微生物与生化药学问答题

微生物与生化药学问答题

微生物与生化药学问答题

第二章基因工程制药

1. 利用基因工程技术生产药物的优点？

答：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；

2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，

从而扩大这些物质的应用范围；

3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；

4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工

程进行改造和去除；

5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

2. 基因工程药物制造的主要步骤？

答：目的基因的克隆；

构建DNA 重组体；

将DNA 重组体转移入宿主菌构建工程菌；

工程菌的发酵；

外源基因表达产物的分离纯化；

产品的检验等。

3. 化学合成目的基因的先决条件？

答：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成，其先决条件：已知目的基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA 的碱基序列。

4. 人工合成基因的限制有哪些？

答：1、不能合成太长的基因，50~60 个碱基对；

2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码带来很大的困难：

3、费用高。

5. 基因工程宿主菌应满足那些要求？目前应用最广泛的宿主菌有哪些？

答：1、容易获得较高浓度的细胞；

2、能利用廉价易得的原料；

3、不致病、不产生内毒素；

4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；

5、容易进行代谢调控；

6、容易进行DNA 重组技术操作；

7、产物的产量、产率高，产物容易提取。

宿主菌可分两大类：1、原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；

2、真核细胞：酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。

6. 表达载体须具备哪些条件？常用载体有哪些？

答：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。

2、具多个限制酶切点，但每种切口最好只有1 个，以便与外源基因连接。

3、具有某些标记基因，便于进行筛选。

4、所产生的mRNA 必须有翻译的起始信号。

5、具有很强的启动子。

6、有很强的终止子。

常用载体有：1、细菌细胞的质粒。

2、λ噬菌体载体。

7. 真核基因在大肠杆菌中的表达形式？

答：有三种形式：

(1)融合蛋白的表达形式。

（由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白.。）(2)非融合蛋白的表达形式。

(3)分泌型表达形式。

8. 表达用的酵母菌应满足哪些条件？

答：表达用的酵母宿主菌应具备：

①体生长力强.

②菌体内蛋白酶要较弱.

③菌株性能稳定.

④分泌能力强。

9.基因工程菌在发酵过程中对发酵罐有哪些要求？

答：①要提供菌体生长的最适宜条件；

②培养过程不得污染，保证纯菌培养；

③培养及消毒过程中不得游离出异物；

④不能干扰细菌代谢活动。

10.离子交换层析的原理？

答：当离子交换剂处于水溶液中时，活性离子可以从活性基因上解离下来，在基质骨架与溶液间自由迁移，并可与溶液间的同性离子，因与活性基因的化学亲和力不同而发生交换，即发生离子交换作用。

11.疏水层析的基本原理？

答：蛋白质表面多由亲水基团组成，也有一些疏水性较强的疏水区。在高盐浓度时，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水作用增强，与固定相上的疏

水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来。

12.亲和层析的基本原理？

答：通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质（也称载体）上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。

（被固定在基质上的分子称为配体，配体与基质共价结合，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。）

13.凝胶过滤层析的优缺点？

答：优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性。

缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间。

第三章细胞工程制药

1.动物细胞的生理特点？

答：1 细胞分裂周期长（动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。）。

2 细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象。

3 二倍体细胞寿命有限（异倍体细胞系寿命长）。

4 对生长环境要求敏感。

5 培养基要求高。

6 合成的蛋白质有修饰。

2.动物细胞培养时加入血清的作用机制？

答：提供基本营养物质；

提供激素和各种生长因子；

提供贴附因子和伸展因子；

对培养中的细胞起到某些保护作用；

提供PH\\缓冲物质，调节培养基PH；

影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。

3.无血清培养基的优点？

答：优点：①可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。

②避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；

③避免血清组分对实验研究的影响；

④有利于体外培养细胞的分化；

⑤可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

（缺点：主要表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养的保存和应用不如传统的合成培养基方便。）

