基因 (gene)：携带有遗传信息的 DNA或 RNA序列，也称为遗传因子。基因是合成有功能的蛋白质或 RNA所必需的全部 DNA，包括编码蛋白质或 RNA的核酸序列，也包括为保证转录所必需的调控序列。基因的功能：传递遗传信息，控制个体性状表现。 结构基因 (structural genes)：可被转录形成 mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。调节基因 (regulatory genes) ：某些可调节控制结构基因表达的基因。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质(或酶)量的改变。 eg. miRNA, siRNA, piRNA 核糖体 RNA 基因 (ribosomal RNA genes) 与转运 RNA 基因 (transfer RNA genes)：只转录产生相应的RNA而不翻译成多肽链。 真核生物的RNA聚合酶 ( 3种)：RNA 聚合酶 I, II, III.
开放阅读框架 (open reading frame，ORF)：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码序列。断裂基(split gene)：真核生物
结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质。
基因组 (genome)：一个细胞内的全部遗传信息，包括染色体基因组和染色体外基因组。 基因组中的 DNA包括编码序列和非编码序列。 部分病毒基因组--RNA。
C值 (C-value)：一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。通常，进化程度越高的生物其基因组越大，但从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上所处地位的高低无关。存在 C-value paradox （C值悖理）。生物复杂性越高，其基因的密度越低。
病毒基因组的大小: 与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小。不同的病毒之间基因组大小相差很大。乙肝病毒DNA：3kb，编码4种蛋白质；痘病毒的基因组：300kb，编码几百种蛋白质。病毒基因组的大小通常与其对宿主的依赖程度有关，基因组越大，依赖性越小。 RNA 病毒基因组编码序列具有节段性 :有些病毒的基因组 RNA由不连续的几条核酸链组成（如流感病毒，轮状病毒等）。 分段基因组的病毒一般感染效率较低 ；分段基因组容易发生重组，故病毒容易变异 。 目前未发现DNA病毒有此状况。
病毒基因存在基因重叠 :基因重叠：同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。这种现象在其它的生物细胞中仅见于线粒体和质粒DNA。此结构意义在于使较小的基因组能够携带较多的遗传信息。 基因重叠的方式 :1）一个基因完全在另一个基因里面。2）几个基因部分重叠。3）两个基因之间只有一个碱基重叠。 重叠基因的DNA序列可能大部分相同，但由于翻译时的读码框架不同、或起始部位不同而产生不同的蛋白质。 有些真核病毒的部分序列，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因而言却是外显子。 病毒基因组的大部分序列具有编码功能：病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部份没有编码翻译功能。 ΦX174基因组中不编码的序列只占217/5375。乳头瘤病毒基因组约8.0Kb，其中不编码的部分约为1.0kb。 少数真核生物病毒的基因组也存在内含子结构。
病毒基因组的转录单元是多顺反子 :多顺反子 mRNA (polycistronie mRNA) ：病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或 rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。它们可被一起转录成含有多个 mRNA 的分子。
病毒基因组都是单倍体：除了逆转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。 逆转录病毒带有逆转录酶，能使RNA反向转录生成DNA，因此其基因组可拥有两个拷贝。 噬菌体基因具有连续性：噬菌体的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子。
原核生物基因组通常比较简单，其基因组大小在106bp～107bp之间，所包含的基因数目几百个到数千个之间。 原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个
种类 I II 核基质 mRNA, microRNA III 核基质 5S rRNA, tRNA, siRNA 分布 核仁 产物 rRNA 致密的区域，称为类核（nucleoid）.
大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 :大肠杆菌基因组序列中的基因密度非常高，编码区所占的比例较大。大肠杆菌中总共有4288个基因，平均编码长度为 950bp，基因之间的间隔区长度为 118bp，而且这些结构基因没有内含子。大肠杆菌DNA分子中的重复序列很少，但在大肠杆菌基因组中不同部位可以有称为 转座子 的50kb的重复片段。
转座因子：原核生物转座因子主要有二类：插入序列 (insertion sequence，IS) : IS：2000bp以内，两端都有正向重复序列（direct repeats，DR）和反向重复序列（inverted repeats，IR），中间1kb左右的编码序列，仅编码和转座有关的转座酶。 只有当 IS 转座到某一基因中使该基因失活或插入位点旁边的染色体发生畸变等效应时才会被发现。 复合型转座子 ( composite transposon, Tn) : Tn ：2000～20000bp之间，两端由一对 IS 元件组成，带有与转座作用有关的基因以及其他基因。 根据转座的的机制和结果，可将转座分为：复制型转座，保守型转座
大肠杆菌染色体外基因组的结构和功能：质粒（plasmid）：一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。 大肠杆菌质粒是双链环状结构的 DNA 分子。可以有共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）、缺口的环状 DNA、线性DNA 三种结构状态。质粒对宿主细胞的生存一般不是必需的，但质粒带有某些特殊的不同于宿主细胞的遗传信息，其存在赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。严紧控制（stringent control）型质粒：其复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝。松弛控制（relaxed control）型质粒：其复制与宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。
质粒的稳定性与不相容性: 质粒的不相容性（incompatibility）：两种不同质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失。 携带不同复制和维持机制的质粒属于不同的不相容群，它们可以共存于同一细胞中。 影响质粒稳定性的因素：1.主细胞分裂时质粒能否均衡地分配到子代细胞。2.质粒分子自身结构的稳定性。
真核生物的遗传物质绝大部分存在于细胞核染色体，少部分存在于线粒体或叶绿体中----细胞核基因组和细胞器基因组。 真核生物染色体基因组特点 : 人类基因组中仅含有25000～30000个基因，远低于预期。在人类基因组中只有很少一部份（约2-3％）DNA序列用以编码蛋白质和结构RNA。人类基因组中存在大量基因间隔区序列，主要由重复DNA构成。 在基因内部含大量内含子。
单拷贝序列：占 40%-80%，结构基因基本上属于单拷贝序列。中度重复序列：重复次数10～105，占 10-40%。如rRNA、tRNA、组蛋白以及免疫球蛋白的基因等，另有部分可能与基因的调控有关。高度重复序列：拷贝数大于106 ，占 10-60%。如反向重复序列 (inverted repeats) 和卫星DNA (satellite DNA)。 反向重复序列常见于基因的调控区，可能与复制、转录的调控有关。
重复序列的多态性：DNA多态性：DNA 序列发生变异从而导致的个体间核苷酸序列的差异。主要包括 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和 串联重复序列多态性（tandem repeats polymorphism）。 SNP--由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。 据估计，人类基因组中每1kp就存在一个SNP位点，共有约300万个之多，是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性。 相当一部分SNP还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。 大多数SNP位点十分稳定，人类85%的SNP是共有的。
高度重复序列中的无间隔反向重复序列很容易形成限制性内切酶识别位点，也很容易因为突变产生或是失去一个酶切位点，可以造成 限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism， RFLP).
