猪圆环病毒2型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

福建农林大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎｌａ　ｏｆ　ＦｕｊＪａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　第加卷第４期　２０１１年７月　猪圆环病毒２型ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时　荧光定量ＰＣＲ方法的建立　修金生　，吴顺意　，曾新斌　，陈小权　（１．福建农林大学动物科学学院，福建福州３５０００２；２．福建省农业厅动物疫控中心，福建福州３５０００１）　摘要：参考ＧｅｎＢａｎｋ上的猪圆环病毒２型（ＰＣＶ２）全基因序列，根据其开放阅读框ＯＫＦ１保守序列设计引物，建立基于　ＳＹＢＢＧｒｅｅｎＩ荧光定量ＰＣＲ方法来检测ＰＣＶ２．所建立的荧光定量ＰＣＲ方法最低检测限为８２．２拷贝・反应～，与常规ＰＣＲ　相比，灵敏度高出１００倍．扩增产物的融解曲线只出现１个单特异峰，无引物二聚体，溶解温度为（８５．９８±０．１３）℃，对猪圆　环病毒１型（ＰＣＶ１）、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒元扩增，可重复性好，组　内变异系数为Ｏ．２９％一１．３５％，组间变异系数为０．９６％一２．４２％，检测速度快，从样本处理到报告结果得出仅需３　ｈ．本方法　的建立为Ｐｃｖ２快速诊断和流行病学调查提供新的检测方法．　关奠词：猪圆环病毒２型；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ；实时荧光定量ＰＣＲ　中圈分类号：ｓ８５４．４　３　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１￣４７０（２０１１）０４－０３９６－０５　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓⅦＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２　ＸＩＵ　Ｊｉｎ－￣ｈｅｎｇ　，ＷＵ　Ｓｈｕｎ－ｙｉ　，ＺＥＮＧ　Ｘｉｎ－ｂｉｎ　，ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏ．ｑｕａｎ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　ｃｉＳｅｎｃｅ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａ＃ｃｕｈｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，ＦｕｊＪａｎ　３５０００２，Ｃｈｉｎａ；　２．ＦｕｊＪ｝ａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉｌａ　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｆｕｚｈｏｎ，ｒｕｊｊａｎ　３５０００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｐａｉｒ　ｏｆ　８ｐｅｃ进ｃ　ｐｆｉｍｅｍ　ｔａｒｇｅｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ＯＲＦ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｐｏｅｉｎｅ　ｃｉｒｅｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２　Ｗ８８　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　８　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｂａｓｅｄ　ｒｅＢｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｚａｔｌｏｎ　０ｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｃｏｖｉｒｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｍｅ／－　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｗａｆｔ　８２．２　ｐｌａｓ￣ｄ　ｃｏｐｉｅｓ　ｐｅｒ　Ｌ．Ｔｈｅ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｇ　ｎＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｄｙｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｏｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｅａｋ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｉｉｒｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｓ（８５．９８±０．１３）℃，ａｎｄ　ｎｏ　ｐｒｉｍｅｒ－ｄｉｍｅｍ　ｐｅａｌ【ｐｒｅｓｅｎｔｄ．