4.动物细胞大规模培养的方法有哪些？

答：①根据培养细胞的种类：原代细胞培养和传代细胞培养。

②根据培养基的不同：液体培养和固体培养。

③根据生产实际：贴壁培养、悬浮培养和贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）。

5.动物细胞悬浮培养的优缺点？

答：优点：适用的细胞较广；

容易更换培养液；

容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度。

缺点：操作比较麻烦；

培养条件不易均一；

传质、传氧较差；

不能有效监测细胞的生长；

需要合适的贴附材料和足够的面积；

扩大培养比较困难，投资大。

6.动物细胞贴壁培养的优缺点？

答：优点：操作简单，培养的体积大、成本低；

培养条件比较均一；

传质、传氧较好；

传代时无需消化分散；

容易扩大培养规模。

缺点：由于细胞体积较小，难采用灌流培养，细胞密度较低

7.动物细胞包埋或微囊培养的优点？

答：包埋在在体内的细胞可以获得保护，避免了剪切力的损害。

可以获得较高的细胞密度，一般都在10^7~10^8 个/ml 以上。

可以使产品浓缩在微囊内，利于下游产物的纯化。

可以采用多种生物反应器进行大规模培养。

8.动物生物反应器的作用、类型及应满足哪些条件？

答：应满足的条件：材质无毒；

结构的传质、传热和混合性能；

密封性好；

参数能自动检测和调控；

长期连续运转；

内面光滑、无死角；

拆装、清洁、维修和消毒；

设备成本。

动物生物反应器的作用：是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最大量、最优质的所需产物。

反应器类型：搅拌罐式反应器、气升式生物反应器、中空纤维式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器和固定床或流化床式生物反应器。

第四章抗体工程制药

1.免疫导向疗法为什么没有成功？从哪些方面可以对单克隆抗体进行改造？

答：阻碍：A．单克隆抗体的均是鼠源性抗体，应用于人体可内可产生人鼠源抗体，加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物的作用