真核基因组存在多基因家族与假基因 :多基因家族 (multi gene family)：由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。 假基因 (pseudo gene)：与某些有功能的基因结构相似，但不能表达有功能的基因产物的某些基因。 多基因家族大致可分为两类： 一个基因家族的不同成员成簇地分布在不同染色体上，但核酸序列高度同源，编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族。
基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质，如组蛋白基因家族就成簇地集
中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内，这种分布方式与DNA复制时需要大量的组蛋白有关。 假基因的产生有两种方式：由突变引起的基因序列变化而失去功能，这样产生的假基因带有内含子，称为常规假基因（conventional pseudogene）。mRNA经过反转录为cDNA，再插入基因组，由于插入位点不合适或序列发生变化而导致失去功能。这种类型的假基因不含内含子，称为已加工的假基因（processed pseudogenes）。
真核生物细胞器基因组：真核生物有两类细胞器能携带遗传物质：线粒体和叶绿体。这些遗传物质独立于细胞核基因组外，能够自行复制和表达，又称为染色体外基因组。 线粒体基因组编码其自身蛋白质合成体系的某些成员，如rRNA和tRNA等，以及呼吸链中的某些成员，如ATP酶、NADH还原酶、细胞色素氧化酶复合体中的某些组分。其它成员由细胞核基因组编码。
高等动物线粒体基因组具有独特的特点：①母系遗传。子代线粒体基因组来自母亲，父系的线粒体基因组在精卵结合时一般不能进入卵细胞。 ②线粒体DNA损伤后不易修复，突变率较高，可能与衰老及某些疾病有关。③遗传密码与通用遗传密码存在差别，如UGA（终止密码子）编码Trp，AGA/AGG（Arg）为终止密码子等。
基因组学（Genomics）：对生命有机体全基因组进行序列分析和功能研究的学科。 结构基因组学：目的是在生物体的整体水平上测定出全部蛋白质分子、蛋白质－蛋白质、蛋白质与其他生物分子复合体的三维结构。 基因定位克隆：利用微卫星和SNP全基因组扫描来搜索与疾病性状紧密相关的位点，从而确定疾病相关基因的位置并进一步获得克隆。 功能基因组学：根据已有基因的功能推测基因组中具有相似结构的基因的功能，通过实验手段验证。有效的方法有定点突变、基因敲除（knock-out）和RNA干扰及过量表达技术等。
第3章 蛋白质组学
蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者。几乎所有的生物催化剂--酶，都是蛋白质。构成细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；肌肉大部分也是由蛋白质组成。蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再折叠形成一定空间结构。
蛋白质组（proteome）：指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学（proteomics）：以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。 功能蛋白质组：细胞在某一阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。差异蛋白质组：不同种类或状态下各种样本之间蛋白质组的区别与变化。多样--蛋白质数目大大超过基因数目。可变--蛋白质随时间与空间变化。
基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程。样品制备：样品来源：细胞、组织、体液等。可采用全蛋白；或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜蛋白、核蛋白等）--提高低丰度蛋白质的上样量及检测灵敏度。尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分辨率。
样品分离：双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）：利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。2-DE 的缺点：难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极小蛋白质，及低丰度蛋白质。胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自动化联用。第一向：等电聚焦 IEF；第二向：SDS-PAGE。
染色方法：考马斯亮蓝染色；银染（不含戊二醛）；荧光染色（Cy3,Cy5），放射性同位素标记等。
新型非凝胶技术：液相色谱法（liquid chromatography, LC）对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白进行有效的分离鉴定。LC-MS/MS：液质联用技术。
微量测序（microsequencing）：N-末端Edman降解：经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上→N末端氨基酸残基经苯异硫氰酸酯修饰→从多肽链上切下修饰的残基→再经层析鉴定→余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。 缺点：过程缓慢，消耗大，试剂昂贵。
质谱分析（Mass spectrometry）：基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分子量。主要质谱类型：MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser
desorption/ionization time of flight mass spectrometry)利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。MALDI 最大的特点是离子电荷通常为1-2个，而不象ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图谱的解析比较清楚。 ；ESI MS: 电喷雾质谱（ electrospray ionisation mass spectrometry ）待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发，其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某一临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化。ESI特点：没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较少，是一种典型的“软电离”方式。可形成多电荷离子，因此在较小的m/z范围内可以检测到大分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质量100kDa以下的蛋白质，最高可达150kDa。由于采用液相方式进样，可与蛋白质化学中常用的液相色谱联用，即液相色谱-电喷雾质谱 (LC-ESI MS)。在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化从而降低了样品的利用率和灵敏度。
鉴定与注释蛋白质的路线：通过肽指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）和数据库搜寻匹配通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配
蛋白质数据库：目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST 数据库。NRDB 由SWISS-PROT 和GENPETP等几个数据库组成；dbEST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑，包括大量肽序列标签（PST）。SWISS-PROT(http://www.expasy.org)拥有目前世界上最大的蛋白质组学数据库。PMF或二级质谱匹配检索常用搜索引擎--MASCOT(http://www.matrixscience.com)
抗体芯片：可用于研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变。优点：微型化，集成化，高通量化。如肿瘤标志物抗体芯片等。常用荧光标记：Cy5和Cy3等。
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）：典型的真核转录因子都含有二个结构域: DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）。二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具完整活性。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 利用酵母双杂交技术筛选新的相互作用蛋白：1）DNA-BD + Bait protein；2）AD + cDNA文库的基因。将阳性反应的酵母菌株中的 AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析，研究与已知基因在生物学功能上的联系。
第4章 基因工程
基因工程（gene engineering）：又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。分子克隆（molecular cloning）:是指在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。 第一节 工具酶
一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。主要用途：1）在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段、切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。2）分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。3）用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构(palindrome)，切口 ：平端切口、粘端切口 二、DNA聚合酶
1、DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 DNA-polⅠ是单一肽链的多功能酶，分子量为103kd，它具有3种酶活性：1)5‘→3’聚合酶活性；2)3‘→5’核酸外切酶活性；3)5‘→3’核酸外切酶活性。 Klenow片段的主要功能有：1)补齐双链DNA的3’末端，同时可使3‘末端DNA标记同位素；2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；3)DNA序列分析。 2、Taq DNA聚合酶:一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5?→3? 聚合
酶活性和依赖于聚合作用的5?→3?外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。3、逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆转录作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。4、末端脱氧核糖核苷酰转移酶 分子量为60 kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3’末端-OH上。功能主要有：1)在载体或目的基因3‘末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。2)用于DNA3‘末端的同位素探针标记。1）底物是单链DNA或有3?突出末端的双链DNA，需要Mg2+。2）底物是平端或3?凹端的双链DNA，需要Co2+。
三、 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型，分子量分别为7500和6000，两者的辅基不同，前者需NAD+，后者需ATP。它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。
四、 碱性磷酸酶 催化去除DNA、RNA或dNTP上的5?-磷酸基团，其主要用途有：1)除去DNA片段上的5?磷酸，以防自身连接。2)在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5?端的磷酸。
五、 核酸酶S1 核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。其主要作用有：除去粘性末端以产生平末端；除去cDNA合成时形成的发夹结构；分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。
载体（vector）:指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。载体包括克隆载体和表达载体。常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。
载体大都经过改造，如质粒改造后携带某些选择性标记和克隆位点的遗传信息；λ噬菌体改造后只保留同一种限制酶的单个或两个切点。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即为表达载体，它不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞，而且可在宿主细胞中表达外源基因。载体应具备的特征：①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。②带有遗传筛选标记。③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。载体上具有多个限制酶的单一位点（即在载体其他部位无这些酶的相同位点）称为多克隆位点。 一、克隆载体 能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。
（一）质粒载体 质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。主要用途：①用于保存和扩增<2Kb目的DNA。②构建cDNA文库。③目的DNA的测序。④作为核酸杂交时的探针来源。
pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。在这两个抗性基因中分别含有BamHI和PstI等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。
pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体。pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。PUC质粒系列还包括pUC8、pUC9和pUC118、pUC119，它们的区别在于MCS的限制酶识别位点数目不同，而每一对pUC质粒的MCS中限制酶识别位点数目相同、顺序相反。pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段（lacZ’基因），该基因编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，IPTG可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补），形成完整的β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ‘基因中含有MCS，当外源基因插入MCS，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色（即半乳糖苷酶的蓝白斑筛选实验）。
（二）噬菌体载体 噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌的病毒。按其生活周期分为两种类型：溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中去，和细菌染色体一起复制。
λ噬菌体 野生型的λ噬菌体是线性双链DNA，全长48.5Kb，其中60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%的区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响λ噬菌体的生存。λ噬菌体5’末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为cos位点，λ噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的75%~105%之间。重组噬菌体筛选标记：外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选外源基因置换型：噬菌斑数目（red和gam基因，转染率高100~1000倍）。用途：①用作一般的克隆载体。②用于构建基因组或cDNA文库（<22Kb）。③用于抗体库或随机肽库的构建。④核酸的序列分析。
M13噬菌体 含一约6.4Kb的单链（正链）闭环DNA分子。M13噬菌体在细菌内呈溶源状态生长，成熟的子代噬菌体中只有一条含外源DNA的链（负链）。改造过的M13噬菌体引入了带有大肠杆菌LacZ的调控序列和N端部分氨基酸的编码信息以及多克隆位点序列，因此也可用蓝白斑筛选重组体。M13噬菌体载体主要用于目的DNA的测序和单链放射性探针的制备，克隆的外源DNA一般<1Kb。 M13噬菌体特点：①野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链DNA分子。克隆的外源基因片段<1kb。②M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，可用于感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。③M13中引入的多克隆位点，正好插入LacZ基因内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体。④M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞（呈溶源状态生长，故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链DNA）。
（三）粘性质粒(cosmid) 组成：①质粒复制的起始位点(ORI)。②携带抗药基因。③用于插入目的基因的单一酶切位点。④λ噬菌体的cos位点。特点：①粘粒（粘性质粒）载体大小为4～6Kb，而插入外源基因长达40～50kb。②加入λ噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于?噬菌体的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌。③粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。用途：①克隆大片段DNA；②构建基因组文库。 （四）酵母细胞中克隆基因常用载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色体DNA和大肠杆菌pBR322改造而成，可以插入长达1000Kb的外源DNA片断。根据其复制方式不同分为三型：整合型（YIP）、复制型（YRP）和附加体型（YEP）载体，YRP中插入酵母着丝粒区，构成酵母着丝粒质粒（YCP）载体。三类载体的共同特点:①能在大肠杆菌中复制，并具有较高的拷贝数；②含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记；③含有合适的限制酶切位点，以便插入外源基因。YIP和YCP载体能稳定遗传但都是单拷贝、转化率低，多用于遗传分析；而YRP和YEP载体对酵母具有很高的转化活性、拷贝数较高但稳定性差，后者较前者稳定，是基因克隆中常用的载体。 （五）动物细胞基因克隆的载体 已构建并经常使用的动物病毒克隆载体有：猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）载体；腺病毒（adenovirus）载体；逆转录病毒（retrovirus）载体。 二、表达载体 表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。
外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定克隆是否表达的方法来证实，即产生克隆基因所编码的蛋白质，其每个环节都至关重要。真核基因在原核细胞中表达需要有效转录及一系列调控元件，必须保证外源基因－插入方向的正确性；受原核启动子的控制；必须能在大肠杆菌中有效转录和有效翻译。基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。
为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采用报告基因（reporter gene）方法。报告基因（reporter gene）：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。
（一）原核细胞表达载体 原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号。
1.启动子（promoter）：如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及PL和PR启动子等。 2.SD序列 终止子（terminator）：一个基因的3‘末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。该序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有茎环状局部二级结构。1）非融合型表达载体pKK223-3。2）分泌型克隆表达载体PINlll系统。3）融合型表达载体pGEX系统 （二）哺乳动物细胞表达载体
真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子—克隆位点—终止位点和加polyA信号。1．原核DNA序列：包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记。2．启动子：转录起始位点上游25~30bp有富含AT的
TATA框，TATA框的上游约100~200bp处为上游启动子元件。3．增强子（enhancer）：是一类显著提高基因转录效率的顺式作用元件。4．终止子和加polyA信号。
三、穿梭载体 既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体称为穿梭载体（shuttle vector）。（一）穿梭粘粒载体：穿梭粘粒载体能携带真核DNA片段在细菌内扩增，并通过转染进入哺乳动物细胞进行转录和表达。这类载体常用于研究目的基因表达调控的组织细胞特性以及它所编码蛋白质的功能，也可从粘粒基因组文库中筛选出特殊功能基因。（二）酵母穿梭质粒载体：酵母复制型载体是穿梭质粒载体，它由酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构建而成，除有细菌质粒复制子和抗药性标记外，还有酵母DNA片段提供的选择标记，同时又携带了自主复制顺序，由于该载体同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，故能在两种细胞中存在和复制。另外，由噬菌体、质粒与SV40病毒DNA元件也可构建成穿梭载体，Pac10重组病毒-质粒载体也是穿梭载体。
分子克隆的基本步骤 一、 目的基因的获取
（一）从基因文库中获取 目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。基因组文库（genomic library，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体DNA提纯，通过机械或酶切使之成为一定大小的片段，将其与适当的载体相连接，经体外包装、转染细菌，得到一组含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。这个文库中含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组全部序列的信息库，故称为G-文库。转染（transfection）是指以噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。如以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库，则称为C-文库。
（二）逆转录法 是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。如胰岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总mRNA的50%~90%。用此法得到的目的基因进行克隆可获得较完整的连续编码顺序，易在宿主细胞中表达及筛选。
（三）人工合成DNA片段 根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。此法适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。
（四）直接从染色体DNA中分离目基因 根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为：（1）真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。（2）真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。
二、 载体的选择 λ噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库；构建cDNA文库和克隆较小DNA片段常用pUC系列等质粒；M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。 三、 目的基因和载体酶切与连接
四、重组DNA导入受体细胞 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competent cell)。以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程称为转化（transformation）。 五、重组体的筛选和鉴定
（一）遗传标记表型特征筛选 1.抗生素抗性标记筛选 因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。某些质粒载体如pBR322质粒中装有Ampr和Tetr抗性基因，在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。2.β-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选）3.营养标记选择: 当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为营养缺陷型，如导入细胞的重组DNA能弥补缺陷的基因，那么，培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。 （二）重组子结构特征的筛选
1．重组子大小鉴别筛选:从挑选的菌落中分别提取重组载体DNA和原载体DNA，用一种限制酶切消化后直接进行电泳，重组载体DNA因分子量较大而迁移率较小。2．酶切鉴定:根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，可根据DNA mark来分析插入DNA片段的分子量。3．PCR筛选法。4．核酸杂交技术筛选：将DNA的克隆片段或转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用特异性的核酸探针对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。另外，还可通过斑点杂交和Southern blot杂交技术筛选 。
在分子生物学领域，利用基因工程技术，大肠杆菌体内的基因50%以上已被定位，其DNA序列已被测出，基因表达调控关系也基本搞清。在真核生物中，利用基因工程的理论和技术已发现上百种癌基因和209余种抗癌基因，它们分别是细胞增殖调控的正负信号。在发育生物学中精细胞的分化及受精过程所发生的变化，基因表达的发育调控的研究与基因工程技术的应用是密不可分的
基因工程的理论和技术对人类基因组计划的实现具有重大作用，将对人类基因组作图和测序，对于了解人类的全部基因构成，提供可资查的一个完美的基因信息库，也为认识人类遗传疾病和癌发病机理提供有价值的信息。 动植物基因工程 1.转基因动物与蛋白制药的生产 转基因动物可以用来代替发酵罐生产一些珍贵的蛋白质。它的原理是使外来基因在动物乳腺中表达，从乳液中提取所要的蛋白质。英国的药用蛋白公司用这种方法将转基因绵羊来试行生产人类抗胰蛋白酶因子，在每升羊奶中可取得35克这种蛋白质。 2.转基因动物与动物改良。 3.转基因动物与人类疾病治疗 。 4.转基因动物与基础生物学研究。5.转基因植物
