而且还能避免有机溶剂浸提可能对麦角硫因产品的安全性造成的影响；采用本方法的HPLC检测条件，对于发酵体系复杂的菌丝体和发酵液，实现了麦
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角硫因与杂质的良好分离，提高了麦角硫因定量检测的准确性，还减少了流动相中昂贵的色谱纯有机溶剂的使用量。
附图说明
[0030] 图1是麦角硫因的HPLC标准曲线；
[0031] 图2是麦角硫因标准品溶液的HPLC图谱；
[0032] 图3是麦角硫因菌丝体样品溶液的HPLC图谱；[0033] 图4是麦角硫因发酵液样品溶液的HPLC图谱；[0034] 图5是发酵液样品中的麦角硫因的质谱图；
[0035] 图6是麦角硫因标准品和发酵液样品中的麦角硫因的核磁共振氢谱；[0036] 图7是待测样品中麦角硫因的含量随样品存放时间的变化曲线。
具体实施方式
[0037] 本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。相反，本发明不仅要包括这些实施方式，而且还要涵盖其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化。[0038] 以下实施例中，采用的高压液相色谱仪为Agilent 1260型；色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18，4.6×250mm，5μm，将两根色谱柱串联使用；进样体积为5μL。当然，也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪和反相碳十八色谱柱，以及其它进样体积（根据被检测样品中麦角硫因的浓度进行相应调整），都能达到本发明的目的。[0039] 实施例1
[0040] 菌丝体的预处理方法：发酵液先经过抽滤，收集菌丝体，再加入与发酵液相同体积的纯水悬浮，制成菌丝体悬液。菌丝体悬液经600rpm的磁力搅拌器进行一次性浸提，浸提温度为90℃，浸提时间为60min。浸提后超滤离心10min，超滤膜孔径为3kDa，离心条件为12840×g。透过液即为麦角硫因待测样品。[0041] 实施例2
[0042] 菌丝体的预处理方法：发酵液先经过抽滤，收集菌丝体，再加入与发酵液相同体积的纯水悬浮，制成菌丝体悬液。菌丝体悬液直接进行浸提，不搅拌，浸提温度为100℃，浸提时间为10min。浸提后超滤离心10min，超滤膜孔径为3kDa，离心条件为12840×g。透过液即为麦角硫因待测样品。[0043] 实施例3
[0044] 菌丝体的预处理方法：发酵液先经过抽滤，收集菌丝体，加入发酵液体积三分之一的纯水悬浮，制成菌丝体悬液。菌丝体悬液通过水浴浸提，浸提温度为50℃，浸提时间为30min，搅拌转数为500rpm。浸提后再经过抽滤实现固液分离，得到的菌丝体再次进行抽滤处理，方法同上，如此反复浸提处理三次，总计浸提时间为90min，将三次的浸提液混合均匀，得到与发酵液体积相同的混合浸提液。浸提混合后超滤离心10min，超滤膜孔径为3kDa，离心条件为12840×g。透过液即为麦角硫因待测样品。[0045] 实施例4
[0046] 发酵液的预处理方法：将发酵液静置于水浴中浸提，浸提温度为100℃，浸提时间
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为10min。浸提后超滤离心10min，超滤膜孔径为3kDa，离心条件为12840×g。透过液即为麦角硫因待测样品。[0047] 实施例5
[0048] 发酵液的预处理方法：将发酵液置于600rpm的磁力搅拌器上加热浸提，浸提温度为50℃，浸提时间为90min。浸提后超滤离心10min，超滤膜孔径为3kDa，离心条件为12840×g。透过液即为麦角硫因待测样品。[0049] 实施例6
[0050] 标准品溶液的制备：精密称取麦角硫因标准品10mg，于25mL容量瓶中加纯水配制成浓度为400mg/L的标准品贮备液。再精密吸取贮备液适量，加纯水制成浓度分别为40、80、120、160、200mg/L的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得对标准品溶液。[0051] 实施例7
[0052] 色谱检测波长的确定：取经实施例6制备的麦角硫因标准品溶液，在190～380nm范围内进行紫外全波长扫描。麦角硫因的最大吸收波长在254nm处，故选择254nm作为检测波长。
[0053] 实施例8
[0054] 麦角硫因的HPLC标准曲线的绘制及检测限、定量限的测定。
[0055] 将由实施例6制备得到的麦角硫因标准品溶液注入高压液相色谱仪，色谱条件：流动相为甲醇-纯水=5∶95，使用硼酸调节流动相的pH至5.0，检测波长为254nm，柱温为25℃；流速为0.7mL/min。记录色谱图，根据标准品的浓度与相应的峰面积绘制标准线，结果见附图1，其中浓度100μg/mL的麦角硫因标准品的HPLC图谱见附图2。[0056] 根据进样量和信噪比为3和10，测得该方法的最低检测限和定量限分别为10.4μg/L和34.7μg/L。
[0057] 不同的检测方法需要绘制相应的标准曲线，用于定量检测样品中麦角硫因的含量。
[0058] 实施例9
[0059] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为乙腈-纯水=1∶99；[0060] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0061] 实施例10
[0062] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=1∶99；[0063] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0064] 实施例11