靶组织时间。

B．完整的抗体份子Ig 分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。

改造：A．降低单克隆抗体的免疫原性。

B．降低单克隆抗体的相对分子质量

（1）人-鼠嵌合抗体：由人抗体的恒定区与鼠源单抗的可变区融合得到。

（2）.改型抗体：把鼠抗体的CDR 序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体

（3）小分子抗体小分子抗体包括：Fab、Fv 或ScFv 、单域抗体、最小识别单位。

这些部位都可以改造。

2.单克隆抗体的制备流程及方法。

流程：将有用抗原免疫过的淋巴细胞与骨髓瘤用PEG 进行杂交融合。

把融合的细胞在HAT 培养基上选择出来。

将选择后的整合细胞分散，培养成杂交瘤细胞。

使能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆化。

杂交瘤细胞抗体的性状的鉴定。

单克隆抗体的大量制备，一是在培养液中大更是繁殖，二是注入纯系小鼠腹腔中大量繁殖。单克隆抗体的纯化。

制备方法：体内诱生法和体外法。

3.动物体内诱生法制备单克隆抗体的优缺点

答：优点：简单，比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交

瘤细胞株和分分离已污染的杂菌的杂交瘤细胞株。

缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。

4.鼠源性单克隆抗体改造后的抗体类型及各自的特点？

答：①人-鼠嵌合抗体：保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性，但对人免疫原性大幅下

降了。

②改型抗体：鼠源性单克隆抗体的互补决定区（CDR 区）序列替换人的Ig 分子中的

CDR 序列。基本消除免疫原性。

③小分子抗体：Fa b 将Iｇ的重链在铰链区的C 端裂解，获得两个完全相同的抗原结

合片段。才铰链区和二硫键相连。有完整的生双价抗体活性，相对分子

质量减少为三分之一，排斥反应也降低，人体内很稳定。Fv 含有L 链

和Fd 链一半的N 端可变区。有完整的抗体相似的结能力，相对分子

质量减少为六分之一。

④单链抗体scFv：单链易改造；体内半衰期短，免疫原性低；稳定性低，重轻链之间

的分子间作用力弱；功能单一，只能与一种抗原特异性结合；亲和

力低，稳定性差，体内清除过快。域抗体：只由一个CDR 构成。

5．多功能抗体的优点。

答：具有高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。

6.有应用价值的多功能抗体应具备有哪些特征。

能高选择性，高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合。

在血循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力。

应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使得复给药不受限制。

分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的滞留时间。

7.抗体导向酶-前药疗法中酶和前药有哪些要求？

答：（1）对酶的要求：活化酶最好来自非哺乳动物，而人体内不存在相应的类似物，以保证高度的特异性。酶还能通过化学交联与单抗结合，在较长的一段时间内保持稳

定性和活性。

（2）对前药的要求：前药本身应无活性或活性很低，只能被相应的酶活化为高度扩散性的小分子，以实现在肿瘤组织内的广泛分布和杀伤肿瘤细胞。而且前药还应具

有极短的生物半衰期，避免重新进入循环产生非特异性毒性。

第六章酶制药工程

1.用微生物生产酶制剂的优点：

答：（1）微生物种类多，品种齐全

（2）微生物生长繁殖快，生长周期短，产量高

（3）培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量

（4）微生物具有较强的适应性和应变能力

2.优良的产酶菌株应满足哪些要求：

答：1 繁殖快，产酶量高，酶的性质应符合使用要求，最好是产生胞外酶的菌，

2 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质，

3 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，

4 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养

3.固定化酶的优点：

答：1 可以较长时间内多次使用，酶的稳定性高。

2 反应后，酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高。

3 反应条件易于控制。

4 酶的利用率高。

5 比水溶性酶更适合于多酶反应。

4.物理吸附法制备固定化酶的优缺点：

答：优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，固定化过程和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可以再生。

缺点：最适吸附酶量五规律可循，对不同的载体和不同酶的吸附条件不同，吸附量和酶活力不一定成平行关系，同时载体与载体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。

5.共价结合法制备固定化酶的优点和缺点;

答：酶以共价键结合于载体上即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进

行共价结合的方法。

优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，

缺点：条件苛刻，操作复杂，而且采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白的高级结构的变化，破坏活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。

6.酶固定化过程中选择载体的依据以及载体需满足哪些条件：

答：依据：1 酶促反应的性质；2 底物类型；3 固定化方法。

载体需满足的条件：1.固定化过程中不引起酶变反性。2.对酸碱有一定的耐受性。3 有一定的机械强度4.有一定的亲水性和良好的稳定性。5.有一定的疏松网状结构，颗粒均匀。

6.共价结合时具有可活化基团。

7.有耐受酶和微生物细胞的能力。

8.廉价易得。

7.固定化细胞的优点和缺点：

优点：1.无需进行酶的分离纯化。

2.细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高。

3.细胞内酶比固定化酶稳定性更高。

4.细胞内酶的辅酶因子可以自动更生。

5.细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。

6 抗污染能力强。

缺点：1.利用的仅是细胞内酶，而细胞多种酶的存在，会形成不需要的副产物。

2.细胞膜.细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。

3.载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。

8.固定化酶和细胞的生物反应器类型：

答：1.间歇式搅拌罐反应器。2.连续流动脚步罐反应器。3.填充床反应器。4.流化床反应器。

5.循环反应器。

6.连续流动脚步罐—超滤膜反应器。

7.其他反应器。

9.有机相中酶催化反应的优点:

答：1.增加流水性地位或产物的溶解度。

2.热力学平衡向合成方向移动。

3.可抑制有水参与的副反应。

4.酶不溶于有机介质，易于回收再利用。

5.容易从低沸点的溶解中分离纯化产物。

6 酶的热稳定性提高，pH 的适应性扩大。

7.无微生物污染。

8.能测定某些在水中不能测定的常数。

9.固定化酶的方法简单，可以只沉积在载体表面

1．生物技术制药分为哪些类型？

生物技术制药分为四大类：

（1）应用重组DNA 技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。

（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等

（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物

（4）合成与部分合成的生物药物

2．生物技术制药具有什么特征？

（1）分子结构复杂

（2）具有种属特异性

（3）治疗针对性强，疗效高

（4）稳定性差

（5）基因稳定性

（6）免疫原性

（7）体内的半衰期短

（8）受体效应

（9）多效性

（10）检验的特殊性

3.生物技术制药中有哪些应用？

应用主要有：

（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物

（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药

（4）发酵工程制药

4.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？

（1）外源基因的计量

（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点c、SD 序列和起始密码的间距d、密码子组成

（3）表达产物的稳定性

（4）细胞的代谢负荷

（5）工程菌的培养条件

5.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？

质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。

质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子

代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA 从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。