微生物基因工程和发酵工业 我国已有人干扰素、人白介素2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用。世界上还有几百种基因工程药物及其它基因工程产品在研制中，成为当今农业和医药业发展的重要方向，将对医学和工农业发展作出新贡献。
第5章 基因诊断
基因在医学中的应用 1、基因诊断目前应用最多的是：症状前诊断（疾病易感性）。产前诊断（羊水、脐带血、绒毛膜）遗传性疾病。着床（植入）前诊断。临床诊断（国外已用于乳腺癌、结肠癌等）。意义：优生优育；确定与疾病有关状态（如易感性、抗药性、发病类型及阶段）；传染病早期（产生抗体前）诊断及病毒携带者的检出；分析基因型，使器官移植配型精确；法医DNA鉴定。
胚胎移植前遗传病诊断 preimplantationgenetic diagnosis, PGD 是在体外受精（in-vitro fertilization, IVF）技术、分子生物学和显微操作的基础上，对受精三天后的胚胎在种植前，检查其正常后再移植到子宫的一项新技术，也即所谓第三代试管婴儿技术。一般在卵裂期，当胚胎发育到6-8个细胞阶段，抽取1-2个细胞，进行遗传疾病诊断。根据遗传诊断结果，仅将正常胚胎移植至子宫。
基因和环境共同决定生物的性状。基因是内因；环境是外因。环境（外因)的干扰必须通过基因(内因)的作用来影响生物的性状(如人的健康状况)
疾病与遗传基因及环境之间的关系 任何疾病（外伤除外）都是遗传与环境两者相互作用所致。只是在不同的疾病中，两者所起的作用不同。遗传性疾病都与基因有关。心血管疾病、糖尿病、肿瘤都与多个基因缺陷有关。传染性疾病主要是外部环境作用所致，如肝炎。虽然没有肝炎病毒的感染不会得病，但是同样得感染，不同的人表现不一样而且感染得了肝炎，治疗后的结果也大不相同。这些差别中的遗传因素不容忽视。因而，不能说传染病与遗传无关。
基因病分类 单基因病：孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆性X综合征等。多基因病或多因子复杂性状疾病：肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等。获得性基因病：感染性病原体，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等。
分子（基因）诊断的发展经历了三个阶段：以DNA分子杂交技术为基础的诊断方法–开展遗传病的基因诊断；以PCR技术为基础的诊断方法–开展获得性基因病（病原微生物）的基因诊断；以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型技术的诊断方法–开展多基因多因素疾病的基因（分子）诊断。从传统的DNA诊断发展到核酸及
其表达产物（mRNA、蛋白质）的全面诊断与过程诊断。生物芯片（biochip）技术，将大量基因探针／基因片段／蛋白／多肽按特定的排列方式固定在玻片（硅片、塑料片）上，实现了高通量筛查。系统生物学（systems biology），推动分子诊断的快速发展–以系统论的观点、动态的观点、多样性的观点和进化的观点来分析结果–重点，不是在个别核酸或蛋白质分子的序列及其功能。
乳腺癌和卵巢癌是具有家族遗传倾向的，约15-20%有家族史。与乳腺癌与卵巢癌遗传密切相关是BRCA1和BRCA2基因。BRCA1和BRCA2基因的功能是控制细胞增生，当它们中任一基因发生突变将大大增加个体患乳腺癌和卵巢癌的机率，并导致个体的发病年龄明显提前。
分子诊断的临床意义：不仅能够对疾病作出早期诊断、确切诊断；而且还能确定个体归于疾病的易感性以及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。 感染性疾病的分子诊断： 获得性基因病的分子诊断：流感病毒与各种流感；乙肝病毒DNA的检测；乙肝病毒YMDD突变检测；AIDS患者HIV的检测；SARS与SARS冠状病毒
流感病毒属于有包膜的单链RNA病毒，易于变异。甲型和乙型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成。丙型流感病毒的基因则由7个RNA片段组成，每个RNA片段编码1~2个多肽。
病毒变异及机制：点突变（antigen drift，抗原性漂移）RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校正机制，其核酸复制的错误频率高达万分之一。基因交换（genetic shift，抗原性转换）病毒基因组由8个负向RNA基因片段组成，复制过程中易发生基因重配。
1.分子诊断方法 可采用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒RNA所用引物常按流感病毒保守的非结构基因NS基因序列设计。2.临床意义 （1）流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较费时，灵敏度低，且难以作出早期诊断（2）PCR法敏感、特异、简便、快速，适合于流感病毒的临床检测、分型和流行病学调查。
HBV DNA检测的临床意义 1.诊断方面：1）HBV_DNA是HBV存在最直接的依据；2）是HBV复制的标志；3）是患者具有传染性的标志。2.疗效判断：HBV_DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标。3）预后判断：HBV_DNA水平与病情有一定的关系。
乙肝病毒YMDD突变检测 拉米夫定(Lamivudine)：硫代脱氧胞嘧啶（2'-deoxy-3'-thiacytidine，3TC）；核苷类似物；口服抗病毒药物。作用：降低HBV－DNA的浓度；改善肝脏组织的病变；可能阻断肝纤维化的进程，终止肝硬化的发展。不受人种、病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响；口服，副作用小。
YMDD突变检测常见方法 1.基因测序法(最好的)2.荧光定量PCR方法。 荧光定量PCR检测YMDD 基本原理：确定探针特定的TM值来区分是否突变。常用方法：覆盖突变位点荧光双探针杂交的方法检测YMDD。TM值：在核酸加热变性过程中，当双链DNA解链到一半时所对应的温度就是该核酸的TM值，也叫核酸的熔点。每种不同的核酸有不同的TM值。影响TM值的主要因素：1.碱基中GC含量，含量越高，TM越大。2.核酸的长度，核酸越长，TM越大。3.完全配对比不完全配对时TM值要大。
HBV在体内的复制过程是一个逆转录过程。抗病毒机制；竞争性阻断逆转录酶（依赖RNA的DNA多聚酶）活性，有效地抑制HBV的复制；进入细胞的拉米夫定在激酶的作用下可被磷酸化为三磷酸脱氧胞苷，可以与dCTP竞争性掺入延伸的DNA，因它缺乏3'羟基而使复制的病毒DNA链终止。
HIV基因组结构 基因结构组为RNA双分子，与其他逆转录病毒基本相同。5‘端有帽子结构，3’端有poly(A)结构。逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序（long terminal repeats，LTRs）等。LTRs不编码任何蛋白，可起始其他病毒基因的表达，无种属特异性，LTR含调控病毒基因表达的DNA序列，分别位于HIV基因组的两端。参与基因表达的调节基因。调控病毒的感染性，成熟或释放的基因。
HIV分子诊断1.分子诊断方法（1）PCR：尽管HIV是RNA病毒，但其感染细胞后会自我反转录成cDNA，并整合到宿主细胞基因组中复制，故可用感染细胞的DNA为模板进行PCR扩增，从而进行诊断。PCR扩增时需选择病毒基因组中的高度保守序列作为引物，如gag、LTR、tat、env和pol区段中的保守区。PCR法：特别适用于无症状HIV感染者。（2）病毒载量检测：对感染者体内HIV RNA的定量测定。技术：RT-PCR、FQ-PCR。RT-PCR最低检测限：50拷贝/ml。
冠状病毒，是由单一的RNA构成，这种RNA和N蛋白共同组成病毒。特点：RNA和RNA之间重组率非常高，出
现变异正是由于这种很高的重组率。重组后，RNA的序列发生了变化；蛋白的氨基酸序列，蛋白也都产生变化。 SARS冠状病毒，外层糖蛋白呈长柄图钉状。最大的RNA病毒：120~140nm，最大的单链RNA，易重组，易突变。SARS-CoV是一种单链正义RNA病毒，由美国CDC完成测序的Urbani株全基因组长29,727kb，平均G+C含量占41%，有11个ORFs，SARS-CoV的核苷酸序列中只有24个部位存在差异。SARS-CoV基因组结构是典型的缺乏HE蛋白的冠状病毒基因组结构。Rep、S、M、E、N蛋白是SARS-CoV基因组编码的对感染起重要作用的五种蛋白质。 冠状病毒复制过程：特点，首先将直接以病毒基因组RNA为模板翻译出病毒RNA聚合酶。RNA聚合酶没有矫正机制，变异较大。SARS-CoV基因组结构与其他冠状病毒的结构相似，但SARS-CoV病毒种系进化分析和序列比较分析显示，该病毒与任何以往已确定特征的冠状病毒关系不密切。SARS-CoV与其他人类冠状病毒不同的另一方面是，只能从Vero细胞中分离出SARS-CoV。检测方法主要有三类：1.分子生物学检测，2.免疫学检测(抗体检测)，3.细胞分离培养
分子诊断方法（1）PCR：可采用RT-PCR、FQ-PCR检测标本中的SARS-CoVRNA。PCR可以测定包括血液、粪便、呼吸道分泌物和其他体液等各种标本的SARS病毒的RNA。引物序列可从WHO实验室网站上获取。现有的PCR试验特异度很高，但在质量控制差的实验室，样品污染可出现假阳性。在良好的质量控制下，PCR阳性表明样品含有SARS病毒RNA，但不表示有活的病毒。阴性结果见于下列情况：1）病人未感染SARS病毒2）试验的灵敏度不高，出现假阴性3）各种标本出现SARS病毒或其RNA的时间不同，有的很短，标本采集的时间不适当，没有病毒RNA。因此阴性不能排除SARS的诊断。
（2）免疫学检测：存在感染的窗口期，难以对病毒感染进行早期诊断。在感
染过程中不同类型的抗体（IgM,IgG）的出现时间和水平不同。早期SARS病毒抗体常测不出来，IgG在感染痊愈后持续存在抗体阳性表示既往感染萨斯病毒。急性期阴性，恢复期抗体阳转，或恢复期抗体滴度4倍升高，表示新近感染。发病21天后阴性表示非SARS病毒感染。
（3）细胞培养：用SARS病人呼吸道分泌物和血标本接种Vero
细胞进行验证，所需时间较长，分离阳性率不高。SARS病人的呼吸道分泌物、血清或粪便标本可用细胞培养分离病毒。细胞培养虽然费时费力，但能证明活的病毒存在。细胞培养阴性不能排除SARS病。
第6章 基因治疗
一、基因治疗（ Gene therapy ） 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 基因治疗的必备条件：1.分子缺陷清楚2.可以得到相应基因的克隆3.病理生理机制已知4.有利的风险-利益比5.治疗基因可以被调控6.合适的靶细胞7.有效安全8.相关法规健全 二、基因治疗的总体策略
针对致病基因而言：（1）基因矫正（gene correction）对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；（2）基因置换（gene replacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；（3）基因增补（gene augmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除；（4）基因表达调节（modulation）指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。
针对非致病基因而言：（1）自杀基因：这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。（2）免疫基因治疗：将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（3）耐药基因治疗：在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。（4）其他
第二节 基因治疗的基本程序
1.目的基因的选择和获取2.目的基因与转运载体结合3.靶细胞的确认4.载体携带外源基因进入细胞5.外源基因
的整合6.外源基因的表达及检测7.治疗作用及稳定性、安全性评价 一、目的基因
在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如对单基因缺陷遗传病，
可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。
二、转运载体 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体、疱疹病毒载体等。非病毒载体：裸露DNA、脂质体、分子耦联载体、染色体载体、多聚物、纳米载体等。与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。
逆转录病毒载体 1、逆转录病毒载体的结构 逆转录病毒载体的特点：1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；3）感染靶细胞后不扩散；4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；5）不感染非增殖细胞。缺点：①容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段；②血清补体能使之失活；③病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；⑤宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性
慢病毒(HIV)载体Lentivirus：优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体免疫系统的监视，从而防止免疫排斥。缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞的毒性和产生变种病毒。
腺病毒载体特点：1）宿主范围广2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件3）可获得高病毒效价4）重组体非常稳定5）不会引起肿瘤6）有较高的安全性7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用8）不整合入染色体
单纯疱疹病毒载体 特点：1)滴度高2)容量大3)增殖细胞和非增殖细胞均可感染4)不整合，但可长期存在并可稳定表达
痘苗病毒载体:线形双链DNA的有包膜病毒，其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主范围广泛且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。同时痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力，可允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系统灭活并降解
脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障
分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。缺点：DNA易被降解，降低了基因转移效率；靶向性不高.
