革兰阴性杆菌产β-内酰胺酶及其耐药分子机制的研究

３０８——　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２０１３，Ｖｏｌ　１７，Ｎｏ．２　文章编号：１００７～４２８７（２０１３）０２—０３０８—０４　革兰阴性杆菌产』３一内酰胺酶及其耐药　分子机制的研究　冯体玉　，徐韫健孙，李　宁。，余琳　（１．梅州市人民医院检验科，广东梅州５１４０３ｌ；２．广州医学院第一附属医院检验科，广东广州５１０１２０）　摘要：目的　分析革兰阴性杆菌所产Ｇ一内酰胺酶的表型及基因分型，并研究其耐药分子机制。方法　用纸片扩　散初筛试验、扩散确证试验进行超广谱０一内酰胺酶（ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ＥＳＢＬｓ）表型检查，头孢西丁　三维试验进行ＡｍｐＣ￣ｌ一内酰胺酶的表型检查，纸片协同试验筛选产金属８一内酰胺酶（ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅ，ＭＢＬ）菌　株；用多重ＰＣＲ技术扩增Ｂ一内酰胺酶基因并进行ＤＮＡ测序；用ＰＣＲ技术扩增基因元件整合子、插入序列ＩＳＥｃｐｌＢ　和转座子ｔｎｐＵ；用ＭＩＣ药敏法分析革兰阴性杆菌的药物敏感性。结果　①革兰阴性杆菌８一内酰胺酶的表型总检出　率为２４．２８　（４２／１７３），主要由单产ＥＳＢＬｓ引起，占１３．２９　，　内酰胺酶的基因型总检出率为２４．８６　；②整合子检　出４９株占２８．３２　，ＩＳＥｃｐｌＢ插入序列检出２９株占１６．７６　，转座子ｔｎｐＵ检出２８株占１６．１８　，基因元件阳性的菌　株大多数　内酰胺酶表型为阳性；③ｐ一内酰胺酶阳性菌株对抗生素的耐药率显著高于阴性菌株。结论　革兰阴性杆　菌可携带多种０一内酰胺酶，基因元件广泛分布于革兰阴性杆菌中，可能在多重耐药机制中起重要作用。　关键词：Ｂ一内酰胺酶；整盒子；转座子；插入序列　中图分类号：Ｒ４４６．５　文献标识码：Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｐ－Ｌａｃｔａｍａｓｅ　ｉｎ　Ｇｒａｍ。ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ＦＥＮＧ　Ｔｉ—ｙｕ，ｘＵ　Ｙｕｎ—ｊｉａｎ，Ｌｉ　Ｎｉｎｇ，ｅｔ　ａ１．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｅｉｚｈｏｕ　Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｉｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　５１４０３１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔ？－ｌａｃｔａｍａｓｅ　ｉｎ　Ｇｒａｉｎ—　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｔ？－ｌａｃｔａｍａｓｅ（ＥＳＢＬｓ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇｒａｍ—ｎｅｇａ—　ｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ　ｂｙ　ｄｉｓｃ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｅｓｔ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ａｓｃｅｒｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｄｉｓｃ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔ；ＡｍｐＣ　ｂｅｔａ—　ｌａｃｔａｍａｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ　ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｔｅｓｔ：ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ（ＭＢＬ）ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｄｏｕｂｌｅ—ｄｉｓｃ　ｓｙｎ—　ｅｒｇｙ　ｔｅｓｔ．．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ￣－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎ　ＤＮＡ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗａｓ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅｄ．ＰＣＲ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔＯ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒｏｎ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＩＳＥｃｐｌＢ，ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｔｎｐＵ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔ　ｏｆ　ｇｒａｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＭＩＣ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ①Ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｇｒａｍ—　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｓｏｌａｔｅｓ，ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　２４．２８　（４２／１７３）ｓｔｒａｉｎｓ　ｐ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｃａｒ—　ｒｙｉｎｇ　ＥＳＢＩ　ｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１３．２９　．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　２４．８３　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｂ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ．②　Ｉｎｔｅｇｒｏｎ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　４９　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｇｒａｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ（２８．３２　），ＩＳＥｃｐｌ　Ｂ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　２９　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｇｒａｍ－ｎｅｇａ—　ｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ（１６．７６　），ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｔｎｐＵ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　２８　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ（１６．１８　．），ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｃａｒ—　ｒｙｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ａｌｍｏｓｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｎ　ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ　ｔｅｓｔ．③Ｔｈｅ　Ｇ—ｌａｃｔａｍａｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｈａｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｈａｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｏｎｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｇｒａｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｉ？－Ｉ　ａｃｔａｍａｓｅｓ．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｗｉｄｅｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒａｍ—。ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｉｌｌｉ　ａｎｄ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔ—－　ａｎｃｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇ—Ｌａｃｔａｍａｓｅ；ｉｎｔｅｇｒｏｎ；ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ；ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，２０１３，１７：０３０８）　青霉素和头孢菌素等Ｇ一内酰胺类抗菌药物在长　期使用中，细菌逐渐对其产生抗药性。　