[0065] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为乙腈-纯水=5∶95；[0066] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
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实施例12
[0068] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95；[0069] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0070] 实施例13
[0071] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为乙腈-纯水=10∶90；[0072] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0073] 实施例14
[0074] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=10∶90；[0075] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
在实施例9～14的方法中，流动相分别选择乙腈-纯水和甲醇-纯水时，麦角
硫因的出峰时间以及与杂质的分离度相差不大，考虑乙腈的毒性大且成本高，因此选择甲醇-纯水作为流动相。
[0077] 甲醇-纯水的比值越小，麦角硫因与杂质的分离效果越好，当甲醇-纯水=10∶90时，麦角硫因峰与杂质峰的分离度明显下降。[0078] 实施例15
[0079] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用乙酸-乙酸钠调节流动相的pH至4.0；[0080] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0081] 实施例16
[0082] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用乙酸-乙酸钠调节流动相的pH至5.0；[0083] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0084] 实施例17
[0085] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用乙酸∶乙酸钠调节流动相的pH至6.0；
[0086] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0076]
实施例18
[0088] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用乙酸-乙酸钠调节流动相的pH至6.5；
[0087]
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其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/
min。
在实施例15～18的方法中，流动相的pH在4.0～5.0之间可使麦角硫因与杂质
达到理想的分离效果，考虑麦角硫在偏中性溶液中更加稳定，流动相的pH最优选为5.0。[0091] 实施例19
[0090]
将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行
检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用乙酸调节流动相的pH至5.0；[0093] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0094] 实施例20
[0095] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用硼酸调节流动相的pH至5.0；[0096] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0097] 实施例21
[0098] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用甲酸调节流动相的pH至5.0；[0099] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0100] 实施例22
[0101] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用丁酸调节流动相的pH至5.0；[0102] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0103] 实施例23
[0104] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用乙二酸调节流动相的pH至5.0；[0105] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0092]
实施例24
[0107] 将上述实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用丙酮酸调节流动相的pH至5.0；[0108] 其他色谱条件：检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min。
[0109] 在实施例19～24的方法中，选用上述试剂调节流动相的pH，结果显示样品的分离效果相差不大，其中硼酸可使样品中麦角硫因与杂质的分离度和样品峰形均能达到理想的效果，因此优选采用硼酸调节流动相的pH。[0110] 实施例25
[0111] 将实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检