多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。聚合物聚乙烯亚氨(PEI)：PEI分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一种新型多聚物基因载体
裸露质粒DNA,将裸露质粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量成正比，与溶液体积无关。
染色体载体:一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的DNA片段，可以在染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。
1.细胞转导肽介导基因导入系统 蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽-细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将目的基因带入靶细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。 2. 纳米微生物技术基因治疗载体 纳米微生物具有许多优点：1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基
因导入靶细胞；2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。
三、靶细胞的选择
选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；
2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；3）易于受外源遗传物质的转化；4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。
干细胞:一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞。骨髓干细胞：1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；4）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析；5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术。
骨髓间质干细胞：骨髓中的非造血干细胞，能分化成多种中胚层来源的间质细胞（骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等）。MSC在体内可定向成骨、成软骨或成肌腱分化，可能是不同组织的微环境含有不同因子，促进MSC向不同谱系分化。MSC体外易于分离和培养，回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活，因而可作为理想的靶细胞用于基因治疗（直接移植MSC可治疗骨和软骨的疾病）
成纤维细胞：成纤维细胞是一种容易获得和在体外培养并进行遗传修饰的细胞。经修饰的细胞又容易移植回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使其介导的基因治疗终止。已有多种细胞因子基因被转移到小鼠皮肤成纤维细胞，然后再移植回小鼠。这些细胞再体内持续分泌细胞因子，使小鼠对肿瘤的免疫功能明显增强。遗传修饰后的成纤维细胞也可移植入脑内，以治疗神经系统疾病国内薛京伦等以逆转录病毒为载体，将人凝血因子IXcDNA在体外转移到两例血友病患者的皮肤成纤维细胞中，用胶原基质包埋后再自体移植回体内，结果IX因子在体内持续高水平表达2年以上，使两患者的出血症状得到不同程度减轻。
肌细胞 骨骼肌优点：最常用的注射途径，对外源药物耐受力强；面广量大又位于体表易于操作，是表达外源基因的良好场所。
外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL）主要优点：1.易于从体内取出和回输。应用IL-2尚可使PBL在体外进行培养并扩增，从而获得足够数量以适应体外操作。2.PBL对目前常用的RV,AAV等都有一定敏感度，可被有效导入外源基因，并可耐受筛选。3.筛选出转导成功的细胞回输体内可继续存活，应用IL-2可使之继续生长且有功能。世界上首例遗传病的基因治疗：ADA缺乏症（SCID）
六、外源基因的表达及检测 作用研究。
第三节、基因治疗的现状 进行基因治疗必须具备下列条件：1)选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；2)纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；3)该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；4)具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。
反义技术 是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的。
第四节、基因治疗的靶向性
靶向性基因载体的作用原理：靶向性是指在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或
1）DNA印迹技术 (Southern blotting)用于外源基因的整合分析。2）RNA印迹技术
(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析。3）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互
器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。靶向性载体在这里不仅仅起一个靶向作用，还要通过各自的不同作用力和DNA分子链结合形成一个相对紧密的复合物粒子，使其更容易穿过细胞膜并且免受核酸酶的降解。 一、靶向性基因载体的作用原理 三个步骤：1.靶向性载体和目的基因以适当比例混合，通过静电荷力、分子间作用力等结合力结合在一起，使链状的DNA分子折叠，形成粒状的复合物。2.复合物在靶向性基团的引导下接近靶细胞，通过细胞的内吞或者吞噬作用进入细胞内部，在细胞内紧密的复合物可以保护DNA避免核酸酶的降解。3.靶向性载体和目的基因脱离，目的基因通过核膜孔或者是在细胞分裂过程中进入细胞核，修补缺失基因或者关闭异常基因，而靶向性载体则分解成小分子化合物通过细胞的新陈代谢排出细胞。 二、靶向性基因载体的选择
理想的基因载体应具备以下特点：1)靶向特异性，并且可被免疫系统识别；2)高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；3)安全，无毒性，对人体以及环境无危害；4)有利于基因高效转移和长期表达。
靶向性基因载体的安全性：在携带目的基因进入靶细胞后，某些基因载体并不能马上分解，滞留在细胞内影响细胞正常的新陈代谢，甚至引起基因突变从而杀死正常细胞乃至对人体的生命安全产生危害。尤其是病毒载体，存在着较为明显的安全问题：病毒载体中可能产生有传染性、野型或辅助型病毒；可能随机整合于宿主基因组中，从而活化癌基因或抑制癌基因失活；病毒载体自身或编码的基因产物过度表达。
靶向性基因载体的有效性：首先是基因转移的有效性，通过靶向递送技术将目的基因尽可能多地导入靶细胞；其次是基因转录的有效性，通过使用组织特异性或疾病状态下过表达基因调控元件控制基因在靶细胞内转录；第三是基因表达时间和水平上的有效性，应用人工合成可调控表达系统来操纵基因表达，使其一方面在一定时区表达，另一方面表达水平不至于过高过低，尽可能地满足治疗需要。
第五节、基因治疗存在的问题
1.导入基因的稳定高效表达；选择合适的转移方法；选择适当的受体细胞。2.导入基因的安全性；一方面应构建相对安全的反转录病毒载体；另一方面，应寻找更安全的非病毒载体；体细胞基因治疗；3.基因治疗与社会伦理道德 。 一、导入基因的安全性 为安全起见，在临床试验之前，必须在动物研究中达到三项基本要求：1)外源的基因能导入靶细胞并维持足够长期有效；2)该基因要以足够的水平在细胞中表达；3)该基因应对细胞无害。
二、Gene治疗与社会伦理道德 体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发展，Gene治疗技术的成熟，将回答伦理道德方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被人们接受。
第六节、基因治疗产业的未来展望 用；6、需经动物实验验证安全可行。
一、基因治疗应满足的条件 1、单基因缺陷疾病；2、仅限体细胞的基因二、基因治疗有待解决的问题 1、难以获得真正有治疗作用的基因。2、
治疗；3、靶细胞易获取、培养、及回输体内；4、治疗效果应胜过对病人的危害；5、表达水平无需调控且无副作外源基因的表达难以在体内精确调控。3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。5、随机整合潜在的威胁
第7章 生物分子的分离和纯化
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。包括小分子（脂类，激素，维生素等），大分子（蛋白质，核酸，糖复合物等）。主要特征：1）结构复杂有序、具有特殊的层次；2）行使专一的功能；3）代谢是其存在的条件；4）生物分子体系具有自我复制的能力；5）能人工合成与改造。 一、生物大分子的制备
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备；2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响；3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度；4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。5）根据配体特异性，如亲和层析。 常用破碎方法：机械法（研磨法，匀浆法，捣碎法）；化学法（酶解法，去垢剂，有机溶剂）；物理法（反复冻融法，超声波法，低渗裂法，冷热交替法）。 影响提取效果的因素：1）pH值；2）盐浓度（即离子强度）；3）温度；4）水解酶；5）搅拌与氧化；6）有机溶剂 二、核酸的分离纯化
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 分离纯化的原则：一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了两者的最适分离与纯化条件的不同。 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 对于核酸的纯化应达到以下三点要求：1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度；3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
保持核酸的完整性：在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键)；2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键)；3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力。 核酸的浓缩、沉淀与洗涤：随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失，样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法，优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。
核酸的鉴定与保存 （一）核酸的鉴定 1.浓度鉴定：核酸浓度的测定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。⑴紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。⑵ 荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。⒉纯度鉴定：紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。⑴ 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。⑵ 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。⒊完整性鉴定⑴琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。⑵其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某种mRNA的Northern杂交等。 （二）核酸的保存 (1)对DNA① DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；在-70℃可保存数年② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2) 对RNA①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
真核基因组DNA的分离纯化
1、酚抽提法 以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。裂解液中：1）EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性；2）SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase；3）无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化；4）蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质；5）酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性；6）pH8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性
2、 甲酰胺解聚法 该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和有机溶剂。该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用于制备大片段DNA。
3、玻棒缠绕法 收集高分子量DNA的沉淀，本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE缓冲液中。该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb，适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA。
基因组DNA片段的纯化的原则与要求：纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则：一是提高片段的回收率，为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。为了得到一定的纯度，常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法，其采用的是阴离子交换层析的原理；二要清除回收的DNA样品中的污染。
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段：1）二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法；2)电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法）;3)冷冻挤压法;4)低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该方法能很好地回收小于1kb的ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。
质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括：1）碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。该法操作简单、重复性好且成本低，制备的质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求，是使用最广泛的方法2）煮沸裂解法，是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备。3）SDS裂解法，是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。 这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成。 质粒DNA的纯化：1、CsCl-EB法，利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。2、聚乙二醇沉淀法（一种分级沉淀法）。3、柱层析法（树脂）
真核细胞RNA的分离纯化： RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂（denaturant）后，RNase的活性又可恢复。因此，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。为获得完整的RNA分子，必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）。蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠，并联合使用RNase的特异抑制
剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。此外，在变性液中加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。
酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，分离总RNA：以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本 。 mRNA的分离纯化：与序列明确的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少，种类多且分子量大小不一。除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴。依据mRNA的结构特征，利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。磁性球珠分离法：该法联合利用了oligo（dT）与poly（A）的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的结合特异性以及磁性分离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏及快捷的分离。
三、蛋白质的分离与纯化
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能、新蛋白质的发现和疾病分子诊断的基础；分子克隆中，下游的处理和分析鉴定，基因工程产品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化。蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specific activity），以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。
分离纯化的总体原则：一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性；二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高，例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率均高，但实际工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能高，而牺牲一些回收率，在工业生产和分子诊断中则正相反。
蛋白质分离纯化条件：1.缓冲液；2.盐、金属离子和螯合剂；3.还原剂；4.去垢剂；5.增溶剂；6.蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor）；7.蛋白质的环境因素①表面效应的影响②温度的影响③储存。 蛋白质的分离纯化是依据其溶解性、分子质量大小及形状、电离性质和生物学功能的差异而进行的。分离纯化的方法可分类如下：①以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等；②以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等；③以电离性质差异为依据的方法：电泳、离子交换层析等；④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析。
盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。 有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。
电泳。蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。 每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，E·q值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。 1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：常用于蛋白质分子量的测定。2）等电聚焦电泳（IEF），通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。pH梯度以两性电解质ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外电场作用下自然形成。3）双向凝胶电泳。
蛋白质的纯度（purity）一般指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，一定条件
下的相对均一性。目前常用的鉴定纯度的方法有：有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、毛细管电泳（CE）、等电聚焦电泳（IFE）及高效液相色谱（HPLC）。此外，还有超速离心法、蛋白质的化学组成和结构分析法。 蛋白质的定量，通常是指测定溶液中的蛋白质浓度。测定蛋白质总量的方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前极少使用。应用较为广泛的方法是双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。测定蛋白质混合物中某一特定靶蛋白的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。活性的测定和总蛋白量的测定配合起来可以用来表示分离纯化过程中某一特定靶蛋白的纯化程度。纯化程度常用这一特定成分的含量（一般用活力单位）与总蛋白量（质量单位）之比来表示。
四、生物小分子的提取纯化
常用提取方法：1.溶剂提取法;2.水蒸气蒸馏法;3.升华法;4.超临界流体萃取法;5.超声提取法;6.固相萃取法。 分离精制的原理主要是根据：1）物质溶解度差别；2）物质在两相溶剂中的分配比不同；3)物质的吸附性差别；4）物质分子大小差异等进行分离。 常用纯化方法：1.逆流分配法（CCD）2.液滴逆流色谱法（DCCC）3.高速逆流色谱法（HSCCC）4.气液分配色谱（GC或GLC）5.液-液分配色谱6.凝胶过滤法7.超滤法8.硅胶吸附色谱9.氧化铝吸附色谱10.大孔吸附树脂吸附色谱,等
第8章 核酸分子杂交技术
主要用途：核酸定性或定量检测；基因克隆、突变及其表达研究；疾病的临床诊断
核酸杂交概述-核酸的结构 一级结构：核苷酸的排列循序 稳定键：磷酸二酯键；二级结构：双螺旋结构 稳定键：氢键、碱基堆积力、疏水键；高级结构：染色体
核酸变性（nucleic acid denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。 DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。加热；极端的pH；有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）。变性能导致DNA 的一些理化性质及生物学性质发生改变。溶液黏度降低：DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。溶液旋光性发生改变：变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。紫外吸收增加：DNA变性后，DNA溶液的紫外吸收增强；双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。
变性DNA的增色效应（ hyperchromic effect）：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。DNA分子在250－280nm波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。增色效应可以作为DNA变性的指标。不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20－30%之间。
解链曲线：通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度（A260）的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型。
融解温度（ melting temperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。特点：爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。Tm的影响因素：1．DNA分子大小和碱基的组成。2．溶液的离子强度。3．pH值。4．变性剂
（一）DNA分子大小和碱基的组成：不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两方面的性质所造成的。DNA的均一性；DNA的（G+C）含量。DNA的均一性：有二种含义。DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行。待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm
值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。DNA的（G+C）含量：在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C碱基对越多，Tm值越高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量。Tm与（G+C）含量的关系：Tm与DNA中（G+C）含量存在着密切相关性；Tm与（G+C）含量（X）百分数的这种关系可用以下经验公式表示:核苷酸≤20bp；Tm=4（G+C）+2（A+T）。（二）溶液的离子强度：溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽。（三）pH值：pH值影响氢键的形成。pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH值小于4时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性。（四）变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。
核酸复性（nucleic acid renaturation）：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。影响因素：1）温度和时间：一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能的。2）DNA浓度：DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。“成核”速度与DNA浓度的平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。3）DNA分子大小和复杂度：DNA分子越大，复性速率越慢。DNA分子越复杂，复性速率也越慢。4）离子强度：增加盐浓度可加快互补链合成双链的速度，盐中和DNA单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥。
核酸分子杂交（molecular hybridization）:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列。
核酸探针（nucleic acid probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。选择探针的最基本的原则：高度特异性；探针的来源是否方便；制备探针的难易程度。核酸探针的类型：基因组DNA探针；cDNA探针；RNA探针；寡核苷酸探针。基因组DNA探针 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列。制备方法:基因克隆的方法；聚合酶链反应(PCR)。特点:多克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽；PCR制备探针简便和省时；相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟。cDNA探针 cDNA(complementary DNA)：是指与mRNA互补的DNA分子。特点:不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。RNA探针：RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高。RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合。RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本底的干扰低。RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。 寡核苷酸探针 特点:根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点；探针长度一般为10～50bp；尤其适合点突变的检测；由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针。
设计原则：探针长度：一般要求在10～50bp；G／C含量为40％～60％；探针分子中应避免互补序列；避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-；借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。理想的探针标记物应具有以下特点：检测物要灵敏、特异、稳定、简便；标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值；标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉；标记物对检测方法无干扰。
核酸探针的标记
放射性同位素标记 常用标记探针的同位素：1）32P：β，半衰期短（14.3d），标记核苷三磷酸，灵敏度很高，分辨率不高。2）35S：β，标记蛋氨酸或取代核苷酸α位磷酸基中的氧，灵敏度高，分辨率较高，核酸序列测定和原位杂交。3）3H：β，半衰期长（4417d），使用较少。4）125I：γ，分辨率高，操作简单，安全防护要求较高，
原位杂交。同位素标记探针的优点：检测灵敏度极高，10-14～10-18g，特异性强，对各种酶促反应几乎无影响，不影响碱基配对。缺点：放射性污染，半衰期限制，高活性对核酸的破坏。同位素标记方法：1.缺口平移法（双链）2．随机引物法（单链）3．DNA探针的末端标记4．PCR标记DNA探针：标记率高；重复性好；简便快速；可大量制备5.单向体外转录制备RNA探针
非放射性标记 化学修饰法：简单、成本低、较通用。酶促反应标记法：灵敏度高，过程较复杂，成本较高。 1．酶标记核酸探针 辣根过氧化物酶（HRP）易进入细胞内部，便宜，易观察，应用最广泛。常用标记方法是戊二醛交联法和过碘酸钠法。2．生物素（biotin）标记核酸探针应用广泛，可替代同位素标记。用链亲和素系统检测。酶促标记法操作复杂，价格昂贵。光敏生物素（photobiotin）标记方法简单，价格适宜。地高辛（DIG）：标记于dUTP上，通过随机引物或缺口平移法引入DNA分子中。可长期保存，不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物反差好，背景染色低。广泛应用于Southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交尤其是原位杂交。荧光素（fluorescein）：标记方法有直接法和间接法。
标记探针的纯化和检测 探针制备和标记时加入的dNTP是过量，除去游离标记物及其dNTP。凝胶过滤层析法：利用凝胶的分子筛作用。乙醇沉淀法：沉淀探针DNA。同位素检测 1.放射自显影：接触法，液体乳胶法，电镜自显影。2.液闪计数法。非放射性探针的检测 1．偶联反应2．显色反应(1)酶促显色法(2)荧光法(3)化学发光法
一、固相核酸分子杂交
分子杂交（hybridization）：样品核酸变性处理，在低温条件下，加入标记的核酸探针，探针与样品互补序列形成杂交双链，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段。按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类，固相杂交：探针；被测DNA（RNA）在固体支持物上杂交。液相杂交：探针；被测DNA（RNA）在液体中杂交 固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。固体杂交的优点：未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶DNA的自我复性，所以被广泛应用。
分子杂交技术一般过程：探针制备及标记（同位素或非同位素）；待测核酸样品制备（分离，纯化）；杂交（液相，固相，原位杂交）；杂交后处理（去掉非特异杂交分子）；显示结果（显色，发光，放射自显影）；结果分析。 Southern印迹杂交：DNA变性→中和→Southern印迹→预杂交→杂交→洗膜→检测。毛细管虹吸原理：转移缓冲液通过滤纸的毛细管上升，形成由下至上的液体流，凝胶上的单链DNA被洗脱并转移到薄膜上，因薄膜的吸附作用而使DNA转移固定在膜上，转移的速度取决于DNA片断的大小和凝胶中DNA片断的浓度。
Northern印迹杂交：Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况。与Southern印迹杂交比较：RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染；所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用；RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA的2‘-羟基基团，在变性剂的存在下进行电泳,防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态。凝胶中不能加EB，因会影响RNA和膜的结合。如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。