内酰胺酶　的产生是革兰阴性杆菌对该类抗菌药物耐药的主要　机制之一，临床上的８一内酰胺酶主要是ＥＳＢＬｓ、　ＡｍｐＣ酶和ＭＢＬ。目前，Ｇ一内酰胺酶的传播机制仍　不是很明确，质粒携带的　内酰胺酶耐药基因在质　基金项目：广州市医药卫生科技项目（编号：２０１ｌｏ２Ａ２１３１３７），广州　医学院青年基金项目（编号：２０１０Ａ０４）　＊通讯作者　粒间及质粒与染色体间转移可能是通过转座子或插　入序列为工具实现的Ｌ１］。本文对１７３株革兰阴性杆　中国实验诊断学２０１３年２月　第１７卷第２期　菌进行可疑产酶株筛选，鉴定其基因型，并对ｌ３一内酰　胺酶周围的“基因环境”进行了分析，进而对基因元　件整合子、转座子、插入序列与革兰阴性杆菌耐药的　关系进行探讨。　１材料与方法　１．１　菌株　２０１０年４月一２０１０年１２月，梅州市人　民医院和广州医学院第一附属医院检验科分离的　１７３株（无重复）革兰阴性杆菌，大肠埃希菌３８株，　肺炎克雷伯菌３２株，鲍曼不动杆菌３０株，铜绿假单　胞菌２７株，阴沟肠杆菌２０株，洋葱假单胞菌１Ｏ株，　弗劳地枸橼酸杆菌８株，摩根摩根菌８株。质控菌　株：大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２、肺炎克雷伯菌　ＡＴＣＣ７００６０３和铜绿假单胞菌ＡＴＣＣ２７８５３均购自　卫生部药品鉴定所。　１．２主要试剂与仪器　Ｋ—Ｂ法药敏纸片购自英国　ＯＸＩＤ公司，Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＬ２０００标志物均购自　日本ＴａＫａＲａ公司，ＶＩＴＥＫ一２　ＧＮＰ药敏卡和　ＶＩＴＥＫ一２全自动微生物鉴定仪购自法国生物梅里　埃公司，ＰＣＲ扩增仪购自美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司，超声　细胞粉碎仪购自宁波新芝公司，超高离心机购自美　国Ｂｅｃｋｍａｎ公司。　１．３　ＰＣＲ引物　均由上海英俊生物公司合成，根　据文献设计如表１。　’－　表１　ＰＣＲ引物序列表　基因名称ＤＮＡ序列（５’一３’）　片段长度　（ｂｐ）　３０９－－－——　１．４细菌药敏实验　药敏试验用Ｋ—Ｂ药敏试验和　ＶＩＴＥＫ一２　ＧＮＰ药敏卡进行，结果判定按照美国临　床实验室标准化委员会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＬＳＩ）２０１０制定的规则及标准　进行［引。　１．５　三维试验　将大肠埃希菌标准菌株　ＡＴＣＣ２５９２２按Ｋ—Ｂ法涂布在ＭＨ平板上。在平板　的中央贴一张头孢西丁纸片，从距离纸片５　ｍｍ处　用无菌刀片在平板的琼脂上向外切一裂隙。每一裂　隙中加入３Ｏ　ｌ的一种待测菌株的　一内酰胺酶粗提　物。３５℃培养２４　ｈ，观察裂隙的内测端（头孢西丁　纸片的抑菌环内）周围有无细菌生长。判断标准：裂　隙的内测端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的　抑菌环有缺失者为阳性。　１．６　ＥＳＢＬｓ表型检测　按２０１０年ＣＩ　ＳＩ推荐的纸　片扩散法ＥＳＢＬｓ实验指南进行，以肺炎克雷伯菌　ＡＴＣＣ７００６Ｏ３为质控菌株跟随试验。初筛法：０．５　麦氏浊度菌液均匀涂抹于ＭＨ平板，贴上纸片头孢　他啶、头孢曲松、头孢噻肟、氨曲南，于３５℃温箱中　放置ｌ８—２４　ｈ后观察结果。当受试菌对头孢他啶　（３０　ｇ／片）纸片的抑菌环直径≤２２　ｍｍ、氨曲南（３０　ｉｆｇ／片）纸片的抑菌环直径≤２７　ｍｍ、头孢噻肟（３０　ｆｇ／片）纸片的抑菌环直径≤２７　ｍｍ或头孢曲松（３０　ｆｇ／片）纸片的抑菌环直径≤２５　ｍｍ，只要有一种可　视为疑产ＥＳＢＬｓ菌株。　确证法：对初筛阳性菌株，采用头孢他啶（３０　ｆｇ／片）、头孢他啶／克拉维酸（３０　ｆｇ／１０　ｆｇ／片）、头　孢噻肟（３０　ｆｉｇ／片）、头孢噻肟／克拉维酸（３０　ｆｇ／１０　ｆｇ／片）检测，一对纸片间相距２　５　ｍｍ，于３５。Ｃ温箱　中放置１８—２４　ｈ后观察结果。任一组药物的抑菌环　直径相差≥５　ｍｍ，判定为ＥＳＢＩ　Ｓ阳性菌株。　１．７纸片协同试验检测金属酶０．５麦氏单位待　测菌菌液均匀涂布ＭＨ琼脂平板，中问贴１０　ｇ亚　胺培南和３Ｏ　ｇ头孢他啶纸片，距纸片１．５－２．５　ｃｍ　处贴一空白纸片，加２—３　ｆｌ　２一巯基乙醇原液。３５℃　培养过夜，如靠近２一巯基乙醇侧亚胺培南和头孢他　啶抑菌环有扩大者为产金属酶菌株。　１．８　ＰＣＲ扩增目的基因　用加热裂解法制备　ＤＮＡ模板。反应体系总体积２０　ｌ，其中正反引物　各１　ｌ，１０×ＰＣＲ缓冲液２　ｆｌ，ｄＮＴＰ及Ｔａｑ酶各１　ｆｌ，ＤＮＡ模板２　ｌ。反应条件为除退火温度不同　外，９５℃预变性３　ｍｉｎ，９５℃３０　Ｓ，５６℃３５ｓ，７２℃４５　ｓ。　３０个循环，７２℃延伸１０　ｒａｉｎ。扩增产物送上海英俊　生物公司测序，结果在ＧｅｎＢａｎｋ中经ＢＩ　ＡＳＴ分析　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｉ　ａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２０１３，Ｖｏｌ　１７，Ｎｏ．２　以确定其基因型别。　２．１　内酰胺酶表型检出率　革兰阴性杆菌８一内　１．９统计学处理　采用ＷＨＯＮＥＴ５．０软件进行　统计分析革兰阴性杆菌的耐药率。　２结果　酰胺酶的总检出率为２４．２８　（４２／１７３），主要由单　产ＥＳＢＬｓ引起，检出率为１３．