Ｎｏ　ａｅｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｃｔｅｅｄ　ｆｒｏｍ　ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ｔｉｓ　ｍｅｔｈｈｏｄ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１，ｐｏｒｃｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｕｓ．Ａｌｓｏ　ｎｏ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｃｔｅｄ　ｆｅｕｍ　ｒｕｎｒｅｌａｔｄ　ＲＮＡ　ｓａｅｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｓｗｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ，ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ，ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｕｓ．Ｆｒｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　Ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｐｌｓｍｉａｄ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ｉｎｔｍ－ａｓｓａｙ　ｄＯ．２９％一１．３５％　．ａｎｄ　ｉｎｔｅｒ－ａｓｓａｙ　ｏｆ０．９６％－２．４２％．Ｔｈｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ｕｓｅｆＩｌｌ　ｏｒ　ｒａｐｉｆｄ　ｌｌ￣ａｏｒａｔｏｒｙ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｎｄ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ｉｎｖｅｓｔａｉｇａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２；ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　猪圆环病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖ／ｒｕｓ，Ｐｃｖ）为无囊膜单股环状ＤＮＡ病毒，病毒粒子直径ｌ７—２ｏ删，呈２０　面体对称．病毒粒子由衣壳蛋白和核酸组成，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，在分类地位上属圆　环病毒科圆环病毒属成员．根据ＰＣＶ致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，将ＰＣＶ划分为猪圆环病毒１型　（ＰＣＶ１）和猪圆环病毒２型（ＰＣＶ２）２种基因型＿１　Ｊ．ＰＣＶ１无致病性，但广泛存在于猪体和猪源细胞系；　ＰＣＶ２具有致病性，可引起猪的多种疾病，包括仔猪断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾炎综合征、猪呼　吸道综合征等　】．　单一ＰＣＶ２感染不引起明显的临床症状，容易忽视该病的存在，但ＰＣＶ２感染后可破坏免疫系统，可导　致感染动物机体免疫系统功能严重受损，形成免疫抑制作用，从而增强对其他多种病原体的易感性，使动　物群体发生难以控制的复发性疾病和多重感染．目前，病原学和血清学调查证实ＰＣＶ２广泛存在于世界各　收稿日期：２０１１—０４—１０　修回日期：２０１１－０５—１８　基金项目：福建省农业科学技术项目（２００９－０３）．　作者简介：修金生（１９５７一），男，到教授．研究方向：生态养猪和猪痫防控・Ｅｍａｉｌ：ｘｉｕｊｉｎｓｈｅｎｇ＠１６３・ｃｏｎｒ・　第４期　修金生等：猪圆环病毒２型ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时荧光定量ＰＣＲ方法的建立　．３９７．　地的猪群中，在我国猪群中流行十分严重，临床上常与猪高致病性蓝耳病混合感染，给养猪业造成重大经　济损失　．６　，这主要与目前对ＰＣＶ２流行毒株的变异、基因型、遗传与衍化等分子流行病学的研究尚不完　全清楚有关　’’　．因此，本方法的建立为ＰＣＶ２感染的早期诊断和疫苗免疫效果评价手段提供新的参考．　１材料与方法　１．１材料　１．１．１毒株与菌株ＰＣＶ１、ＰＣｖ２、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪　瘟病毒由本实验室分离鉴定并保存．　．　１．１．２仪器与试剂主要仪器和试剂有Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｅｐ　ｒｅａｌｐｌｅｘ荧光定量ＰＣＲ仪（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），　ＳＹＢＲ＠Ｐｒｉｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ珈（Ｐｅｆｒｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）、Ｐｒｉｍｉｘ　ＴａｑＴＭ（Ｅｘ　ＴａｑＴＭ　Ｖｅｒｓｉｏｎ）、Ｐｅｆｒｅｃｔ　ＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）、ＲＮＡｉｓｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ、ｐＭＤ１８一Ｔ、ＤＬ２０００　Ｍａｒｋｅｒ购自宝生物工程（大连）有限公司，胶回收　试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自北京天根公司，荧光定量ＰＣＲ管购自美国Ａｘｙｇｅｎ公司．　