斑点杂交（Dot－blot）正向：是将待检样（DNA、RNA或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。反向：是将探针固定。斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。但结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列。多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件的摸索。 菌落杂交
微板酶联杂交：DNA结合微孔板上包被的捕获探针与样品DNA的一条链进行杂交，检测探针则与此链的另一区域进行杂交。夹心杂交后，加入亲合素-辣根过氧化物酶结合物及其底物四甲基联苯氨，显色，测量吸光度。根据吸光度值的大小对样品进行半定量分析。捕获探针共价结合在微孔板上，不仅结合牢固而且结合量大，因而捕获能力很强；捕获探针竖直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而与目的片段的杂交效率很高；检测探针5’端、3’端均标记生物素，等量检测探针结合亲合素-辣根过氧化物酶的量增加。
原位杂交（In situ hybridization ）是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何固相核酸分子杂交技术。原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究之中。其应用有以下几方面：正常或异常染色体的基因定位；应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达水平；应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等。原位杂交材料：石蜡包埋组织切片；冰冻切片；细胞涂片；培养细胞爬片。基本方法：细胞或组织切片的处理：玻片清洗；组织和细胞的固定。增强组织的通透性和核酸探针的穿透性。预杂交。杂交。杂交后漂洗。结果检测。 荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体；地高辛标记的抗体与荧光素标记的抗地高辛抗体；氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探针与抗AAF抗血清等。上述的检测系统有直接法和间接法两种，后者灵敏度更高。
液相核酸分子杂交 吸附杂交：磁珠吸附杂交；亲和吸附杂交；羟基磷灰石吸附杂交。发光液相杂交：能量的传递法；丫啶翁酯标记法
核酸分子杂交实验条件的优化 1）探针的选择：检测靶单个碱基改变选用寡核苷酸探针；在检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体；100bp左右的探针适合原位杂交。2）探针的标记方法：在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法；在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等。3）探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加；膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml；原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。4）杂交最适温度：杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少；最适复性温度比Tm低25℃。一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。Tm值与(G+C)含量、探针的长度、复杂性、杂交体系中离子强度及甲酰胺的含量有关。5）反应时间和洗膜温度：杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右；杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行 。
基因芯片原理 基因芯片(gene chip)又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。该技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。
基因芯片制备 其分析步骤可分为：芯片的制备；样品处理；杂交反应；检测及数据处理。
1）样品的处理 样品的扩增：在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度；待测样品的标记：多采用荧光标记方法，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素检测法。 2）杂交反应 cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相同；用于检测基因表达，较长的杂交时间，高的严谨性，高的样品浓度和低温度；用于突变检测，因要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。 3）结果检测分析 检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等。检测系统主要由信号产生、信号收集及传输、信号处理及成像三个部分组成。使用最广泛的是荧光显影法。 4）固相载体 固体片状材料主要有玻片、硅片和瓷片等；固体膜性材料有硝酸纤维素膜、聚丙烯膜以及尼龙膜等。 5）分型 按固体支持物不同，基因芯片可分为：薄膜型、玻片型、微板型、集成电路型、微通道型等；近年基因芯片技术结合微电极技术、微型聚乙烯酰胺凝胶技术、高速微通道技术制备出了电子芯片（Electronic biochip）、三维芯片（three-dimensional biochip）、流过式芯片(flow-through biochip)等新型芯片。 6）合成点样 点样探针：基因组探针、cDNA探针以及寡核苷酸探针；载体表面的活化主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷偶联试剂，使载体表面带有羟基或者氨基等活性基团。合成点样过程：机械臂将不同探针样品定量(0.25～1.0μl)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100～
150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样装置的不同分为：打印法合成点样及其喷印法合成点样；打印法的优点是探针密度较高，1平方厘米通常可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，1平方厘米通常只可喷印400个探针。 7）原位合成 基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理，它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基所有序列组合。 8）分子印章原位合成 分子印章技术（Molecular Stamps）该技术是一种软光刻技术，分子印章是一种表面有微结构的硅橡胶模板，该方法特点是分辨率、准确率以及产率高。 9）光引导聚合原位合成 光引导聚合技术（ Light-directed synthesis）又称原位光刻技术，是应用最广的原位合成技术，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子；光引导聚合技术是照相平板印刷技术与成熟且已自动化的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。 10）基因芯片的合成方式 原位喷印合成(Ink-Jet Printing synthesis )，原理及其过程与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，其中墨盒中装的是四种碱基液体，喷印头可在整个芯片上移动，并根据芯片上不同位点探针的序列需要，将特定碱基喷印在芯片的特定位置；该技术采用的原理与传统的DNA固相合成相一致，无需特殊的化学试剂。
基因芯片技术的基本应用可以分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）；定性分析（主要指对基因表达的研究）。 1）基因表达水平的检测；2）基因突变和多态性的检测 ；3）基因芯片在药物筛选中的应用；4）预防医学领域的应用 ；5）基因芯片在疾病诊断中的应用 1．感染性疾病诊断 2. 遗传性疾病的诊断
第9章 聚合酶链式反应技术及应用
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。
1.PCR基本原理 PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。
PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率，特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
引物设计基本原则 1）引物的长度：典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度。2）PCR产物长度：一般来说，PCR产物长度对扩增效率有影响。扩增片段长度在普通PCR以200～500bp为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。3）引物的均衡性和GC含量：引物中碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4）引物溶解温度（Tm值）：引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度Tm=2(A+T)+4(C+G)。5）引物自身：引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败; 引物3’端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。5’端序列对PCR影响不如3’端大，常用来引进修饰位点或标记物。
1）DNA 聚合酶(DNA polymerase) PCR发明初期，不耐热的Klenow片段；耐热的Taq DNA聚合酶；－良好的热稳
定性：92.5、95、97.5℃时，半衰期分别为130、40、5～6min；－良好的延伸效率：在75～80℃时延伸效率最高，每个酶蛋白分子的延伸速度可达150个核苷酸/s；－无3′－5′外切酶活性，缺乏校正功能；2）dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP；3）PCR buffer:一般组成：50mM KCl,10-50mM,Tris-Cl (室温PH8.3)，1.5mMMgCl2KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性；Tris-Cl：调节pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2：调节TaqDNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR产物的特异性等
PCR反应条件 1）PCR反应成分 （1）模板：一般100ngDNA模板/100μL。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度：0.1-0.5μmol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)：0.5-5U/100μl，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP:dNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+：Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。对于大多数的PCR引物来说，Mg2+浓度为1.5mmol/L是适宜的，如果扩增效果不好，则调整镁离子的浓度可能会有所帮助。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2）循环参数 (1)变性:使双链DNA解链为单链;94℃,30s～1min。(2)退火:温度由引物长度和GC含量决定，一般比引物Tm值约低5℃。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性，但特异性低。(3)延伸:70-75℃,一般为72℃，延伸时间由扩增片段长度决定。(1~3min)(4)循环次数:主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-30次，次数过多容易产生“平台效应”，错误掺入率增加。 平台效应：DNA以指数形式进行扩增，但是DNA的指数扩增并不能无限期的进行下去，PCR循环后期，由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使得扩增产物累积趋于饱和，原来以指数递增的速率曲线变成平坦的曲线。
PCR扩增产物的检测方法 (一)琼脂糖凝胶电泳法 基本原理：DNA在电泳缓冲液中带负电荷，将PCR产物点样于负极端的加样孔，在电场力的作用下DNA涌向正极，并且由于电荷效应和分子筛效应，不同DNA分子量及构型的DNA涌动率不同；在电泳过程中，凝胶中的EB将嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比；不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同。 操作简单，但存在EB污染。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 特点：分辨力高,长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。
(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息.用途：传染病病原体基因分型，人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法。
(三) 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP） 本法就是将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。该方法和其他方法相比有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。缺点：只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
(四) 核酸探针杂交法 1)点杂交（dot blot） 2)反向点杂交（reverse dot blot） 3)微孔板夹心杂交（microplate hybridization） 4)荧光探针杂交 5)Southern印迹杂交（Southern blot）
(五)PCR产物测序 (六)荧光PCR
污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法。(1)假阳性①PCR产物是最主要的污染源。②阳性对照的污染。③标本之间的交叉污染。④在采集标本时，其他污染源带来的污染。⑤使用带有污染的试剂。(2)假阴性：假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。1)标本处理的原因。①处理标本时，靶DNA丢失。②处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。③标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2)PCR试剂问题。①引物设计不合理。②TaqDNA聚合酶失活。③Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR扩增过程中的问题：①PCR扩增仪故障。②PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。4)PCR产物鉴定中的问题①电泳时没有加溴化乙锭。②电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。③凝胶浓度过低，使扩增带跑散。(3)引物二聚体 形成引物二聚体的原因有：⑴两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3′端有互补区。⑵引物比例太高，可增加模板用量。⑶退火温度过低。⑷热循环次数过多。(4)非特异性PCR产物 造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施：①引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；②TaqDNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量；③Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度；④退火温度过低，可提高退火温度；⑤延伸时间过长，可减少延伸时间；⑥热循环次数过多，应适当增加模板量，减少循环次数。