２９　；其次为产ＥＳ—　ＢＬｓ＋ＡｍｐＣ引起，检出率为６．３６　，见表２。　表２　４２株革兰阴性杆菌株产　内酰胺酶表型检出率（％）　２．２　ｐ一内酰胺酶基因型检出率　革兰阴性杆菌８一　内酰胺酶基因的总检出率为２４．８６　（４３／１７３），　ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ—Ｍ—Ｇ１、ＰＳＥ、ＡＣＴ－ｌ、ＤＨＡ—ｌ、　表４基因元件在革兰阴性菌属中的分布（株１　ＣＭＹ及ＩＭＰ一１总阳性率在临床分离的革兰阴性杆　菌中分别为：２４．８６　、８．ｏ９　、１１．５６％、１．１６　、　２．８９　、５．２０　、４．６２　及０．５８　。大肠埃希菌、肺　炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠　杆菌、洋葱假单胞菌、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根　菌都携带５—７种Ｊ３一内酰胺酶基因，见表３。　表３　ｐ＿内酰胺酶在革兰阴性菌属中基因型的分布　表５　内酰胺酶阳性和阴性菌株对１５种抗菌药物　敏感率的比较　２．３　基因元件在革兰氏阴性菌属中的分布　整合　子、插入序列ＩＳＥｃｐｌＢ和转座子ｔｎｐＵ在１７３株革兰　氏阴性菌属中检出率分别为２８．３２　９／６，１６．７６　，　１６．１８　，在各菌属中的分布见表４，基因元件阳性的　菌株大多数ｐ一内酰胺酶表型为阳性。　２．４　ｐ一内酰胺酶阳性与阴性菌株药敏结果比较　从１７３株革兰阴性杆菌药敏结果中，４２株Ｊ３一内酰胺　酶阳性菌株对氨苄西林、头孢曲松、头孢唑啉均耐　药；对丁胺卡那霉素、亚胺培南敏感率最高，见表５。　４２株ｔ？－内酰胺酶阳性菌株对抗生素的耐药性显著高　于阴性菌株，Ｐ＜０．０５。　与Ｂ＿内酰胺酶（一）比较，＊Ｐ＜０．０５。　中国实验诊断学２０１３年２月　第１７卷第２期　３１１一　３讨论　启动子，对下游ｃＴＸ＿Ｍ型ＥＳＢＬｓ的高水平表达和传　临床上ＥＳＢＬｓ、ＡｍｐＣ酶最为常见，这与本研究　播起重要的调控作用。转座子是指能将自身插入基　表２中ｊ３一内酰胺酶表型和表３中Ｊ３一内酰胺酶基因分　因组中一个在序列上无关的新位点的ＤＮＡ序列，位　型结果相符。产Ｊ３一内酰胺酶多重耐药革兰阴性杆菌　于　内酰胺酶基因的两侧，很容易携带着抗生素抗性　基因的总检出率为２４．８６　，略低于表型试验２４．　基因从细菌染色体转移到质粒或噬菌体基因组上，使　２８　，其中有３株菌检出８一内酰胺酶基因，但表型为　细菌基因具有重组和重排的潜力。本研究的革兰阴　阴性；有２株菌的Ｂ一内酰胺酶表型为阳性，但实验所　性菌其ｔｎｐＵ基因阳性检出率为１６．１８　，较其它文献　检的基因都为阴性。可能是设计引物不能测出菌株　报道率低　］。可能是由于感染菌株及细菌的耐药特　携带的基因型，或者菌株虽携带基因但不表达　内酰　性各不相同有关。转座子ｔｎｐＵ基因在大肠埃希菌、　胺酶。研究结果显示，所分离出的革兰阴性杆菌中，　肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中均有　产　内酰胺酶最常见韵菌种是大肠埃希菌、肺炎克雷　检出，在非发酵菌中的检出率相对较高。基因元件整　伯菌、铜绿假单孢菌及鲍曼不动杆菌。其他革兰阴性　合子、插人序列和转座子基因元件广泛分布于革兰阴　杆菌如阴沟肠杆菌、洋葱假单胞菌、弗劳地枸橼酸杆　性杆菌中，其俘获及启动ｊ｝内酰胺酶表达的能力，可　菌、摩根摩根菌也检出　内酰胺酶，说明携带　内酰　能在多重耐药机制中起重要作用。　胺酶耐药的基因在不同种类的菌属中进行了广泛转　作者简介：冯体玉（１９７４一），女，主管技师，从事临床检验方面　移。本研究中的产　内酰胺酶的菌株对许多ｌ｝内酰　的研究。　胺类的抗菌药物以及其他抗菌药物呈多重耐药，给临　参考文献：　床抗感染构成严重威胁，其中对氨苄西林、头孢曲松、　［１］Ｍａｒｉｅ—Ｆ　Ｉ　，Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｐ，Ｄａｎｉｅｌ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　头孢唑啉均耐药，对丁胺卡那霉素、亚胺培南敏感率　ＩＳＥｃｐｌＢ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｌａｃｔａ—　ｍａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｂｌａＣＴＸ—Ｍ　ｏｆ　Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ａｓｃｏｒｂａｔａ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｌａｌ　Ａ—　最高，对抗生素的耐药性显著高于不产酶菌株。　ｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ［－Ｊ￣．２００６，５０（４）：１２８２．　近年来通过对　内酰胺酶周围的“基因环境”进　［２］Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｓｔａｎｄ—　行研究发现：质粒携带的　内酰胺酶耐药基因在质粒　ａｒｄｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｅｓｔｉｎｇ；ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ　ｉｎｆｏｒｍａ—　问及质粒与染色体间转移主要是通过转座子或插入　ｔｉｏｎａｌ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｍ１００￥２０．