提高质粒稳定性的方法如下：

（1）选择合适的宿主细菌

（2）选择合适的载体

（3）选择压力

（4）分阶段控制培养

（5）控制培养条件

（6）固定化

6.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？

影响因素：

（1）培养基

（2）接种量

（3）温度

（4）溶解氧

（5）诱导时机的影响

（6）诱导表达程序

（7）PH 值

7.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？

高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L 以上，理论上的最高值可达200gDCW/L

影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物

实现高密度发酵的方法：

（1）改进发酵条件：a、培养基b、建立流加式培养基c、提高供养能力

（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径b、对碳代谢流进行分流c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因

（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

8.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?

方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。（1）离子交换色谱IEC：是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

（2）疏水层析HIC：是利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组进行分离的层析方法。

（3）亲和层析AC：是利用固定化配体与目的蛋白质之间的非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

（4）凝胶过滤层析：以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

9.对由基因重组技术所获得的蛋白质药物进行鉴定时，常做哪些项目分析？

基因工程药物质量控制主要包括以下几点：产品的鉴别，纯度，活性，安全性，稳定性和一致性

项目分析主要有：

（1）生物活性测定

（2）理化性质鉴定

（3）蛋白质含量鉴定

（4）蛋白质纯度分析

（5）杂志检测

（6）稳定性考察

（7）产品一致性的保证

10.离体培养的动物细胞分为哪些类型?

分为三类：

（1）贴壁细胞：细胞生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长增殖。

（2）悬浮细胞：细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中悬浮状态生长

（3）兼性贴壁细胞：既可贴附于支持物表面生长，又在悬浮生长。

11.常用的培养动物细胞的培养基的种类有哪些？

（1）天然培养基

（2）合成培养基

（3）无血清培养基

12.如何进行动物细胞大规模培养？

大规模培养的方法：

（1）悬浮细胞

（2）贴壁细胞

（3）贴壁—悬浮细胞：a、微载体培养b、包埋和微囊培养c、结团培养

大规模培养的操作方式：

（1）分批式操作

（2）半连续式操作

（3）灌流式操作

13.动物细胞生物反应器必须具备哪些基本要求？有哪些类型？特定是什么？

动物细胞反应器具备的基本要求：

（1）制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的。

（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能

（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。

（4）对培养基环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精度高，而且能保持环境质量的均一。

（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要。

（6）容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积。

（7）拆装，连结和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修

（8）设备成本尽可能低。

反应器类型及特点：

（1）搅拌罐式生物反应器：主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养以及结团培养

（2）气升式生物反应器：气体通过装在罐底的喷管进入反应器的导流管，致使该部液体的密度小于导流管外部的液体形成循环流。

（3）中空纤维式生物反应器：占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低，不能重复使用，不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌，难以取样检测。（4）透析袋或膜式生物反应器：可使细胞达到高密度，又可随意组合进行操作，对产品进行浓缩纯化。

（5）固定床或流化床生物反应器：结构简单，装填材料易得。

14.什么是单克隆抗体？单克隆抗体有哪些不足？

单克隆抗体：是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B 淋巴细胞克隆产生的抗体。

不足：

（1）单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h ，难以维持有效药物作用靶组织时间。

（2）完整的抗体分子，即Ig 的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度。

15 如何制备杂交瘤细胞？

将两个细胞（例如B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞）通过诱导融合形成杂交细胞，具体操作时为了提高成功率会用多个细胞同时杂交，然后筛选出目的细胞，再进行细胞培养使其有

丝分裂而增值，得到大量目的细胞（杂交瘤细胞）。

16．基因工程抗体有哪些类型？其特性和制备方法有什么不同？

基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。（1）嵌合抗体嵌合抗体（chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。

（2）人源性抗体是将人抗体的CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的CDR ，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。