１．２引物设计及合成　参考ＧｅｎＢａｎｋ上ＰＣＶ２全基因核苷酸序列，利用Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ　Ｖ７．１　ＤＮＡＳｔａｒ软件进行同源性分析比较．　选取ＰＣｖ２全基因ＯＲＦ１高度保守且特异的核苷酸区域，利用Ｏｌｉｇｏ　７．０软件，设计引物．采用ＢＬＡＳＴ工具　进行检索，初步验证其特异性，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成．所设计的特异性上、下游引物序　列分别为ＰＣＶｒＦ（５　－ＣＣｃｃＧ眦ＡＡＴＧＧ１’ＡＣＴｃ．３　）、ＰＣｙｒＲ（５　－ＧＡＡＡＧｌ姗ＡＣＧＡＡ（　ＧＧＣ－３　），预计扩　增片段长度为１３３　ｂｐ．　１．３病毒核酸的提取　ＤＮＡ病毒核酸的提取参考文献［１０］的方法，采用蛋白酶Ｋ法提取病毒ＤＮＡ，所获得的ＤＮＡ置于　一２０℃备用；ＲＮＡ病毒核酸的提取参考文献［１０］的方法，取３００　Ｌ病毒液加入７００　Ｌ　ＲＮＡｉｓｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ，　按照说明书方法进行操作，获得ＲＮＡ后，用Ｐｅｒｆｅｃｔ　ＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ　ｒｅｇａｅｎｔ　Ｋｉｔ进行反转录，所获得的ｃＤＮＡ置　于一２０℃备用．　１．４阳性标准品的制备　将“１．３”中提取的ＰＣＶ２病毒ＤＮＡ，用所设计的特异性引物（ＰＣＶ２Ｆ：５　－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＴｒＣＣＡＡＴＡＴＣ－３　和ＰＣＶ２Ｒ：５　．ＡＣ从ＧＡＣＴＣＡＧＴＡＡ，Ｉ－Ｉ．Ｉ＇Ａ，Ｉ－Ｉ’ｒＣＡ＿３　）进行扩增，扩增片段长度为８５８　ｂｐ，扩增体系为５０　Ｌ．　扩增体系含２５　ｔｔＬ　Ｐｒｉｍｉｘ　ＴａｑＴＭ（Ｅｘ　ＴａｑＴＭ　Ｖｅｒｓｉｏｎ）、上下游引物（２ｏ　ｐ￣ｍｏｌ・ｌｌｌＬ　）各１　、１　ｐ，Ｌ　ｃＤＮＡ，补　充灭菌去离子水至终体积５Ｏ　Ｌ．反应条件：（１）９５　ｏＣ预变性５　ｍｉｎ；（２）９４℃变性４０　ｓ，５４℃退火３５　ｓ，７２　℃延伸６ｏ　ｓ，进行３０个循环；（３）７２℃延伸１０　ｍｉｎ．取５　ｔｔＬ　ＰＣＲ产物，在１．Ｏ％琼脂糖凝胶上电泳．ＰＣＲ产　物经胶回收试剂盒纯化后与ｐＭＤＩ８－Ｔ载体连接，转化ＤＨＳａ感受态细胞．用ＰＣＲ和双酶切方法鉴定重组　质粒，阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定．测序结果表明，该阳性重组质粒符合预　期，可作为ＰＣＶ２荧光定量ＰＣＲ试验的阳性标准品．　１．５　ＰＣＶ２　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立　．　１．５．１反应条件的优化采用ＳＹＢＲ￣Ｐｒｉｍｉｘ　Ｅｘ　ＩＩａｑＴＭ（Ｐｅｆｒｅｃｔ　ｅＲａｌ　ｉＴｍｅ）推荐的２０　Ｌ反应体系，以出现　最高的荧光值、最小的循环数以及在融解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度（５２—６６℃）　进行优化．　１．５．２标准曲线的建立用紫外分光光度计测定阳性标准品２６０　ｎｔｎ处的光密度（Ｄ蛳　），计算ＤＮＡ拷　贝数，随后将标准阳性样本进行连续１Ｏ倍系列稀释（１Ｏ～一ｌＯＩ６），以“１．５．１”的条件进行扩增，以拷贝数　为横坐标，以最小的循环数为纵坐标建立标准曲线．　１．５．３特异性检测用“１．５．１”优化的条件分别检测ＰＣＶ１、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合　症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的核酸，对其特异性进行评价．　１．５．４可重复性及再现性评估对同一阳性标准品设４个重复管，用实时荧光定量ＰＣＲ进行检测，评价　其重复性，计算组内变异系数；将该标准阳性样本置于一２０　ｃＩ＝保存，分别于第１０、２Ｏ、３Ｏ天重检，评价其再　福建农林大学学报（自然科学版）　第４０卷　免疫荧光试剂盒（ＩＦＡ），存在非特异性强、价格偏贵的缺点．普通ＰＣＲ可快速、敏感特异性地检测ＰＣＶ２，但　其在ＰＣＶ２的定量上存在不足，不利于病毒感染的早期诊断和明确病毒的核算载量，从而影响了其实用价　值［１　圩】．与传统的ＰＣＲ相比，荧光定量ＰＣＲ能有效地减少试验过程中产生污染的危险，并以其高灵敏度、　高特异性、速度快等优点在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用．　本试验建立的实时荧光定量ＰＣＲ方法用于　ｖ２的检测，其标准曲线线性关系良好（　＝０．９９５），扩　增效率达９８％，且组内和组间的变异系数小（分别为Ｏ．２９％一１．３５％和０．９６％一２．４２％），说明该方法准　确率和重复性良好，其检测限为８２．２拷贝・反应～，同时，对其他猪常见病检测结果均为阴性，从样本处　理到报告结果得出可在３　ｈ内完成，说明该方法特异性好、灵敏度高，可用于ＰＣＶ２的流行病学早期监测．　参考文献　［１］ＡＬＬＡＮ　Ｇ　Ｍ，ＥＬＬＩＳ　Ｊ　Ａ．Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｅｔ　Ｄｉ￣ｚｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，２０００。１２（１）：３—１４．　