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１０．　序列为工具实现的。质粒通过接合作用、整合子通过　［３］张永标，张扣兴，唐英春，等．产质粒介导的ＡｍｐＣ酶和ＥＳＢＩ　Ｓ细　整合酶俘获耐药基因，通过共用的启动子进行表达的　菌的耐药性及Ｂ内酰胺酶基因型研究［Ｊ］．中华微生物学和免疫　研究已有大量的报道＿３“　。本研究中基因元件阳性的　学杂志，２００４，２４（７）：５７７．　菌株大多数　内酰胺酶表型为阳性，大量文献也报道　［４３李心晖，石垒，杨维青，等．三类整合酶基因（ｉｎｔＩ）的简并引物Ｉ：Ｘ２Ｒ方　基因元件可介导病原菌各种耐药基因ｌ５ｊ，获得基因元　法建立及应用［Ｊ］．中国微生物学和免疫学杂志，２００５，２５（２）：１５６．　件的病原菌可表现为多重耐药。这也是本研究中的　Ｅ５］糜祖煌，秦玲．多药耐药鲍氏不动杆菌５类抗菌药物耐药机制　研究ＥＪ］．中华医院感染学杂志，２００８，１８（７）：９０１．　产　内酰胺酶的菌株对抗生素的耐药性显著高于不　［６］Ｆｌｕｔｔ　ＡＧ，Ｓｅｈｍｉｔｚ　ＦＪ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎｔｅｇｒｏｎｓ　ａｎｄ　ｓｕｐｅｒ—ｉｎｔｅｇｒｏｎｓ　产酶菌株的另一个原因。整合子是可移动的基因元　［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ，２００４，１０（４）：２７２．　件，可携带多种内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶基因，　［７］Ｈｏ　ＰＬ，Ｓｈｅｋ　ＲＨ，Ｃｈｏｗ　ＫＨ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　在同种和不同种细菌中进行基因的水平转移，从而使　ｏｆ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ——ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｂｅｔａ—－ｌｉｆｃｔａｍａｓｅｓ　ａｍｏｎｇ　ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ　ｉｓｏ—ｒ　细菌的耐药性得以快速传播。本研究检测的是Ｉ类整　ｌａｔｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．ｉｎ　Ｈｏｎｇ　Ｋｏｎｇ，２０００—２００２　Ｆ．Ｊ］．Ｊ　Ａｎｔｉ　ｍｉｃｒｏｂ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００５，５５（３）：３２６—３３２．　合子，在大多数革兰阴性杆菌中均可检出，与文献报　［８］Ｍａｒｉｅ—Ｆ　Ｌ，Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｐ，ＤａｎｉｅＡ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　道的有所不同　］，这可能与研究的菌株数量和种属不　ＩＳＥｃｐｌ　Ｂ—。Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ——Ｉ．ａｃｔａ—－　同有关。插入序列ＩＳＥｃｐｌＢ长度１，６５５　ｂｐ，其转座酶　ｍａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｂｌａＣＴＸ—Ｍ　ｏｆ　Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ａｓｃｏｒｂａｔａ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｌａｌ　能够识别反向重复序列，并催化转座因子发生删除作　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００６，５０（４０）：１２８２．　用。文献报道【７　在ＣＴＸ－Ｍ基因的侧翼发现有插入　￣９３林　宁，孙海平．多药耐药大肠埃希菌整合子、转座子遗传标志研　究ＥＪ］．中华医院感染学杂志，２００８，１８（１Ｏ）：１３６１．　序列ＩＳＥｃｐｌＢ，参与耐药基因从染色体到质粒的播散。　［１Ｏ］朱健铭，王建敏，姜如金，等．鲍曼不动杆菌多重耐药及转座子　本研究对ＩＳＥｃｐｌＢ　ＰＣＲ产物进行测序，发现大部分　Ｔｎ１５４８携带频率的研究［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２００９，２５　ＩＳＥｅｐｌＢ的右端均连接一个反向重复序列，为转位酶　（１）：９５．　提供作用位点，下游均连接ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ基因，为　（收稿日期：２０１２—０３—２１ｌ　其水平转移提供作用识别位点；并提供一３５及一１０两个