（3）完全人源化抗体采用基因敲除术将小鼠Ig 基因敲除，代之以人Ig 基因，然后用Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

（4）单链抗体是将Ig 的H 链和L 链的V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV （single chain fragment of variable region,sFv ）。SFv 穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

（5）双特异性抗体将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。

17.抗体治疗药物有哪些？

（1）放射性同位素标记的抗体治疗药物

（2）抗癌药物偶联的抗体药物

（3）毒素偶联的抗体药物

18.抗体诊断试剂有哪些类型？

（1）血清学鉴定用的抗体试剂

（2）免疫标记用的抗体试剂

（3）导向诊断药物

（4）CD 单克隆抗体系列

19. 单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？

原理：

B 淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。

B 细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的

能力也是极其微小的。将这种B 细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B 淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。

过程

1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c 小鼠。免疫的方法取决于

所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG 的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT 的活性的细胞不能在含8-AG 的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h 换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3）细胞融合的关键:

1 技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2 融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10 天作第一次检测，过早容易出现假

阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA 法、ELISA 法和免疫荧光法等。其中ELISA 法最简便，RIA 法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1 个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3 次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。

（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。

（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。

6）细胞的冻存与复苏

7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞

随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c 小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml 的腹水，有时甚至超过40ml 。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。

意义：

用于以下各种生命科学实验并具有医用价值

（1）沉淀反应：Precipitation reaction

（2）凝集实验：haemaglutination

（3）放射免疫学方法检测免疫复合物

（4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。

（5）ELISA 等免疫学检测

（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag 或与蛋白的亲和力。

(7) 免疫印记（western blotting)

（8）免疫沉淀：

（9）亲和层析：分离蛋白质

（10）磁珠分离细胞

（11）临床疾病的诊断和治疗；

20.酶工程主要研究内容是什么？

（1）酶的分离、纯化、大批量生产及应用。

（2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。

（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶研究。

（4）酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。

（5）有机相中酶反应的研究。

（6）酶的抑制剂，激活剂的开发及应用与研究。

（7）抗体酶，核酸酶的研究。

（8）模拟酶，合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。

21.固定化酶回合固定化细胞的特点和优点各是什么？怎样制备？

固定化酶的特点和优点:

（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；

（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；

（3）稳定性显著提高；

（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；

（5）提供了研究酶动力学的良好模型。

固定化细胞的特点和优点：

1.使用固定化细胞省去了酶的分离过程，显著降低了成本。

2.固定化细胞为多酶系统，不需要辅助因子

3.增加了细胞对不利环境的耐逆性，可重复使用。

4.增加了酶的稳定性。

固定化酶制备：

（1）吸附法：

过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。

（2）包埋法：

将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。

（3）共价键结合法：

将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。

（4）交联法

使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。

固定化细胞的制备：

一种固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：a．选用甲烷利用细菌Methylomonas sp．GYJ3，在可供给微生物能量的甲烷和空气的混合气体中，辅以无机培养基进行培养；b．培养好的菌体细胞离心后用无机培养基悬浮，加入到硅酸钠溶液和盐酸溶液制成的溶