［２］ＭＯＲＯＺＯＶ　Ｉ，￣ＮＡＲＵＭＩＴＲ　Ｔ，ＳＯＲＤＥＮ　Ｓ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｄｒｃｏｖｉｎｍ　ｉｎ　ｐ　ｗｉｔｈ　ｏｓｐｔｗｅａｎ・　ｉｎｇ　ｍｕｌｉｔｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｗａｓｉｔ￣ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３６（９）：２５３５—２５４１．　［３］ＭＥＥＨＡＮ　Ｂ　Ｍ，ＭＣＮＥＩＬＬＹ　Ｆ，ＴＯＤＤ　Ｄ，ｅｔ　１ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｉｔｏｎ　ｏｆｎｏｖｅｌ　ｃｉｃｒｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＭ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｗａｓｉｔ￣ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ　ｉｎ　ｐｉｓｓ［Ｊ］．Ｇｅｎ　Ｖｉｅｒ１．，１９９８，７９（９）：２１７１—２１７９．　［４］ＬＥ　ＣＡＮＮ　Ｐ，ＡＬＢＩＮＡ　Ｅ，ＭＡＤＥＣ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｐｉ　ｗａｓｉｔ￣ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｒｅｃ，１９９７，１４１（２５）：６６０．　［５］郎洪武，王力，张广川，等．断奶仔猪多系统衰竭弱综合征血清学抗体检测［Ｊ］．中国兽医科技，２０００，３０（３）：３—５．　［６］张琪，李书华，王淑杰，等．猪圆环病毒感染诊断方法研究进展［Ｊ］．动物医学进展，２００８，２９（６）：９０—９３．　［７］ＫＥＫＡＲＡＩＮＥＮ　Ｔ，ＭＯＮＴＯＹＡ　Ｍ，ＤＯＭＩＮＧＵＥＺ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２（ＰＣｖ２）ｖｉｒａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｉｍｍ￣ｏｍｏｄｕ－　ｌａｔｅ　ｒｅｃａｌｌ　ｍｔｉ￣ｎ　ｒｅｓｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｖｅｐｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２００８，１２４（１－２）：４１—４９．　［８］徐娜，李宝玉，娄忠子，等．猪圆环病毒Ⅱ型的研究进展［Ｊ］．生物技术通讯，２０１０，２１（６）：２３—２６．　［９］ＧＵＯ　Ｌ，ＬＵ　Ｙ，ＷＥＩ　Ｙ，ｃｔ　ａ１．Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２（Ｐｃｖ２）：ｇｅｎｅｉｔｃ　ｖａｒｉａｉｔｏｎ　ａｎｄ　ｎｅｗｌｙ　ｅｍｅｒｇｌｎｇ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ　Ｊ，２０１０，１９（７）：２７３．　［１０］莎姆布鲁克Ｊ．分子克隆实验指南［Ｍ］．黄培堂，译．北京：科学出版社，２００５．　［１１］姜海军，陈琼，孔繁德，等．猪圆环病毒２型ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立与初步应用［Ｊ］．福建农林大学学　报：自然科学版，２００７，３６（５）：４９６—４５０．　［１２］ＭＣＩＮＴＯＳＨ　Ｋ　Ａ，ＴＵＭＢＥＲ　Ａ，ＨＡＲＤＩＮＧ　Ｊ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｖａｌｉｄａｔｉ０ｎ　ｏｆ　ａ　ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ　ｒｅａｌ－ｉｔｍｅ　ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｈｔｅ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｉｔｏｎ　ｏｆ　ｐｏｃｒｉｎｅ　ｄｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２　ｉｎ舱ｍｍ，ｂｌ崎ｃｏａｔ，ｆｅｃｅｓ，ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｉｔｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，２００９，１３３　（１－２）：２３—３　３．　［１３］ＶＩＬＣＥＫ　Ｓ，ＶＬＡＳＡＫＯＶＡ　Ｍ，ＪＡＣＫＯＶＡ　Ａ．ＬＵＸ　ｒｅａｌ－ｉｔｍｅ　ＰＣＲ　ｓａｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｐｃｉｎｅ　ｃｉｃｒｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２［Ｊ］．Ｊ　ｖｊｍｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，１６５（２）：２１６—２２１．　［１４］ＬＡＢＯＣＨＥＬＬＥ　Ｒ，ＡＮＴＡＹＡ　Ｍ，ＭＯＲＩＮＥ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ｏｒｐｃｉｎｅ　ｃｉｃｒｏｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｂｙ　ｍｕｌｉｔｐｌｅｘ　ＰＣＲ　［Ｊ］．Ｊ　ｖｉｍｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，８０（１）：６９—７５．　［１５］王忠田，杨汉春，郭鑫．规模化猪场ＰＣＶ２感染的流行病学调查［Ｊ］．中国兽医杂志，２００２，３８（１０）：３—６．　（责任编辑：施晓棠）