1）巢式PCR（nested PCR）；2）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）：常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度为42℃）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37℃），常用的逆转录引物有三种：①随机引物；②Oligo（dT），只适合于3′端带有poly(A)尾的mRNA；③特异性引物，只适合于逆转录目的RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR；3）多重PCR(multiplex PCR) ；重组PCR(recombinant PCR)PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。重组PCR中将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段的部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA；4）锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）用于扩增已知一端序列的目的DNA；5）不对称PCR（asymmetric PCR）其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50～100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求；6）反向PCR（inverse PCR）用途：未知序列的研究；7）扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR）；8）免疫PCR(immuno-PCR)；9）原位PCR (in situ PCR)；10）差示PCR（DD-PCR）；11）定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。1．PCR定量DNA：一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是标准的一个理想来源，也可使用含特定靶序列的质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列的含量。2．PCR定量mRNA：(1)mRNA相对定量－靶基因的扩增产物量与内源性对照的扩增产物量的比值(2)竞争性PCR定量mRNA(3)cRNA标准曲线法定量mRNA。
荧光定量PCR（FQ-PCR）基于荧光能量传递技术（FRET），是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别：普通PCR技术在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
PCR扩增的4个主要阶段：线性基线期：扩增最初的10～15个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，产生的荧光信号很低；指数期初期：进入指数期初期，荧光强度达到一个阈值,为基线荧光信号均值标准差的10倍。指数期：PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每循环一次，产物倍比增加。平台期：此时荧光信号不再随扩增循环数的增加而增加。
Ct值:扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。
标准曲线：将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real time PCR，就会按照起始DNA浓度由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模版的对数值之间存在的线性关系，就可制作标准曲线。未知浓度的样品与标品一样，也可得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模版量。
融解曲线的作用：采用SYBR Green I荧光嵌合法检测时，可以通过溶解曲线分析，确认PCR反应的特异性。SYBR green的优点：对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA；使用方便，不必设计复杂探针；灵敏度较高；便宜。缺点：易与非特异性双链结合，产生假阳性，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。 TaqMan：5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等；3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)；探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光；Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针。每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号。TaqMan应用范围：鉴定PCR产物(定性）；定量起始模板浓度；单核苷酸多态性（SNP）检测。优点：对目标序列的高特异性-阴性结果确定；引物设计相对简单；重复性比较好。缺点：只适合一个特定的目标；价格较高。 分子信标molecular beacon：随着每次扩增产物的增加，其荧光强度也增加，因而它可以反映每次扩增末期扩增产物积累的量。 荧光定量PCR的临床应用：遗传疾病的早期诊断；肿瘤的诊断；抗病毒药物疗效的观察、指导；病情评估和预后判断；新药验证；输血源的筛选；母婴传播的控制与观察。 聚合酶链反应方法的标准化：PCR技术的最大优点是具有极高的敏感性，其反应过程与以往其他任何一种检验诊断技术相比，都易受到各种自身和外部因素的影响。所以，制定一套适应当前基因诊断实验的基本要求并使PCR技术标准化的操作程序已迫在眉睫。PCR操作程序标准化：1）上岗人员培训制度2）标准化PCR诊断实验室3）PCR标准化操作程序：1.试剂配制、分装及保存2.标本的采集与处理3.基因扩增及其实验条件的选择4.扩增产物检测5.PCR结果的判读3）污染的预防及污染源的标准化处理 阈值高度：是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。
第10章 分子生物学新技术及应用
第一节 代谢组学及其研究进展
代谢组学是通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。研究对象：相对分子质量小于1000的内源性小分子。代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。 特点：1.关注于内源性小分子化合物。2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究。3.内源性小分子化合物的上调和小调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。 应用：药物研发；疾病研究；植物代谢组学；微生物代谢组学；中药现代化。
代谢组学分析技术：1）气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 2）液相色谱-质谱联用技术：适用于短时间内选定靶标化合物的检测。发展：代谢物靶标分析；轮廓分析；代谢物的结构解析。 新型液相色谱技术UPLC的优点：UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物；提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果；UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。 3）毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）：代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖
酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物）。毛细管电泳以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。应用研究：微生物菌株细胞提取物的代谢分析（糖酵解，磷酸戊糖循环）；植物细胞提取物的代谢分析；疾病诊断和生物标志物发现；食品安全；细胞基因和蛋白功能研究。 4）核磁共振技术（NMR）：在排除杂质及水峰的干扰下，1H-NMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反应化合物结构中的H和C原子的位置信息。 应用：药物毒理学评价研究；人体代谢和动物代谢；病理和生理研究中的应用；环境检测方面的应用；植物化学；微生物系统。
第二节 MicroRNA的研究及应用
miRNA是由21~25个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增值、分化、凋亡以及人类各种疾病等的发生发展过程中发挥重要的调控作用。miRNA通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。miRNA造成疾病发生的可能原因有：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的microRNA表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的microRNA表达上调等。miRNA引发肿瘤的可能原因：1)microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的；2)许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域；3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控。 miRNA引发糖尿病的可能原因：1）参与胰岛素的合成分泌调节；2）对血糖代谢起着直接或间接的调控作用；3）MicroRNA与脂质代谢密切相关。
特征：广泛存在于真核生物中,是一类内源性表达的非编码短序列RNA,本身不具有开放阅读框(ORF)；成熟的miRNA长度通常为21～25nt；miRNA在进化上具有高度保守性；miRNA表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性。 调控机制：1）mRNA剪切：miRNA与靶mRNA几乎完全互补；切割位点在从5‘端起与miRNA配对的第10位和11位核苷酸之间；由RISC中的内切酶催化完成；可催化多个miRNA分子的降解。2）翻译抑制：miRNA与靶mRNA互补程度较低；翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段；翻译顺利进行但翻译产物可能被特异性降解。 研究方法：1）miRNA基因芯片技术，高通量检测miRNA表达情况的最佳选择；2）PAGE/Northern blotting杂交法，可用于miRNA表达水平的定量检测，还能与RNA marker结合使用检测miRNA分子的大小，用来排除其他小分子RNA的污染；3）原位杂交，可直观显示生物体miRNA的时间和组织特异性表达谱；4）miRNA实时定量PCR，可高度灵敏地检测出低丰度表达地靶分子，适用于高通量筛选。 起源与生物合成过程：1.miRNA基因被转录成pri-miRNA(RNA聚合酶Ⅱ)；2.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷 酸 的pre-miRNA (Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA从核内被转移至胞 (Exportin-5, Ran-GTP)；4.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链RNA双体(Dicer,TRBP,PACT)；5.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。
miRNA与siRNA的相同点：1）长度分子量约22nt，5'端是磷酸基，3'端是羟基；2）合成的底物均由双链RNA或RNA前体加工而来；3）依赖Dicer酶并具有Dicer加工产物的特征；4）均需Argonaute家族蛋白参与；5）均为RISC组分，在介导沉默机制上有相似之处；6）作用方式均可抑制靶基因翻译或导致mRNA降解；7）两者关系的假设：siRNA是miRNA的补充；miRNA在进化过程中替代了siRNA。 miRNA与siRNA的不同点：1.miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2.结构上miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用
是抑制转座子活性和病毒感染。
miRNA的鉴定:正向遗传学的突变筛查方法（最初几个miRNA分子的发现；效率不高）；cDNA克隆技术；生物信息学预测方法,是实验预测方法有益和必要的补充。
miRNA基因克隆，是依赖于其本身的特殊结构，5′端的磷酸基团和3′端的羟基基团，以T4RNA连接酶在分子末端加上连接子，然后利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体，最后测序验证。应用：microRNA基因克隆主要用于寻找新microRNA基因，同时还可获得精确的表达信息。基本步骤：1）总RNA的提取 关键：尽量不使小RNA丢失；2）小分子RNA分离纯化及富集变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）方法，是用于小分子RNA分离纯化的理想方法；3）小分子RNA片段修饰 小分子RNA的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在3‘端和5’端连接上连接子等；4））克隆及测序鉴定 含3‘与5’端接头的小分子RNA，经RT-PCR扩增后连接至合适的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆；5）PAGE/Northern blotting验证，是确认microRNA最有效和常用的方法。 PAGE/Northern blotting与常规核酸杂交技术原理相同，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差别在于选择对小分子RNA分离效率更高的PAGE代替琼脂糖作为分离胶。应用：PAGE/Northern blotting方法能提供准确的杂交信息以及有效检测低丰度的RNA分子，在验证micorRNA基因芯片结果及降低假阳性方面具有重要作用，是目前研究microRNA的重要技术。基本操作步骤：1）总RNA的提取 关键：尽量不使小RNA丢失；2）样品处理 取适量提取的RNA样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中混匀，55℃孵育30min，冰浴后准备PAGE分离；3）PAGE分离、转膜及固定；4）寡核苷酸探针的制备 探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射性核素敏感度高，可检测较低丰度的microRNA分子；5）杂交、洗膜、压片及显影；6）如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除Northern印记膜上的放射性，避免放射性污染。
miRNA基因芯片的基本原理与以往传统基因芯片的使用原理基本相同，即经过标记的待测microRNA与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原则杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进行检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的microRNA。主要应用：1）寻找和发现新microRNA基因；2）miRNA相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、白血病、糖尿病等；3）药物筛选和药物开发等。基因芯片技术操作流程：1）MicroRNA基因芯片的设计与制作：可根据实验需要自行设计芯片，需要考虑探针的种类、点阵数目及片基种类等；也可向市面上购买芯片；2）RNA提取与纯化；3）RNA样品的标记：MicroRNA芯片表达谱分析的一个前提条件是检测到所有的microRNA，并且结果具有可重复性。因此，选择合适的microRNA标记系统是实现芯片表达谱检测精确性的一个保证；4）芯片杂交及后处理：由于microRNA分子量小，因此，杂交反应条件及杂交后洗脱条件需谨慎选择；5）图像采集和数据分析：MicroRNA基因芯片图像的采集和分析是microRNA芯片技术的重要环节，芯片图象获取的准确性和分析的可靠性直接影响芯片的应用；6）验证：由于microRNA基因芯片结果存在假阳性的可能性，需要用PAGE/Northern blotting、定量PCR等方法验证。
miRNA实时定量PCR:利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR产物的动态累积，得到S型的扩增曲线;假设该曲线的前期PCR符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA分子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小RNA分子的表达。 主要应用：1）microRNA的定量检测，可精确检测出细胞或组织样品中特定微量的microRNA表达水平；2）由于该方法可以同时检测microRNA及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解microRNA的起源和发生；3）应用于临床诊断和治疗等。 操作步骤:1)总RNA提取、小分子RNA的分离纯化及富集;2)逆转录反应:miRNA的逆转录反应与普通的针对mRNA的逆转录反应过程基本相似，但也有其特异之处，如它的逆转录酶的特异性等;3)实时定量PCR:针对miRNA的实时定量PCR的热学反应条件要谨慎选择。 miRNA功能的研究方法:对特点细胞或组织中外源性抑制或过表达目的miRNA后，检测引起的生理学及病理学变化;外源性抑制：敲除miRNA、人工合成miRNA抑制剂;过表达：构建miRNA表达载体或合成miRNA前体转染目的细胞。 miRNA的克隆：寻找miRNA基因1.提取2.变性胶分离收获19-25nt的小RNA3.小RNA多聚腺苷酸化4.RT-PCR5.聚丙烯酰胺凝胶纯化6.cDNA连上载体，构建文库7.筛选克隆进行测序，获得miRNA。
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