胶中，待溶胶凝固变成凝胶后，就制得了包埋的细胞，将包埋细胞置于低温环境中以增加包埋强度；

c．用磷酸盐缓冲液洗去包埋细胞的杂质，充入可给微生物提供能量的相应的甲烷与空气的混合气体，在摇床上培养48－120 小时。

22.为什么要对酶进行化学修饰？

（1）.更好的热稳定性以及抗核酸酶性对于临床应用很重要；

（2）提高酶蛋白在体内的半衰期；

（3）提高酶蛋白的靶向性；

（4）提高酶蛋白效力。

23.何谓分子印迹？分子印迹的应用范围有哪些？

分子印迹：是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程。

应用范围：

（1）用于化学仿生传感器

（2）色谱分离

（3）固相萃取

（4）天然杭体模拟

（5）模拟酶催化

（6）控缓释药物

24.有机相酶反应的定义及其优点是什么？

有机相酶反应：是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行对的催化反应。

优点是：

（1）增加疏水性底物或产物的溶解度。

（2）热力学平衡向合成方向移动。

（3）可抑制有水剂中分离纯化产物。

（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。

（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。

（6）酶的热稳定性提高，PH 的适应性扩大。

（7）无微生物污染。

（8）能测定某介质中反应时，通过改变溶剂，能够控制底物的特异性、区域选择性和立体选择性，并可以催化某些在水中不能进行的反应。

25.何谓人工模拟酶？

人工模拟酶：是指根据酶的作用机理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。

26.发酵工程的研究内容包括哪些？

发酵工程研究内容涉及：菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。

27.微生物菌种诱变使用的主要诱变剂有哪些？它们的诱变机制是什么？

(1)物理诱变剂：主要有紫外线、X 射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等。（2）化学诱变剂：金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺激素、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、染料等。

诱变机制：1、碱基的类似物诱发突变

2、改变DNA 的化学结构

3、结合到DNA 分子上诱发移码突变

4、紫外线及其他射线引起的DNA 分子的变化

28.微生物发酵主要有哪些方式？各具有什么特点？

（一）分批发酵：是将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作方式。

特点：

（1）对温度的要求低，工艺操作简单；

（2）比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；

（3）对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高

（4）人力、物力、动力消耗较大；

（5）生产周期较长

（6）生产效率低

（二）补料分批发酵：指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。特点：

(1) 可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。

(2) 可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；

(3) 菌种的变异及杂菌污染问题易控制；

(4) 便于自动化控制

(三)连续发酵：是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。

特点：

（1）设备的体积可以减小；v

（2）操作时间短，总的操作管理方便，便于自动化控制；

（3）产物稳定，人力物力节省，生产费用低

（4）对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高；

（5）营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低

（6）杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。

29.影响发酵的主要因素有哪些？如何对发酵过程进行控制？

（1）温度温度对微生物的影响是多方面的。首先，温度影响酶的活性。在最适温度

范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期缩短，产量降低。温度也能影响生物合成的途径。例如，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。此外，温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。因此，要保证正常的发酵过程，就需维持最适温度。但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。如灰色链霉菌的最适生长温度是37℃，但产生抗生

素的最适温度是28 ℃。通常，必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。

（2）pH pH 能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。此外，pH 还会影响培养基中营养物质的分解等。因此，应控制发酵液的pH。但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH 往往不同，需要分别加以控制。在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH 必然发生变化。如当尿素被分解时，发酵液中的NH+4 浓度就会上升，pH 也随之上升。在工业生产上，常采用在发酵液中添加维持pH 的缓冲系统，或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸钙来控制pH。目前，国内已研制出检测发酵过程的pH 电极，用于连续测定和记录pH 变化，并由pH 控制器调节酸、碱的加入量。

（3）溶解氧氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。从葡萄糖氧化的需氧量来看，1 mol 的葡萄糖彻底氧化分解，需6 mol 的氧；当糖用于合成代谢产物时，1 mol 葡萄糖约需1.9 mol 的氧。因此，好氧型微生物对氧的需要量是很大的，但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，然而氧很难溶于水。在101.32 kPa、25℃时，氧在水中

的溶解度为0.26 mmol/L。在同样条件下，氧在发酵液中的溶解度仅为0.20 mmol/L。而且随着温度的升高，溶解度还会下降。因此，必须向发酵液中连续补充大量的氧，经搅拌，可以提高氧在发酵液中的溶解度。

（4）泡沫在发酵过程中，通气搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有可能产生泡沫。发酵过程中产生一定数量的泡沫是正常现象，但过多的持久性泡沫对发酵是不利的。因为泡沫会占据发酵罐的容积，影响通气和搅拌的正常进行，甚至导致代谢异常，因而必须消除泡沫。常用的消泡沫措施有两类：一类是安装消泡沫挡板，通过强烈的机械振荡，促使泡沫破裂；另一类是使用消泡沫剂。

（5）营养物质的浓度发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。如在谷氨酸发酵中，NH+4 浓度的变化，会影响代谢途径(见谷氨酸发酵)。因此，在发酵过程中，也应根据具体情况进行控制。

30.如何克隆抗生素生物合成基因？

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。