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测，流速分别为0.3、0.5、0.7、1.0和1.3mL/min；[0112] 其他色谱条件：流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用硼酸调节流动相的pH至5.0，检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL。[0113] 当流速从0.3mL/min变化到1.3mL/min时，对麦角硫因与杂质的分离效果影响不明显，综合考虑麦角硫因的保留时间和柱压的影响，将流速定为0.7mL/min。[0114] 实施例26
[0115] 将实施例1～5处理得到的麦角硫因待测样品溶液注入高压液相色谱仪进行检测，柱温分别为15、20、25、30、35和40℃；[0116] 其他色谱条件：流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用硼酸调节流动相的pH至5.0，检测波长为254nm，流速为0.7mL/min，进样体积为5μL。[0117] 当温度在15℃～40℃时，随着柱温的升高，样品中麦角硫因的出峰时间逐渐缩短，但与杂质峰的分离度没有明显变化。因此柱温定为25℃。[0118] 实施例27
[0119] 将由实施例1处理得到的麦角硫因菌丝体待测样品溶液注入高压液相色谱仪，色谱条件：流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用硼酸调节流动相的pH至5.0，检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min，记录色谱峰，参见图3。实施例28
[0121] 将由实施例4处理得到的麦角硫因发酵液待测样品溶液注入高压液相色谱仪，色谱条件：流动相成分的体积比为甲醇-纯水=5∶95，用硼酸调节流动相的pH至5.0，检测波长为254nm，柱温为25℃，进样体积为5μL，流速为0.7mL/min，记录色谱峰，参见图4。[0122] 由图3和图4看出，麦角硫因的出峰时间在7～8min之间，实现了麦角硫因与杂质的良好分离。本发明建立了快速、准确、灵敏地测定菌丝体和发酵液中麦角硫因含量的方法。
[0123] 实施例29
[0124] 对由实施例28得到的麦角硫因色谱峰进行质谱（MS）检测。质谱检测条件为：质谱仪：Agilent 6120；离子源：ESI，离子阱检测器；检测模式：正离子检测；喷雾电压：4.5kV；氮气流速：3L/min；毛细管温度：220℃；毛细管电压：10v；采用全离子扫描方式，扫描范围：50～450m/z。
[0125] 检测结果：根据与紫外光谱相同洗脱方法下提取与标准品溶液相同保留时间的分子离子峰，色谱峰的一级质谱显示的分子离子峰[M+H]+为230Da，[M+Na]+为252Da，参见图5。根据麦角硫因的分子量为229Da，确定了实施例28的高压液相色谱图中所确定的色谱峰即是麦角硫因。[0126] 实施例30
[0127] 对麦角硫因标准品和由实施例28得到的发酵液麦角硫因样品色谱峰进行核磁共振氢谱（1H-NMR）检测。NMR检测条件为：中心频率：600.13；增益值：1440；累加次数：64。[0128] 检测结果：麦角硫因标准品与发酵液中的麦角硫因样品的氢谱基本一致，参见图6，从而进一步确认实施例24的高压液相色谱图中所确定的色谱峰即是麦角硫因。
[0120]
实施例31
[0130] 对HPLC检测的精密度的考察：对由实施例4处理得到的1份发酵液待测样品溶液
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进行5次平行的高压液相色谱测定，HPLC检测条件同实施例28，检测结果的相对标准偏差RSD为1.31%，表明该检测方法的精密度良好。[0131] 实施例32
[0132] 对HPLC检测的重复性的考察：取1份麦角硫因发酵液，按照实施例4的方法平行制备5份待测样品溶液，考察方法的重复性，HPLC检测条件同实施例28，每份待测样品平行测定3次，检测结果的RSD为1.67%，表明该检测方法的重复性良好。[0133] 实施例33
[0134] 对待测样品的时间稳定性的考察：取实施例32中的1份待测样品溶液于室温下分别放置0、2、4、6、8、10、14和24h，考察待测样品的时间稳定性，HPLC检测条件同实施例28，每个时间点的样品平行测定3次，检测结果见图7，RSD为1.4%，说明麦角硫因待测样品在24h内稳定性良好，样品制备后24h内检测不会影响检测的准确性。[0135] 实施例34
[0136] 对检测的回收率的考察：取经实施例4处理的2份麦角硫因发酵液待测样品溶液，分别添加已知浓度的麦角硫因标准品溶液，测定麦角硫因在样品中的含量，HPLC检测条件同实施例28，每份样品平行进样5次，根据检测值计算出麦角硫因的回收率，检测结果见表1。由麦角硫因检测回收率的实验结果可看出，本方法可满足定量分析的要求。
[0137]
表1.麦角硫因回收率的测定结果
[0138]
[0139] *回收率=（检测值-样品溶液中EGT浓度）/EGT标准溶液浓度×100%。
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图1
图2
图3
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说 明 书 附 图
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图4
图5
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说 明 书 附 图
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图6
图7
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